CN103822986B - 一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超声提取-大孔树脂固相萃取净化-酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，采用β-D-葡萄糖苷酶直接对超声提取后用大孔树脂固相萃取净化的糖苷进行酶水解，然后利用气相色谱-质谱联用进行定性和相对定量分析，该方法准确，可靠，能准确鉴定24种糖苷和相对定量28种糖苷，适合不同类型烟草中糖苷成分的同时检测，克服了酸水解的非选择性、破坏性的水解方式，同时也有利于用商业化的标准谱库与文献中的保留指数进行物质确证。
Description
技术领域
本发明属于烟草化学分析领域，具体涉及一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法。
背景技术
糖苷类物质是潜香物质中重要的一类，是烟草在生长、发育过程中形成的次级代谢产物，主要是由单糖或双糖的还原羟基与香气物质（萜烯醇类、脂肪醇类、C13降异戊二烯类或苯丙烷类衍生物等）键合形成的稳定结合态化合物。它不仅是烟草中挥发性香气成分的重要前驱体（可以通过酶水解或燃烧裂解释放出游离态的香气成分），还具有广泛的生物学功能（如香气成分储存和运输的主要形式、保护细胞中的易损结构、清除活性自由基、抗逆及抗病虫害等作用）。
现有技术中烟草中糖苷的测定主要采用色谱-质谱联用的分析方法。目前，酸水解-气相色谱-质谱联用（AH-GC-MS）与液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术为分析的主要方法。酸水解具有前处理简单，易操作、物质鉴定简单等特点，但酸水解是一种非选择性、破坏性的水解方式，酸水解不仅水解糖苷，其它成分（如糖酯、果胶等）也能水解，从而产生一系列干扰成分，此外，酸水解能使糖苷配基产生重排、裂解、消去等副反应，不利于成分的鉴定。液相色谱-质谱联用技术对很多结构类似的糖苷未能分离，且质谱结构鉴定无商业化的标准谱库与稳定的保留指数进行确证，限制了该技术在该领域上的应用。
发明内容
本发明拟解决的技术问题如下：针对酸水解条件下对糖苷的破坏性和非选择性，同时液相色谱-质谱对糖苷的分离能力差和定性确证信息少的缺陷，设计优化超声提取-固相萃取净化-酶水解-气相色谱-质谱联用定性定量分析烟草中的糖苷成分，该方法准确，可靠，能准确鉴定24种糖苷和相对定量28种糖苷。该方法与现有方法相比，克服了酸水解的非选择性、破坏性的水解方式，同时也有利于用商业化的标准谱库与文献中的保留指数进行物质确证。此外，优化的酶水解条件，保证了该方法最大的水解程度和水解重复性，提高了方法相对定量的精密度。
本发明设计一种超声提取-固相萃取净化-酶水解-气相色谱-质谱联用定性定量分析烟草中的糖苷成分，该方法可以同时准确鉴定24种糖苷和相对定量28种糖苷，具有准确度高、重复性好等特点，适合应用于不同类型烟叶中多种糖苷类物质的同时检测。
本发明对烟草中糖苷的测定方法包含如下步骤：
（1）提取：称取一定量的烟草粉末于具塞三角瓶中，加入内标1：苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷后加入甲醇超声提取，将样品超声后取上层清液过砂芯滤斗，残留物再用甲醇超声提取一次，合并提取液，在真空、水浴条件下将甲醇浓缩至干；
（2）净化：将XAD-2大孔树脂用去离子水洗至无甲醇气味，再将XAD-2大孔树脂装成固相萃取柱，将上述（1）浓缩物用超纯水溶解后转移至大孔树脂固相萃取柱中，先用水淋洗除去糖、氨基酸等水溶性杂质，再用乙醚淋洗除去非极性杂质，最后用乙酸乙酯洗脱糖苷成分，洗脱液干燥后真空、水浴条件下将乙酸乙酯浓缩至2 mL，再用氮气吹干；
（3）酶水解糖苷：将上述（2）氮气吹干的残留物用缓冲液溶解，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取2次后，向缓冲液中加入水解酶和有机溶剂混匀后放入水浴中充分反应，反应结束后冷却至室温；
（4）糖苷水解物提取：加入内标2：4-壬醇，混匀后转移至离心管中，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取，有机相干燥后水浴常压浓缩至0.5 mL，待进样；
（5）用气相色谱-质谱对糖苷进行定性及定量分析，定性采用与标准物质、商业化的标准谱库NIST08 和Wiley08和保留指数NIST 数据库进行比对，内标1用于糖苷内标法的相对定量，内标2用于酶水解方法的优化。
其中气相色谱-质谱分析条件如下：
气相色谱柱为HP-5ms，60m×0.25mm i.d×0.25μm d.f，进样体积：2 μL，进样口温度280 ℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，恒流模式，流速为1.0 mL/min，柱温箱为程序升温，60 ℃保持1min，以2 ℃/min升至230 ℃，保持4 min；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离能70 eV，传输线温度为280 ℃，扫描模式为全扫描，质量范围45-400 amu，溶剂延迟6 min。
本发明中的 XAD-2大孔树脂玻璃柱的规格为Φ2 cm×10 cm。
本发明中的缓冲液为pH=5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，用0.2 mol/L的磷酸氢二钠和0.1 mol/L的柠檬酸溶液，将其按照体积比116:84混匀获得。。
本发明中的水解酶为β-D-葡萄糖苷酶，源于苦杏仁(>=10 units/mg)。
本发明中的酶水解过程中加入的有机溶剂为体积比为1:1的乙醚：正戊烷溶液。
本发明中的酶水解条件（反应温度、反应时间、β-D-葡萄糖苷酶量、有机溶剂体积和pH值）通过Plackett-Burman设计得到反应温度、反应时间、有机溶剂体积和pH值对酶水解的程度影响显著，进一步运用星点设计优化获取酶水解条件的确定值，结果表明当温度为36.8 ℃，溶剂2.1 mL，时间为60 h，pH值为5.6和酶量为1 mg/mL时，酶水解程度最大。
本发明所达到的有益效果：本发明方法准确，可靠，能同时准确鉴定24种糖苷和相对定量28种糖苷。该方法与现有方法相比，克服了酸水解的非选择性、破坏性的水解方式，同时也有利于用商业化的标准谱库与文献中的保留指数进行物质确证。此外，优化的酶水解条件，保证了该方法最大的水解程度和水解重复性，提高了方法相对定量的精密度。
本发明通过利用优化的前处理及色谱条件，5天内重复测定5次来计算方法的精密度(表1)，相对定量的28种糖苷类物质重复性较好，日间相对标准偏差大于15%只有4和28号物质，大于10%有2、3、11、23、24和26号物质，其它物质的日间相对标准偏差均低于10%，结果表明方法具有较好的稳定性和重复性。
附图说明
图1：本发明中糖苷类物质酶水解机理方程式；
图2：本发明中糖苷类物质空白烤烟样品（未加酶）的GC-EI-MS色谱图。
图3：本发明中糖苷类物质烤烟样品酶水解的GC-EI-MS色谱图。
图4：本发明中糖苷类物质晒烟样品酶水解的GC-EI-MS色谱图。
图5：本发明中糖苷类物质香料烟样品酶水解的GC-EI-MS色谱图。
具体实施方式：
通过以下实例对上述发明进一步进行描述，但并不限制本发明。
实施例1
本发明酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，测定方法包括如下步骤：
（1）提取：准确称取4.0000 g烟草粉末于具塞三角瓶中，加入250 μg 苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷内标1，同时加入40 mL甲醇超声提取30 min（100 Hz 常温），超声结束后静置15 min取上层清液过滤，残留物再加入40 mL甲醇超声提取30 min（100 Hz 常温），超声结束后合并滤液，在旋转浓缩仪中将甲醇浓缩至2 mL；
（2）净化：用去离子水25 mL溶解混匀后，将其转移至XAD-2大孔树脂玻璃柱中，吸附后的糖苷物质首先用50 mL水淋洗除水溶性糖、氨基酸等物质（流速控制在1-2 mL/min），再用60 mL的乙醚淋洗除游离态香气成分等非极性物质，最后用100 mL乙酸乙酯洗脱糖苷，乙酸乙酯经过无水硫酸钠干燥后，旋转浓缩仪中浓缩至2 mL，再用氮气将其吹干，得到糖苷提取物；
（3）酶水解糖苷：用30 mL pH=5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将糖苷提取物溶解并混匀，用20 mL乙醚：正戊烷（V/V 1:1）萃取2次，除去痕量的游离态香气物质，将其等量（各15 mL）放入2个20 mL顶空瓶中，一份为空白（未加酶），另一份加入15 mg β-D-葡萄糖苷酶，混匀后加入2.1 mL乙醚：正戊烷（V/V 1:1），放入36.8 ℃水浴中反应60 h，反应结束后冷却至室温
（4）糖苷水解物提取：加入63.5 μg 4-壬醇内标2，混匀后转移至离心管中再分别加入20 mL乙醚：正戊烷（V/V 1:1）萃取4次，将合并的乙醚：正戊烷（V/V 1:1）用无水硫酸钠干燥后浓缩至0.5 mL，涡旋混匀转移至0.25mL微量色谱瓶中进样。
（5）用气相色谱-质谱对糖苷进行定性及定量分析，定性采用与标准物质、商业化的标准谱库NIST08 和Wiley08和保留指数NIST 数据库进行比对，数据见表（1），其中气相色谱-质谱分析条件如下：
气相色谱柱为HP-5ms，60m×0.25mm i.d×0.25μm d.f，进样体积：2 μL，进样口温度280 ℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，恒流模式，流速为1.0 mL/min，柱温箱为程序升温，60 ℃保持1min，以2 ℃/min升至230 ℃，保持4 min；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离能70 eV，传输线温度为280 ℃，扫描模式为全扫描，质量范围45-400 amu，溶剂延迟6 min。
A: 用标准品的质谱数据、保留指数确证；B：用NIST08 或Wiley08谱库、文献保留指数确证；C：未鉴定物质
实施例2
采用本发明实例1的方法分别对烤烟、晒烟和香料烟进行酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草糖苷。三种类型烟草的品种分别为K326、肯那和巴斯玛，部位均为中部叶，所有烟叶都未进行过复烤和醇化处理，相对定量测定色谱图及糖苷含量如图2～5和表2所示。
Claims (6)
1.一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：测定方法包括如下步骤：
（1）提取：称取一定量的烟草粉末于具塞三角瓶中，加入内标1：苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷后加入甲醇超声提取，将样品超声后取上层清液过砂芯滤斗，残留物再用甲醇超声提取一次，合并提取液，在真空、水浴条件下将甲醇浓缩至干；
（2）净化：将XAD-2大孔树脂用去离子水洗至无甲醇气味，再将XAD-2大孔树脂装成固相萃取柱，将上述（1）浓缩物用超纯水溶解后转移至大孔树脂固相萃取柱中，先用水淋洗，再用乙醚淋洗，最后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液干燥后真空、水浴条件下将乙酸乙酯浓缩至2 mL，再用氮气吹干；
（3）酶水解糖苷：将上述（2）氮气吹干的残留物用缓冲液溶解，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取2次后，向缓冲液中加入水解酶和有机溶剂混匀后放入水浴中充分反应，反应结束后冷却至室温；
（4）糖苷水解物提取：加入内标2：4-壬醇，混匀后转移至离心管中，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取，有机相干燥后水浴常压浓缩至0.5 mL，待进样；
（5）用气相色谱-质谱对糖苷进行定性及定量分析，定性采用与标准物质、商业化的标准谱库NIST08 和Wiley08和保留指数NIST 数据库进行比对，其中气相色谱-质谱分析条件如下：
气相色谱柱为HP-5ms，60m×0.25mm i.d×0.25μm d.f，进样体积：2 μL，进样口温度280 ℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，恒流模式，流速为1.0 mL/min，柱温箱为程序升温，60 ℃保持1min，以2 ℃/min升至230 ℃，保持4 min；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离能70 eV，传输线温度为280 ℃，扫描模式为全扫描，质量范围45-400 amu，溶剂延迟6 min。
2.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于： XAD-2大孔树脂玻璃柱的规格为Φ2 cm×10 cm。
3.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：缓冲液为pH=5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
4.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：水解酶为β-D-葡萄糖苷酶，>=10 units/mg。
5.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：酶水解过程中加入的有机溶剂为体积比为1:1的乙醚：正戊烷溶液。
6.如权利要求书1所述的一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：酶水解条件为温度为36.8 ℃，溶剂2.1 mL，时间为60 h，pH值为5.6和酶量为1 mg/mL。
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