CN107831258A - 一种基于气相色谱‑串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于气相色谱‑串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，所述的定量分析方法包括以下步骤：1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末，然后进行离心冷冻干燥，取出冻干样品，加入吡啶和MSTFA，涡旋混合，恒温静置硅烷化30 min，得到衍生后的待测样品，转至气相色谱‑串联质谱仪进行分析；2）标准曲线绘制；3）样品分析：将步骤（1）处理后的待测样品进行气相色谱‑串联质谱分析，得到待测样品中马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰面积，输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。本发明通过创造性的检测烟叶中马来酰肼自由态及马来酰肼糖苷结合态的含量，极大的提高了分析结果的准确性，方法简便、效率高。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于气相色谱-串联质谱技术的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法。
背景技术
马来酰肼（1，2-二氢-3，6-哒嗪二酮，Maleic Hydrazide，MH)是一种人工合成的植物生长调节剂。马来酰肼通过阻止细胞分裂而抑制烟草侧芽的生长，是国内外烟草行业常用的抑芽剂。马来酰肼作为常见农药在烟草种植上大量使用，其在烟叶中的残留也一直备受关注。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）2013年颁布的烤后烟叶马来酰肼的指导残留水平（GRL）为80 mg/kg。因此建立一种简单、快速分析烟叶中马来酰肼残留物的方法对于保障烟叶安全、杜绝马来酰肼抑芽剂的滥用具有重要意义。
马来酰肼在烟叶中主要以自由态及糖苷结合态存在。其中糖苷结合态马来酰肼包括马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷。文献报道的烟叶中马来酰肼测定方法包括分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、液相色谱质谱法等。这些方法包含只测自由态马来酰肼和将马来酰肼糖苷水解后测定其总量两种类型。其中只测自由态马来酰肼无法反映马来酰肼的真实残留量，而将马来酰肼糖苷水解后测定其总量的方法由于无法对两种糖苷物质是否彻底水解进行评价，其测定准确性也值得商榷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法。
本发明的目的是这样实现的，包括以下步骤：
1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末，当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100 mg；当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg； 然后进行离心冷冻干燥0.5~1.5 h，取出冻干样品，加入200±100 μL 吡啶和80±40μLMSTFA，涡旋混合30 s，37℃恒温静置硅烷化30 min，得到衍生后的待测样品，转至气相色谱-串联质谱仪进行分析；
2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、60、80、100、200、300 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，然后将待测样本分别进行步骤（1）中所述的离心冷冻干燥和萃取衍生处理，再转至气相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积，将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；
3）样品分析：将步骤（1）处理后的待测样品进行气相色谱-串联质谱分析，得到待测样品中马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰面积，输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明建立了一种基于气相色谱-串联质谱的烟叶中马来酰肼及其糖苷的分析方法，通过创造性的检测烟叶中马来酰肼自由态及马来酰肼糖苷结合态的含量，极大的提高了分析结果的准确性，有效避免了现有技术中仅测自由态马来酰肼或者将马来酰肼糖苷水解后测定总量带来的不确定性，而且本发明的分析方法简便、效率高。
2、本发明集中了气相色谱和串联质谱的高分离能力和高灵敏度的优点，整个分析过程简单、快速，为定量分析烟叶中马来酰肼及其代谢物提供了一种新的途径。
3、本发明的样品前处理与现有的前处理方法相比，具有以下优点：
第一，处理方法简单，一步完成萃取和衍生。现在的行业标准方法（YC/T 405.5-2011）要先进行浓盐酸水解，然后定容、固相萃取纯化、过滤等步骤，十分复杂。
第二，更科学。YC/T 405.5-2011无法对糖苷的水解情况进行评价。本方法直接测糖苷，避免了这个问题。
第三，环境更友好。无需使用浓盐酸、氢氧化钠等水解所需的强酸强碱，不会对操作人员产生潜在的危害。
第四，避免基质效应影响。本方法的标准曲线在基质中配制，有效的扣除了基质对定量的影响。而YC/T 405.5-2011的标准曲线在空白溶剂中配制，无法扣除基质的影响。
4、本发明的气相色谱-串联质谱的分析方法相对现有行标的分析方法的优点：第一，特异性更好。本方法采用气相色谱串联质谱，相对行标YC/T 405.5-2011的液相色谱接紫外检测器方法对马来酰肼及糖苷具有更好的分离能力，可有效的避免基质干扰
第二，灵敏度更高。本方法采用气相色谱和串联质谱将基质与目标化合物进行了有效的分离，且串联质谱本身具有比紫外检测器更高的灵敏度，因此具有更高的分析灵敏度。
第三，测定的指标更多。行标YC/T 405.5-2011只能测定马来酰肼一个指标，本方法可以同时测定马来酰肼以及它的糖苷。
5、由于马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷与马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷互为位置异构体，化学结构相似，在本发明的方法中具有一致的质谱离子，因此当实际工作中无法获得足够的马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的标准物质时，可以采用马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的校准曲线对马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷进行定量。
附图说明
图1 马来酰肼及其糖苷的化学结构图；
图2 马来酰肼及其糖苷在烟叶样品中的MRM色谱图，其中烟叶样品为200 mg/株马来酰肼喷洒后第三周采样；
图3 马来酰肼及其糖苷在不同时期的含量变化。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，包括以下步骤：
1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末，当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100 mg；当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg； 然后进行离心冷冻干燥0.5~1.5 h，取出冻干样品，加入200±100 μL 吡啶和80±40μLMSTFA，涡旋混合30 s，37℃恒温静置硅烷化30 min，得到衍生后的待测样品，转至气相色谱-串联质谱仪进行分析；
2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、60、80、100、200、300 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，然后将待测样本分别进行步骤（1）中所述的离心冷冻干燥和萃取衍生处理，再转至气相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积，将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；
3）样品分析：将步骤（1）处理后的待测样品进行气相色谱-串联质谱分析，得到待测样品中马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰面积，输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。
所述的新鲜烟叶样品粉末的制备方法为：将新鲜的烟叶样品在液氮冷冻下研磨粉碎至小于40目，磨好样品迅速转入离心管封存于-80 ℃冰箱，备用。
所述的烤后烟叶样品粉末的制备方法为：将烤后烟叶样品研磨粉碎至小于40目，磨好样品转入离心管封存于1~4 ℃冰箱，备用。
步骤（1）中所述的离心冷冻干燥的真空度为0.2±0.1 mbar，温度为-4±1℃，离心机转速：500±100 rpm。
步骤（1）中所述的吡啶的加入量为200μL，MSTFA 的加入量为80μL。
步骤（2）中所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼、马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷及马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液或马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液中的任一种。
所述的气相色谱-串联质谱的色谱分析条件为：色谱柱为DB-5MS (30 m × 0.25mm × 0.25μm)，程序升温条件为从80℃开始，以5 ℃/min 升至150 ℃，再以20℃/min 升至240 ℃，保持7 min，然后以20℃/min 升至280 ℃，保持8 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量，1.1 mL/min；分流比为20:1。
所述的气相色谱-串联质谱的质谱分析条件为：传输线温度为260 ℃；离子源温度230 ℃；溶剂延迟时间为11.5min；多反应离子检测条件为：
实施例1
实验试剂及装置
甲醇（色谱级）购买于Merck公司，马来酰肼及硅烷化试剂MSTFA购于Sigma公司（北京），马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷采用Newsome方法（Newsome W H, J. Agri. Food Chem. 1980,28, 270-272.）自己合成。氧化银、硫酸钙、2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃葡萄糖溴化物、二氯甲烷、硅酸、甲醇钠等（用于合成马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷）购于北京百灵威公司。
Bruker 450气相色谱仪配Bruker 300三重四级杆质谱（布鲁克道尔顿公司，美国）；DB-5 MS 毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）(Agilent公司，美国)；MILLI-Q纯水机（MILLIPORE公司，美国）；LD5-2A离心机（北京京立离心机有限公司）；CP2245分析天平（感量0.0001g，Sartorious公司，德国）。CHRIST ALPHA 1-2 LD冻干机(Martin Christ公司，德国) 。
1 样品前处理
新鲜烟叶样品（粉末）制备：将新鲜的烟叶样品放入研钵（或低温自动研磨仪），加液氮冷冻，研磨粉碎（小于40目）。磨好样品迅速转入离心管封存于-80 ℃冰箱。
烤后烟叶样品（粉末）制备：将烤后烟叶样品放入研钵，研磨粉碎（小于40目）。磨好样品转入离心管封存于4 ℃冰箱。
新鲜烟叶样品提取及衍生化：准确称取100 mg的液氮下粉碎新鲜烟末于1.5 mL离心管，将称好的样品放入冻干机离心冷冻干燥器（真空度0.18 mbar，温度-4℃，离心机转速500 rpm），冻干1 h，取出冻干样品，加入200 uL 吡啶和80 uL MSTFA，涡旋混合30 s，37℃恒温静置硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱-串联质谱仪分析，进样量 1 μL。
烤后烟叶样品提取及衍生化：准确称取10 mg的烤后烟叶粉末于1.5 mL离心管，将称好的样品放入冻干机离心冷冻干燥器（真空度0.18 mbar，温度-4℃，离心机转速 500rpm），冻干1 h，取出冻干样品，加入200 uL 吡啶和80 uL MSTFA，涡旋混合30 s，37℃恒温静置硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱-串联质谱仪分析，进样量 1 μL。
2色谱质谱分析条件
色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，程序升温条件为从80℃开始，以5 ℃/min 升至150 ℃，再以20℃/min 升至240 ℃，保持7 min，然后以20℃/min 升至280 ℃，保持8 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量，1.1 mL/min；分流比为20:1。
质谱分析条件：传输线温度为260 ℃；离子源温度230 ℃；溶剂延迟时间为11.5min；多反应离子检测（MRM）条件见表1，
表1 马来酰肼及其糖苷的定量分析离子对、碰撞能及色谱保留参数。
3、标准曲线定量
以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷混合标准溶液。分别移取5、10、20、40、60、80、100、200和300 μL 标准混合溶液至1.5 mL离心管，再分别称取10 mg烤后烟叶样品粉末（不含马来酰肼及其糖苷）至离心管作为样品基质，制成5、10、20、40、60、80、100、200和300 mg/kg 浓度梯度的待测样本。将制好的样本按照“样品前处理”和“色谱质谱分析条件”部分所述方法进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积。将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线拟合方程和线性相关系数。
将得到的实际样品中的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。由于马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷与马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷互为位置异构体，化学结构相似，具有接近的色谱保留时间和几乎一致的质谱谱图以及相同的MRM定量离子和碰撞能量，本方法采用马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的校准曲线对马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷进行定量。
——马来酰肼处理烟草不同时期马来酰肼及其糖苷残留情况研究
实验材料：移栽后2个月的烤烟（云烟87）。每株喷洒200 mg马来酰肼（水溶液，添加3%的三乙醇胺）。喷洒后0、7、14、21、28天分别采样进行分析。其中0天采样为喷洒后直接采样。样品制备按照“样品前处理”部分所描述方法进行。
实验方法：马来酰肼的提取及衍生化：准确称取100 mg的液氮下粉碎新鲜烟叶样品粉末于1.5 mL离心管，将称好的样品放入冻干机离心冷冻干燥器（真空度0.18 mbar，温度-4℃，离心机转速 500 rpm），冻干2 h，取出冻干样品，加入200 uL 吡啶和80 uL MSTFA，涡旋混合30 s，37℃恒温静置硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱-串联质谱仪分析，进样量 1 μL。
色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，程序升温条件为从80℃开始，以5 ℃/min 升至150 ℃，再以20℃/min 升至240 ℃，保持7 min，然后以20℃/min 升至280 ℃，保持8 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量，1.1 mL/min；分流比为20:1。
质谱分析条件：传输线温度为260 ℃；离子源温度230 ℃；溶剂延迟时间为11.5min； MRM条件见表1。马来酰肼及其糖苷的色谱质谱分离图见图2。
标准曲线定量：以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷混合标准溶液。分别移取5、10、20、40、60、80、100、200和300 μL 标准混合溶液至1.5mL离心管，再分别称取10 mg烤后烟叶样品粉末（不含马来酰肼及其糖苷）至离心管作为样品基质，制成5、10、20、40、60、80、100、200和300 mg/kg 浓度梯度的待测样本。将制好的样本按照“样品前处理”和“色谱质谱分析条件”部分所述方法进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积。将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到马来酰肼的校准曲线方程为：y =327412x + 896873，r 2 =0.9990，马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的校准曲线方程为：y = 199123x + 29700，r 2 =0.9989。
将得到的实际样品中的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰面积输入校准曲线方程，即可计算得到相对应的物质浓度。其中马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷采用马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的标准曲线进行定量。得到马来酰肼及其糖苷在不同时期的含量变化如图3。从图3可以看出喷洒了马来酰肼的烟草中从第一周开始其马来酰肼的含量持续下降，而马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的含量则持续上升。马来酰肼和其糖苷的绝对量变化看，以喷洒后第三周为例，此时烟叶中马来酰肼的浓度已由刚喷洒时的324 mg/kg（干重）降至52 mg/kg，而马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的浓度却只有21.47和3.09 mg/kg，可见还有大量马来酰肼代谢成其它物质或通过根、叶面等器官发生了流失。
试验例1
本发明的校准曲线的线性相关系数（r2）均在0.99 以上，而且通过表2可知，本发明的方法完全能够满足对于烟叶中马来酰肼及其糖苷的定量分析要求，通过表3和表4可知，本发明的准确性高，重复性好。
表 2 马来酰肼和马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的检测限和定量限
表 3 马来酰肼和马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的回收率
注：低、中、高分别代表添加浓度为10、40、80 mg/kg。
表 4 马来酰肼和马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的重复性
注：重复性实验定在添加量为40 mg/kg时测定。
实施例2
一种基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，包括以下步骤：
1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末，所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末，称取量为100 mg；然后进行离心冷冻干燥0.5 h（真空度为0.1 mbar，温度为-3℃，离心机转速：400 rpm），取出冻干样品，加入100 μL 吡啶和40μL MSTFA，涡旋混合30 s，37℃恒温静置硅烷化30 min，得到衍生后的待测样品，转至气相色谱-串联质谱仪进行分析；
所述的新鲜烟叶样品粉末的制备方法为：将新鲜的烟叶样品在液氮冷冻下研磨粉碎至30目，磨好样品迅速转入离心管封存于-80 ℃冰箱，备用；
2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、60、80、100、200、300 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，然后将待测样本分别进行步骤（1）中所述的离心冷冻干燥和萃取衍生处理，再转至气相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积，将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；
所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼、马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷及马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液；
3）样品分析：将步骤（1）处理后的待测样品进行气相色谱-串联质谱分析，得到待测样品中马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰面积，输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。
所述的气相色谱-串联质谱的色谱分析条件为：色谱柱为DB-5MS (30 m × 0.25mm × 0.25μm)，程序升温条件为从80℃开始，以5 ℃/min 升至150 ℃，再以20℃/min 升至240 ℃，保持7 min，然后以20℃/min 升至280 ℃，保持8 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量，1.1 mL/min；分流比为20:1；
所述的气相色谱-串联质谱的质谱分析条件为：传输线温度为260 ℃；离子源温度230℃；溶剂延迟时间为11.5min；多反应离子检测条件见表1。
实施例3
一种基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，包括以下步骤：
1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末，所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末，称取量为10 mg； 然后进行离心冷冻干燥1.5 h（真空度为0.3mbar，温度为-5℃，离心机转速：600 rpm），取出冻干样品，加入300 μL 吡啶和120μL MSTFA，涡旋混合30 s，37℃恒温静置硅烷化30 min，得到衍生后的待测样品，转至气相色谱-串联质谱仪进行分析；
所述的烤后烟叶样品粉末的制备方法为：将烤后烟叶样品研磨粉碎至30目，磨好样品转入离心管封存于4 ℃冰箱，备用；
2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、60、80、100、200、300 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，然后将待测样本分别进行步骤（1）中所述的离心冷冻干燥和萃取衍生处理，再转至气相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积，将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；
所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液；
3）样品分析：将步骤（1）处理后的待测样品进行气相色谱-串联质谱分析，得到待测样品中马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰面积，输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。
所述的气相色谱-串联质谱的色谱分析条件为：色谱柱为DB-5MS (30 m × 0.25mm × 0.25μm)，程序升温条件为从80℃开始，以5 ℃/min 升至150 ℃，再以20℃/min 升至240 ℃，保持7 min，然后以20℃/min 升至280 ℃，保持8 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量，1.1 mL/min；分流比为20:1；
所述的气相色谱-串联质谱的质谱分析条件为：传输线温度为260 ℃；离子源温度230℃；溶剂延迟时间为11.5min；多反应离子检测条件见表1。
Claims (8)
1.一种基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末，当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100 mg；当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg； 然后进行离心冷冻干燥0.5~1.5 h，取出冻干样品，加入200±100 μL 吡啶和80±40μLMSTFA，涡旋混合30 s，37℃恒温静置硅烷化30 min，得到衍生后的待测样品，转至气相色谱-串联质谱仪进行分析；
2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、60、80、100、200、300 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，然后将待测样本分别进行步骤（1）中所述的离心冷冻干燥和萃取衍生处理，再转至气相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱峰面积，将得到的峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；
3）样品分析：将步骤（1）处理后的待测样品进行气相色谱-串联质谱分析，得到待测样品中马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰面积，输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。
2.根据权利要求1所述的基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的新鲜烟叶样品粉末的制备方法为：将新鲜的烟叶样品在液氮冷冻下研磨粉碎至小于40目，磨好样品迅速转入离心管封存于-80 ℃冰箱，备用。
3.根据权利要求1所述的基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的烤后烟叶样品粉末的制备方法为：将烤后烟叶样品研磨粉碎至小于40目，磨好样品转入离心管封存于1~4 ℃冰箱，备用。
4.根据权利要求1所述的基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（1）中所述的离心冷冻干燥的真空度为0.2±0.1 mbar，温度为-4±1℃，离心机转速：500±100 rpm。
5.根据权利要求1所述的基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（1）中所述的吡啶的加入量为200μL，MSTFA 的加入量为80μL。
6.根据权利要求1所述的基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（2）中所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼、马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷及马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液或马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液中的任一种。
7.根据权利要求1所述的基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的气相色谱-串联质谱的色谱分析条件为：色谱柱为DB-5MS (30 m× 0.25 mm × 0.25μm)，程序升温条件为从80℃开始，以5 ℃/min 升至150 ℃，再以20℃/min 升至240 ℃，保持7 min，然后以20℃/min 升至280 ℃，保持8 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量，1.1 mL/min；分流比为20:1。
8.根据权利要求1所述的基于气相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的气相色谱-串联质谱的质谱分析条件为：传输线温度为260 ℃；离子源温度230 ℃；溶剂延迟时间为11.5min；多反应离子检测条件为：
。
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