CN107589206A - 一种基于液相色谱‑串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于液相色谱‑串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，所述的定量分析方法以下步骤：1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；2）标准曲线绘制；3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱‑串联质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。本发明通过创造性的检测烟叶中马来酰肼自由态及马来酰肼糖苷结合态的含量，极大的提高了分析结果的准确性，方法简便、效率高。

Description

一种基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定 量分析方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于液相色谱串联质谱技术的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法。

背景技术

马来酰肼（1，2-二氢-3，6-哒嗪二酮，Maleic Hydrazide，MH)是一种人工合成的植物生长调节剂。马来酰肼通过阻止细胞分裂而抑制烟草侧芽的生长，是国内外烟草行业常用的抑芽剂。马来酰肼作为常见农药在烟草种植上大量使用，其在烟叶中的残留也一直备受关注。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）2013年颁布的烤后烟叶马来酰肼的指导残留水平（GRL）为80 mg/kg。因此建立一种简单、快速分析烟叶中马来酰肼残留物的方法对于保障烟叶安全、杜绝马来酰肼抑芽剂的滥用具有重要意义。

马来酰肼在烟叶中主要以自由态及糖苷结合态存在。其中糖苷结合态马来酰肼包括马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷和马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷。文献报道的烟叶中马来酰肼测定方法包括分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、液相色谱质谱法等。这些方法包含只测自由态马来酰肼和将马来酰肼糖苷水解后测定其总量两种类型。其中只测自由态马来酰肼无法反映马来酰肼的真实残留量，而将马来酰肼糖苷水解后测定其总量的方法由于无法对两种糖苷物质是否彻底水解进行评价，其测定准确性也值得商榷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法。

本发明的目的是这样实现的，包括以下步骤：

1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇：甲基叔丁基醚：水的体积比为30~40：40~50：65~75，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；所述的内标溶液为100 ng/mL的磷酸三苯酯的乙腈溶液；

2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、80、150 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；

3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明建立了一种基于液相色谱-串联质谱的烟叶中马来酰肼及其糖苷的分析方法，通过创造性的检测烟叶中马来酰肼自由态及马来酰肼糖苷结合态的含量，极大的提高了分析结果的准确性，有效避免了现有技术中仅测自由态马来酰肼或者将马来酰肼糖苷水解后测定总量带来的不确定性，而且本发明的分析方法简便、效率高。

2、该方法集中了液相色谱和串联质谱的高分离能力和高灵敏度的优点，整个分析过程简单、快速，为定量分析烟叶中马来酰肼及其代谢物提供了一种新的途径。

3、本发明的样品前处理与现有的前处理方法相比，具有以下优点：

第一，处理方法简单，只需要萃取、冻干、复溶等步骤即可。现在的行业标准方法（YC/T405.5-2011）要先进行浓盐酸水解，然后定容、固相萃取纯化、过滤等步骤，十分复杂。

第二，更科学。YC/T 405.5-2011无法对糖苷的水解情况进行评价，本方法直接测糖苷，避免了这个问题。

第三，环境更友好。无需使用浓盐酸、氢氧化钠等水解所需的强酸强碱，不会对操作人员产生潜在的危害。

第四，避免基质效应影响。本方法的标准曲线在基质中配制，有效的扣除了基质对定量分析的影响。而YC/T 405.5-2011的标准曲线在空白溶剂中配制，无法扣除基质的影响。

第五，本发明的采用甲醇、甲基叔丁基醚、水的混合溶液作为提取剂，通过合理的配比，萃取完成后溶液离心会自然分层，脂类、色素等弱极性物质在上层，马来酰肼及其糖苷等极性较强物质在下层，液液萃取的过程在离心时自然完成，因此无需额外的样品纯化步骤。

4、本发明的液相色谱-串联质谱的分析方法相对现有行标的分析方法的优点：第一，特异性更好。本方法采用液相色谱串联质谱，相对行标YC/T 405.5-2011的液相色谱接紫外检测器方法对马来酰肼及糖苷具有更好的分离能力，可有效的避免基质干扰。

第二，灵敏度更高。本方法采用液相色谱串联质将基质与目标化合物进行了有效的分离，且质谱本身具有比紫外检测器更高的灵敏度，因此具有更高的分析灵敏度。

第三，测定的指标更多。行标YC/T 405.5-2011只能测定马来酰肼一个指标，本方法可以同时测定马来酰肼以及它的糖苷。

5、由于马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷与马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷互为位置异构体，化学结构相似，在本发明的方法中具有一致的质谱离子，因此当实际工作中无法获得马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的标准物质时，可以采用马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的校准曲线对马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷进行定量。

附图说明

图1为马来酰肼及其糖苷的化学结构图；

图2为马来酰肼及其糖苷在烟叶样品中的提取离子色谱图，烟叶样品为100 mg/株马来酰肼喷洒后第30天采样；

图3为马来酰肼处理烟草一个月后马来酰肼及其糖苷残留情况。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，包括以下步骤：

1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇：甲基叔丁基醚：水的体积比为30~40：40~50：65~75，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；所述的内标溶液为100 ng/mL的磷酸三苯酯的乙腈溶液；

2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、80、150 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；

3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。

所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末，每100 mg新鲜烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的新鲜烟叶样品粉末的制备方法为：将新鲜的烟叶样品在液氮冷冻下研磨粉碎至小于40目，磨好样品迅速转入离心管封存于-80 ℃冰箱，备用。

所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末，每10 mg烤后烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的烤后烟叶样品粉末的制备方法为：将烤后烟叶样品研磨粉碎至小于40目，磨好样品转入离心管封存于4 ℃冰箱，备用。

步骤（1）中所述的甲醇-甲基叔丁基醚-水的体积比为37:45:68。

步骤（1）中所述的超声的时间为25~35 min，离心的时间为3~7 min，离心力≥5000g。

步骤（1）中所述的加入的内标溶液与下层清液的体积比为1:60。

步骤（2）中所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼、马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷及马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液或马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液中的任一种。

所述的色谱分析条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC@BEH HILIC (100 mm ×2.1 mm × 1.7μm)，A相洗脱溶剂为0.2%甲酸的水溶液，B相洗脱溶剂为0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件为2% A相保持1.00 min，1.00-4.30 min A相比例升至12%，4.30-4.31min A相比例升至50%，4.31-6.00 min，A相比例保持为50%，6.00-6.01min A相比例变为2%，6.01-7.00 min A相比例保持为2%。流动相流速为0.3 mL/min；柱温23 ℃。进样量5 μL。

所述的质谱条件为采用正离子模式多反应离子检测模式（MRM）采集数据，离子源条件采用分段设计，具体如下：

液相保留时间0-3.2 min：喷雾电压4000 V；气帘气25 psi；碰撞气9 psi；温度700℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体2，90 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V；

液相保留时间3.2-7.0 min：喷雾电压5500 V；气帘气25 psi；碰撞气5 psi；温度250℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体1，60 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V。

实施例1

实验试剂及装置

甲醇（色谱级）购买于Merck公司，马来酰肼及硅烷化试剂MSTFA购于Sigma公司（北京），马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷采用Newsome方法（Newsome W H, J. Agri. Food Chem. 1980,28, 270-272.）自己合成。氧化银、硫酸钙、2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃葡萄糖溴化物、二氯甲烷、硅酸、甲醇钠等（用于合成马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷）购于北京百灵威公司。

Waters ACQUITY UPLC液相色谱仪配AB SCIEX Triple Quad™ 5500 三重四级杆质谱（AB SCIEX公司，美国）； DB-5 MS 毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）(Agilent公司，美国)；MILLI-Q纯水机（MILLIPORE公司，美国）；LD5-2A离心机（北京京立离心机有限公司）；CP2245分析天平（感量0.0001g，Sartorious公司，德国）。CHRIST ALPHA 1-2 LD 冻干机(Martin Christ公司，德国) 。

1样品前处理

新鲜烟叶样品（粉末）制备：将新鲜的烟叶样品放入研钵（或低温自动研磨仪），加液氮冷冻，研磨粉碎（小于40目）。磨好样品迅速转入离心管封存于-80 ℃冰箱。

烤后烟叶样品（粉末）制备：将烤后烟叶样品放入研钵（或常温自动研磨仪），研磨粉碎（小于40目）。磨好样品转入离心管封存于4 ℃冰箱。

烟叶样品前处理：准确称取100 mg的液氮下粉碎新鲜烟叶样品粉末（或10 mg烤后烟叶样品粉末）于1.5 mL离心管，依次加入370 μL甲醇、450 μL 甲基叔丁基醚、680 μL水，超声30 min，离心（离心力≥5000g）5 min，取下层清液600 μL，加入50 μL内标溶液(磷酸三苯酯，100 ng/mL，溶于乙腈 )离心浓缩（真空度0.18 mbar）2小时去掉溶剂，加入200 μL乙腈复溶，复溶液转入带内衬的液相色谱进样小瓶，待分析。

2 色谱质谱分析条件

色谱分析条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC@BEH HILIC (100 mm × 2.1 mm ×1.7 μm)。A相洗脱溶剂为0.2%甲酸的水溶液，B相洗脱溶剂为0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件为2% A相保持1.00 min，1.00-4.30 min A相比例升至12%，4.30-4.31 min A相比例升至50%，4.31-6.00 min，A相比例保持为50%，6.00-6.01min A相比例变为2%，6.01-7.00min A相比例保持为2%；流动相流速为0.3 mL/min；柱温23 ℃，进样量5 μL。

质谱分析条件：正离子模式多反应离子检测模式（MRM）采集数据。离子源条件采用分段设计，具体如下：

液相保留时间0-3.2 min：喷雾电压4000 V；气帘气25 psi；碰撞气9 psi；温度700℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体1，90 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V。

液相保留时间3.2-7.0 min：喷雾电压5500 V；气帘气25 psi；碰撞气5 psi；温度250℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体2，60 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V。

马来酰肼、马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷、马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷和内标（磷酸三苯酯）的色谱质谱条件如表1，

表 1 马来酰肼及其糖苷分析的色谱质谱分析条件

3、标准曲线定量

以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷混合标准溶液。分别移取5、10、20、40、80、150 μL 标准混合溶液至1.5 mL离心管，再分别称取10 mg 烤后烟叶样品粉末（不含马来酰肼及其糖苷）至离心管作为样品基质，制成5、10、20、40、80、150 mg/kg 浓度梯度的待测样本。离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂。将制好的样本按照“样品前处理”和“色谱质谱分析条件”部分所述方法进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱（相对内标）峰面积。将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线拟合方程和线性相关系数。

将得到的实际样品中的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。由于无法获得足够量马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的标准物质用于配制标准曲线，且马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷与马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷互为位置异构体，化学结构相似，本方法中具有一致的质谱离子，本方法采用马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的校准曲线对马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷进行定量。

——马来酰肼处理烟草的马来酰肼及其糖苷残留情况研究

实验材料：移栽后2个月的烤烟（云烟87）。每株喷洒100 mg马来酰肼（水溶液，添加3%的三乙醇胺）。喷洒后一个月采样进行分析。

样品制备按照“样品前处理”部分所描述方法进行。

实验方法：

马来酰肼及其糖苷的提取：准确称取100 mg的液氮下粉碎新鲜烟末（或10 mg烤后烟叶粉末）于1.5 mL离心管，依次加入370 μL甲醇、450 μL 甲基叔丁基醚、680 μL水，超声30min，离心（离心力≥5000g）5 min，取下层清液600 μL，加入50 μL内标溶液(磷酸三苯酯，100 ng/mL，溶于乙腈 )离心浓缩（真空度0.18 mbar）2小时去掉溶剂，加入200 μL乙腈复溶，复溶液转入带内衬的液相色谱进样小瓶，待分析。

色谱分析条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC@BEH HILIC (100 mm × 2.1 mm× 1.7 μm)。A相洗脱溶剂为0.2%甲酸的水溶液，B相洗脱溶剂为0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件为2% A相保持1.00 min，1.00-4.30 min A相比例升至12%，4.30-4.31 min A相比例升至50%，4.31-6.00 min，A相比例保持为50%，6.00-6.01min A相比例变为2%，6.01-7.00min A相比例保持为2%。流动相流速为0.3 mL/min；柱温23 ℃。进样量5 μL

质谱分析条件：离子采集模式，正离子模式。离子源具体条件如下

液相保留时间0-3.2 min：喷雾电压4000 V；气帘气25 psi；碰撞气9 psi；温度700℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体2，90 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V。

液相保留时间3.2-7.0 min：喷雾电压5500 V；气帘气25 psi；碰撞气5 psi；温度250℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体2，60 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V。

马来酰肼、马来酰肼-β-D-葡萄糖苷和内标（磷酸三苯酯）的色谱质谱条件如表1。马来酰肼及其糖苷的色谱质谱图见图2。

标准曲线定量：以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷混合标准溶液。 分别移取5、10、20、40、80、150 mg/kg标准混合溶液至1.5 mL离心管，再分别称取10 mg 烤后烟叶样品粉末（不含马来酰肼及其糖苷）至离心管作为样品基质，制成5、10、20、40、80、150 mg/kg 浓度梯度的待测样本。离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂。将制好的样本按照“样品前处理”和“色谱质谱分析条件”部分所述方法进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标峰面积。将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到马来酰肼的校准曲线方程为：y = 0.0187x - 0.0618，r ² =0.9990，马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的校准曲线方程为：y = 0.0123x -0.0158，r ² =0.9973。

将得到的实际样品中的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱相对峰面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。其中马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷采用马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的标准曲线进行定量。得到处理一个月后烟草中马来酰肼及其糖苷在不同时期的含量如图3。从图3可以看出马来酰肼处理烟草一个月后其烟叶马来酰肼含量只剩下刚处理时的25.9%，其中有11.2%（=39.3×（112/274）÷144×100%）和1.5%（=5.4×（112/274）÷144×100%）转化为马来酰肼糖苷。其余的马来酰肼可能转移至烟草的根、茎部分或经根部转移至土壤。

试验例1

本发明的校准曲线的线性相关系数（r²）均在0.99 以上，而且通过表2可知，本发明的方法完全能够满足对于烟叶中马来酰肼及其糖苷的定量分析要求，通过表3和表4可知，本发明的准确性高，重复性好。

表 2 马来酰肼和马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的检测限和定量限

表 3 马来酰肼和马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的回收率

注：低、中、高分别代表添加浓度为10、40、80 mg/kg。

表 4 马来酰肼和马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的重复性

注：重复性实验定在添加浓度为40 mg/kg时测定。

实施例2

一种基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，包括以下步骤：

1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇：甲基叔丁基醚：水的体积比为30：40：65，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；所述的内标溶液为100 ng/mL的磷酸三苯酯的乙腈溶液；

所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末，每100 mg新鲜烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的新鲜烟叶样品粉末的制备方法为：将新鲜的烟叶样品在液氮冷冻下研磨粉碎至30目，磨好样品迅速转入离心管封存于-80 ℃冰箱，备用；所述的超声的时间为25min，离心的时间为3min，离心力≥5000g。所述的加入的内标溶液与下层清液的体积比为1:60；

2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、80、150 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼、马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷及马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液；

3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。

所述的色谱分析条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC@BEH HILIC (100 mm ×2.1 mm × 1.7μm)，A相洗脱溶剂为0.2%甲酸的水溶液，B相洗脱溶剂为0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件为2% A相保持1.00 min，1.00-4.30 min A相比例升至12%，4.30-4.31min A相比例升至50%，4.31-6.00 min，A相比例保持为50%，6.00-6.01min A相比例变为2%，6.01-7.00 min A相比例保持为2%。流动相流速为0.3 mL/min；柱温23 ℃。进样量5 μL。

所述的质谱条件为采用正离子模式多反应离子检测模式（MRM）采集数据，离子源条件采用分段设计，具体如下：

液相保留时间0-3.2 min：喷雾电压4000 V；气帘气25 psi；碰撞气9 psi；温度700℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体2，90 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V；

液相保留时间3.2-7.0 min：喷雾电压5500 V；气帘气25 psi；碰撞气5 psi；温度250℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体1，60 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V。

实施例3

一种基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，包括以下步骤：

1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇：甲基叔丁基醚：水的体积比为40： 50：75，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；所述的内标溶液为100 ng/mL的磷酸三苯酯的乙腈溶液；

所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末，每10 mg烤后烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的烤后烟叶样品粉末的制备方法为：将烤后烟叶样品研磨粉碎至小于40目，磨好样品转入离心管封存于4 ℃冰箱，备用；所述的超声的时间为35 min，离心的时间为7min，离心力≥5000g；所述的加入的内标溶液与下层清液的体积比为1:60；

2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、80、150 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液；

3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。

所述的色谱分析条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC@BEH HILIC (100 mm ×2.1 mm × 1.7μm)，A相洗脱溶剂为0.2%甲酸的水溶液，B相洗脱溶剂为0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件为2% A相保持1.00 min，1.00-4.30 min A相比例升至12%，4.30-4.31min A相比例升至50%，4.31-6.00 min，A相比例保持为50%，6.00-6.01min A相比例变为2%，6.01-7.00 min A相比例保持为2%。流动相流速为0.3 mL/min；柱温23 ℃。进样量5 μL。

所述的质谱条件为采用正离子模式多反应离子检测模式（MRM）采集数据，离子源条件采用分段设计，具体如下：

液相保留时间0-3.2 min：喷雾电压4000 V；气帘气25 psi；碰撞气9 psi；温度700℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体2，90 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V；

液相保留时间3.2-7.0 min：喷雾电压5500 V；气帘气25 psi；碰撞气5 psi；温度250℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体1，60 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V。

Claims (9)

1.一种基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于包括以下步骤：

1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇：甲基叔丁基醚：水的体积比为30~40：40~50：65~75，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；所述的内标溶液为100 ng/mL的磷酸三苯酯的乙腈溶液；

2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10 μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、80、150 μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10 mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤（1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；

3）样品分析：将步骤（1）处理后的待分析样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度。

2.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末，每100 mg新鲜烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的新鲜烟叶样品粉末的制备方法为：将新鲜的烟叶样品在液氮冷冻下研磨粉碎至小于40目，磨好样品迅速转入离心管封存于-80 ℃冰箱，备用。

3.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末，每10 mg烤后烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的烤后烟叶样品粉末的制备方法为：将烤后烟叶样品研磨粉碎至小于40目，磨好样品转入离心管封存于4 ℃冰箱，备用。

4.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（1）中所述的甲醇-甲基叔丁基醚-水的体积比为37:45:68。

5.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（1）中所述的超声的时间为25~35 min，离心的时间为3~7 min，离心力≥5000g。

6.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（1）中所述的加入的内标溶液与下层清液的体积比为1:60。

7.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（2）中所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼、马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷及马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液或马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液中的任一种。

8.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（2）或（3）中所述的色谱分析条件为：色谱柱为Waters ACQUITYUPLC@BEH HILIC (100 mm × 2.1 mm × 1.7μm)，A相洗脱溶剂为0.2%甲酸的水溶液，B相洗脱溶剂为0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件为2% A相保持1.00 min，1.00-4.30 min A相比例升至12%，4.30-4.31 min A相比例升至50%，4.31-6.00 min，A相比例保持为50%，6.00-6.01min A相比例变为2%，6.01-7.00 min A相比例保持为2%；流动相流速为0.3 mL/min；柱温23 ℃；进样量5 μL。

9.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤（2）或（3）中所述的质谱条件为采用正离子模式多反应离子检测模式（MRM）采集数据，离子源条件采用分段设计，具体如下：

液相保留时间0-3.2 min：喷雾电压4000 V；气帘气25 psi；碰撞气9 psi；温度700℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体2，90 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V；

液相保留时间3.2-7.0 min：喷雾电压5500 V；气帘气25 psi；碰撞气5 psi；温度250℃；离子源气体1，40 psi；离子源气体1，60 psi；去簇电压60 V；入口电压10 V；碰撞池外部电压15 V。