CN107703221A - 一种同时测定Beagle犬血浆中雷贝拉唑钠及其代谢物的方法 - Google Patents

一种同时测定Beagle犬血浆中雷贝拉唑钠及其代谢物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用LC/MS/MS同时测定Beagle犬血浆中左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的检测方法，属于生物检测领域。本试验以非那西丁为内标，乙酸乙酯萃取预处理后，采用高效液相色谱‑串联质谱法可同时测定犬血浆中左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠三种代谢物的血药浓度。本发明方法特异性强、灵敏度高、操作简便，克服了使用两台仪器分批检测的局限性，已成功应用于Beagle犬血浆中雷贝拉唑钠光学异构体及其代谢产物的分析研究。

Description

一种同时测定Beagle犬血浆中雷贝拉唑钠及其代谢物的方法
技术领域
本发明涉及一种利用LC/MS/MS同时测定Beagle犬血浆中左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
消化性溃疡(peptic ulcer)是一种由于酸性胃液对粘膜的消化作用引发的溃疡，主要指发生于胃和十二指肠的慢性溃疡，是一种多发病、慢性病、常见病。如不能很好的控制，将会导致胃出血，胃穿孔及癌变。
雷贝拉唑钠(Sodium rabeprazole)是一种新型的苯并咪唑类质子泵抑制剂，无抗胆碱能及抗H2组胺特性，但可附着在胃壁细胞表面通过抑制H+/K+-ATP酶来抑制胃酸的分泌。雷贝拉唑包括左旋和右旋两种光学异构体，目前市场上所使用的活性成分为两种光学异构体的消旋混合物，但发挥主要药理作用的是其右旋体。雷贝拉唑钠的血浆蛋白结合率约为97％，主要的代谢产物为硫醚和羧酸。次要代谢物还有砜、乙基硫醚和硫醚氨酸。只有乙基代谢物具有少量抑制分泌的活性，但不存在于血浆中。该药90％主要随尿排出，其它代谢物随粪便排出。
高效液相-串联质谱法(HPLC-MS/MS)是检测药物浓度最常用的方法，具有灵敏度高、特异性强等特点，可以对多种微量化合物同时进行检测。因此，通过同时检测Beagle犬体内左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的血药浓度，可以更加准确的监测雷贝拉唑钠在体内动态的代谢变化情况。
目前，经过系统验证的HPLC-MS/MS方法只能使用两台仪器分批检测雷贝拉唑钠光学异构体及其代谢物，未见同时检测左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的文献报道，本发明首次建立了利用LC/MS/MS同时测定Beagle犬血浆中左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的检测方法，为雷贝拉唑钠的临床前血药浓度的检测奠定了坚实的方法学基础。
发明内容
按照本发明提供的技术方案，一种同时测定Beagle犬血浆中左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的检测方法，步骤为：
(1)血浆样品预处理：取血浆样品加入非那西丁内标溶液，再加入乙酸乙酯萃取后氮吹，初始流动相复溶。
(2)色谱：将步骤(1)中预处理后的血浆样本进行色谱分离，初始流动相：甲醇/水A＝5/95；样品检测时间30min；流速：0.5mL/min；进样量：5.0μL。
(3)质谱：AB SCIEX 5500三重四级杆串联质谱系统，离子源为ESI源，正离子模式，气帘气压力：35psi，喷撞气:8psi，离子化电压：5500psi，离子源温度：550℃，喷雾气：55psi，辅助加热器：55psi，多重反应监测(MRM)模式。
(4)计算：采用内标法，以待测物和内标的峰面积比值代入标准曲线方程，计算各待测物的浓度。
2.如权利要求1所述同时测定犬血浆中雷贝拉唑钠光学异构体及其代谢产物的检测方法，其特征是步骤(1)具体为：取100μL血浆样品置于1.5mL离心管中，加入50μL(浓度为200ng/mL)非那西丁内标溶液，再加入500μL乙酸乙酯溶液，充分混匀震荡3.0min，12000rpm离心5min，取450μL上清液于新的1.5mL离心管中，氮吹吹干，200μL甲醇：水＝5:95的初始流动相复溶，全部取出置于自动进样品中，进样5μL检测。
3.如权利要求1所述同时测定犬血浆中雷贝拉唑钠光学异构体及其代谢产物的检测方法，其特征是：步骤(1)所述血浆样品为含左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的血浆。
4.如权利要求1所述同时测定犬血浆中雷贝拉唑钠光学异构体及其代谢产物的检测方法，其特征是步骤(2)中采用色谱柱为：AGP 30713色谱柱(0.4cm×10cm I.D.，5μm)，大赛璐药物手型技术(上海)有限公司；色谱柱前安装与AGP色谱柱配套的预柱(0.4cm L×10cm I.D.，5μm，2-pack)，大赛璐药物手型技术(上海)有限公司。
5.如权利要求1所述同时测定犬血浆中雷贝拉唑钠光学异构体及其代谢产物的检测方法，其特征是步骤(2)中流动相梯度为：0～3min 5％～12％B(甲醇)，3～5.5min 12％B，5.6～25min 15％B，25.1～30min 5％B。
6.如权利要求1所述同时测定犬血浆中雷贝拉唑钠光学异构体及其代谢产物的检测方法，其特征是步骤(3)中检测离子具体为：检测离子：雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z360.1→m/z150.1CE:30eV、[M+H]+m/z360.1→m/z195.2CE:20eV、DP:80eV；去甲基雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z346.1→m/z150.1CE:35eV、[M+H]+m/z346.1→m/z228.2CE:15eV、DP:95eV；硫醚雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z344.1→m/z154.1CE:40eV、[M+H]+m/z344.1→m/z226.1CE:18eV、DP:120eV；雷贝拉唑钠砜选择性反应检测离子[M+H]+m/z376.2→m/z119.1CE:31eV、[M+H]+m/z376.2→m/z158.2CE:19eV、DP:98eV；非那西丁选择性反应检测离子[M+H]+m/z180.0→m/z110.1CE:25eV、[M+H]+m/z180.0→m/z138.1CE:20eV、DP:110eV。
本发明的有益效果：
(1)预处理方法简便：采用萃取后氮吹法，适用于常规检测。
(2)专属性强，采用AGP 30713色谱柱进行分离，初始流动相：甲醇：水＝5：95；梯度洗脱：0～3min 5％～12％B(甲醇)，3～5.5min 12％B，5.6～25min15％B，25.1～30min 5％B；可在30min内完成测定，且内源性物质不干扰两者的测定。
(3)灵敏度高：血浆中左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜最低定量限均为2ng/mL。
(4)检测快速方便：利用一台液质30min完成样品的一次测定，时间短，因此适合大批量的生物样品的检测。
(5)样品用量小：仅需100μL血浆样品，即可测定出准确浓度。
(6)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的血药浓度测定提供依据。本方法的左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜血浆标准曲线线性范围为2～2000ng/mL，低QC日内、日间精密度和准确度均小于20％；中、高QC日内、日间精密度和准确度均小于15％。
附图说明
图1空白犬血浆色谱图(A-E为不同犬只)。
图2空白犬血浆中分别加入左、右旋雷贝拉唑钠及去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠、雷贝拉唑钠砜、内标非那西丁标准品处理后检测得到的色谱图(A为雷贝拉唑钠右旋体，B为雷贝拉唑钠左旋体，C为硫脒雷贝拉唑钠，D为去甲基雷贝拉唑钠，E为雷贝拉唑钠砜，F为非那西丁)
图3空白犬血浆中加入左、右旋雷贝拉唑钠及3种代谢产物的混标处理后检测得到的色谱图。
图4犬血浆左旋雷贝拉唑钠的标准曲线图。
图5犬血浆右旋雷贝拉唑钠的标准曲线图。
图6犬血浆去甲基雷贝拉唑钠的标准曲线图。
图7犬血浆硫醚雷贝拉唑钠的标准曲线图。
图8犬血浆雷贝拉唑钠砜的标准曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例：Beagle犬血浆左、右旋雷贝拉唑钠及去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠、雷贝拉唑钠砜浓度的测定。
1.实验材料和仪器
左旋雷贝拉唑钠(批号：20120901，纯度99.05％)，右旋雷贝拉唑钠(批号：Y1001，纯度99.17％)，硫醚雷贝拉唑钠(批号：Y1001，纯度99.49％)，去甲基雷贝拉唑钠(批号：Y1001，纯度99.57％)，雷贝拉唑钠砜(批号：Y1001，纯度99.25％)，均由山东裕欣药业有限公司提供。非那西丁(批号：100095-201205)，中国食品药品检定研究院提供。乙腈(色谱纯)，美国FISHER公司提供。甲醇(色谱纯)，山东禹王实业有限公司化工分公司提供。甲酸(色谱纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司提供。
液相色谱系统：ThermoFisher Ultimate3000高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司生产；MS/MS系统：API5500三重四级杆质谱仪，ABSCIEX中国公司生产。Eppendorf移液器，德国艾本德公司。AUW-120D型电子分析天平，日本岛津公司生产。MS3型漩涡混悬器，IKA公司生产。SC-3612低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司生产。Z216MK高速冷冻离心机，德国哈默股份公司生产。Milli-Q Advantage A10超纯水仪默克化学技术(上海)有限公司生产。ACS-JJ-Tiger电子计价秤，梅特勒-托利多(常州)称重设备系统有限公司生产。
2.液质条件及血样处理：
液相色谱条件：色谱柱：AGP 30713色谱柱，(0.4cm×10cm I.D.，5μm)，大赛璐药物手型技术(上海)有限公司；色谱柱前安装与AGP色谱柱配套的预柱，(0.4cm L×10cm I.D.，5μm，2-pack)，大赛璐药物手型技术(上海)有限公司；初始流动相：甲醇：水＝5：95；梯度洗脱：0～3min 5％～12％B(甲醇)，3～5.5min 12％B，5.6～25min 15％B，25.1～30min 5％B；样品检测时间30min；流速：0.5mL/min；进样量：5.0μL。
质谱条件：AB SCIEX 5500三重四级杆串联质谱系统，离子源为ESI源，正离子模式，气帘气压力：35psi，喷撞气:8psi，离子化电压：5500psi，离子源温度：550℃，喷雾气：55psi，辅助加热器：55psi，多重反应监测(MRM)模式。检测离子：雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z360.1→m/z150.1CE:30eV、[M+H]+m/z360.1→m/z195.2CE:20eV、DP:80eV；去甲基雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z346.1→m/z150.1CE:35eV、[M+H]+m/z346.1→m/z228.2CE:15eV、DP:95eV；硫醚雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z344.1→m/z154.1CE:40eV、[M+H]+m/z344.1→m/z226.1CE:18eV、DP:120eV；雷贝拉唑钠砜选择性反应检测离子[M+H]+m/z376.2→m/z119.1CE:31eV、[M+H]+m/z376.2→m/z158.2CE:19eV、DP:98eV；非那西丁选择性反应检测离子[M+H]+m/z180.0→m/z110.1CE:25eV、[M+H]+m/z180.0→m/z138.1CE:20eV、DP:110eV；
血浆样品处理：取100μL血浆样品置于1.5mL离心管中，加入50μL(浓度为200ng/mL)非那西丁内标溶液，再加入500μL乙酸乙酯溶液，充分混匀震荡3.0min，12000rpm离心5min，取450μL上清液于新的1.5mL离心管中，氮吹吹干，200μL甲醇：水＝5:95的初始流动相复溶，全部取出置于自动进样品中，进样5μL检测。
3.实验过程
3.1储备液配制
雷贝拉唑钠左旋体标准品储备液的配制：准确称取雷贝拉唑钠左旋体标准品1.51mg，其中含雷贝拉唑钠左旋体1.49mg，利用校准后的移液器准确加入1.49mL的农残级甲醇溶液溶解，配成浓度为1.00mg/mL的左旋标准溶液，准确取1.00mL的1mg/mL的左旋标准溶液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成雷贝拉唑钠左旋体浓度为100.00μg/mL的储备液I。
雷贝拉唑钠右旋体标准品储备液的配制：准确称取雷贝拉唑右旋体标准品1.61mg，其中含雷贝拉唑钠右旋体1.59mg，利用校准后的移液器准确加入1.59mL的农残级甲醇溶液溶解，配成浓度为1.00mg/mL的右旋标准溶液，准确取1.00mL的1mg/mL的右旋标准溶液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成雷贝拉唑右旋体浓度为100.00μg/mL的储备液I。
硫醚雷贝拉唑标准品储备液的配制：准确称取硫醚雷贝拉唑标准品1.60mg，其中含硫醚雷贝拉唑体1.59mg，利用校准后的移液器准确加入1.59mL的农残级甲醇溶液溶解，配成浓度为1.00mg/mL的硫醚雷贝拉唑标准溶液，准确取1.00mL的1mg/mL的硫醚雷贝拉唑标准溶液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成硫醚雷贝拉唑浓度为100.00μg/mL的储备液I。
去甲基雷贝拉唑标准品储备液的配制：准确称取去甲基雷贝拉唑标准品1.45mg，利用校准后的移液器准确加入1.45mL的农残级甲醇溶液溶解，配成浓度为1.00mg/mL的去甲基雷贝拉唑标准溶液，准确取1.00mL的1mg/mL的去甲基雷贝拉唑标准溶液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成去甲基雷贝拉唑浓度为100.00μg/mL的储备液I。
雷贝拉唑钠砜标准品储备液的配制：准确称取雷贝拉唑钠砜标准品1.44mg，利用校准后的移液器准确加入1.44mL的农残级甲醇溶液溶解，配成浓度为1.00mg/mL的雷贝拉唑钠砜标准溶液，准确取1.00mL的1mg/mL的雷贝拉唑钠砜标准溶液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成雷贝拉唑钠砜浓度为100.00μg/mL的储备液I。
雷贝拉唑钠左、右旋及硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑和雷贝拉唑钠砜5种目标物混标储备液的配制准确量取雷贝拉唑左旋体标准储备液I、雷贝拉唑右旋体标准储备液I、硫醚雷贝拉唑标准储备液I、去甲基雷贝拉唑标准储备液I和雷贝拉唑钠砜标准储备液各I于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成雷贝拉唑左、右旋及3种代谢产物的混标储备液I，5种目标物浓度均为10.00μg/mL。
内标溶液(非那西丁)的配制：精密称取1.68mg非那西丁，用校准后的移液器准确加入1.68mL的农残级甲醇溶液溶解，甲醇稀释并定容至刻度，配成浓度为1.00mg/mL的内标储备液I；取1mL储备液I，置10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，获得浓度为100.00μg/mL的内标储备液II；取100μL储备液II，置50mL容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，获得浓度为200ng/mL的内标储备液III。
3.2专属性
取5只犬空白血浆100μL，按“血样处理”项下操作，分别经色谱分析，得空白血浆色谱图，如图1所示；将适量左旋、右旋雷贝拉唑及硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑钠、雷贝拉唑钠砜、非那西丁单标分别加入到空白血浆中，依照血浆处理方法操作，经分析，得左旋、右旋雷贝拉唑及硫醚雷贝拉唑、去甲基雷贝拉唑钠、雷贝拉唑钠砜和非那西丁的色谱图，如图2所示；将适量左、右旋雷贝拉唑钠及3种代谢产物的混标溶液加入到空白血浆中，依照血浆处理方法操作，经分析，得色谱图，如图3所示。
3.3标准曲线
取100μL空白血浆，加入含有雷贝拉唑钠左、右旋，硫醚雷贝拉唑，去甲基雷贝拉唑，雷贝拉唑钠砜标准系列溶液，配制浓度为2，4，10，20，80，200，800，2000ng/mL的血浆标准样品，每一浓度5份，从加入内标溶液起按“血样处理”项下操作。以待测物的浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法(权重为1/x2)进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。根据标准曲线，5个目标物的线性范围为2.0-2000ng/mL。标准曲线的最低点为定量下限。
具体标准曲线图如图4-8所示。
3.4精密度试验
批内精密度：按“标准曲线”项下的方法配制低(4ng/mL)、中(80ng/mL)、高(800ng/mL)三个浓度的血浆样品，按“血浆样品处理”项下依法操作，每一浓度5个平行样品，以标准曲线算得5种目标物的浓度，并计算样品的批内精密度，结果见表1、表2、表3、表4、表5。
表1雷贝拉唑钠左旋体批内精密度数据
表2雷贝拉唑钠右旋体批内精密度数据
表3硫醚雷贝拉唑钠批内精密度数据
表4去甲基雷贝拉唑钠批内精密度数据
表5雷贝拉唑钠砜批内精密度数据
批间精密度：按“标准曲线”项下的方法配制低(4ng/mL)、中(80ng/mL)、高(800ng/mL)三个浓度的血浆样品，按“血浆样品处理”项下依法操作，每一浓度5个平行样品，连续测定3天，分别以标准曲线算得5种目标物的浓度，并计算样品的批间精密度，结果见表6、表7、表8、表9、表10。表6雷贝拉唑钠左旋体批间精密度数据
表7雷贝拉唑钠右旋体批间精密度数据
表8硫醚基雷贝拉唑钠批间精密度数据
表9去甲基雷贝拉唑钠批间精密度数据
表10雷贝拉唑钠砜批间精密度数据
3.5回收率测定
按“标准曲线”项下的方法配制低(4ng/mL)、中(80ng/mL)、高(800ng/mL)三个浓度的血浆样品，按“血浆样品处理”项下依法操作，每一浓度5个平行样品，处理后进样检测；将空白血浆样品按照“血浆样品处理”项下提取得到基质溶液，利用基质溶液配制低(4ng/mL)、中(80ng/mL)、高(800ng/mL)三个浓度的标准品，并加入非那西丁标准品(终浓度50ng/mL)，以检测得到的峰面积为参比，计算5种目标物的相对提取回收率；内标的相对提取回收率采用相同方法计算。具体数据见表11，表12，表13,表14，表15，表16。
表11雷贝拉唑钠左旋体相对提取回收率(％)
表12雷贝拉唑钠右旋体相对提取回收率(％)
表13硫醚雷贝拉唑钠相对提取回收率(％)
表14去甲基雷贝拉唑钠相对提取回收率(％)
表15雷贝拉唑钠砜相对提取回收率(％)
表16内标非那西丁的相对提取回收率(％)
3.6稳定性试验
处理后的血浆样品放置于样品进样室(4℃控温)24h内的稳定性：按“标准曲线”项下的方法配制低(4ng/mL)、中(80ng/mL)、高(800ng/mL)三个浓度的血浆样品，按“血浆样品处理”项下依法操作，每一浓度5个平行样品，处理后，将样品放入样品进样室(4℃控温)，分别在样品放入后0h，6h，12h，18h和24h进样检测，考察处理后样品中5种目标物在放入进样室后24h内的稳定性。检测结果见表17、18、19、20、21。
表17血浆样品提取后放置于样品进样室24h稳定性—雷贝拉唑钠左旋体
表18血浆样品提取后放置于样品进样室24h稳定性—雷贝拉唑钠右旋体
表19血浆样品提取后放置于样品进样室24h稳定性—硫醚雷贝拉唑钠
表20血浆样品提取后放置于样品进样室24h稳定性—去甲基雷贝拉唑钠
表21血浆样品提取后放置于样品进样室24h稳定性—雷贝拉唑钠砜
血浆样品-20℃冰箱放置24h稳定性：按“标准曲线”项下的方法配制低(4ng/mL)、中(80ng/mL)、高(800ng/mL)三个浓度的血浆样品，放入-20℃冰箱中保存，分别在样品放入前，放入后12h和24h后拿出(每一浓度5个平行样品)，按“血浆样品处理”项下依法操作，然后进样检测，考察血浆样品中5种目标物在-20℃冰箱放置24h内的稳定性。检测结果见表22、23、24、25、26。
表22血浆样品中雷贝拉唑钠左旋体-20℃冰箱放置24h稳定性
表23血浆样品中雷贝拉唑钠右旋体-20℃冰箱放置24h稳定性
表24血浆样品中硫醚雷贝拉唑钠-20℃冰箱放置24h稳定性
表25血浆样品中去甲基雷贝拉唑钠-20℃冰箱放置24h稳定性
表26血浆样品中雷贝拉唑钠砜-20℃冰箱放置24h稳定性
血浆样品冻融稳定性：按“标准曲线”项下的方法配制低(4ng/mL)、中(80ng/mL)、高(800ng/mL)三个浓度的血浆样品(每一浓度5个平行样品)，放入-20℃冰箱中，3次冷冻-解冻循环后，按“血浆样品处理”项下依法操作，然后进样检测，考察血浆样品中5种目标物的冻融稳定性，结果见表27、28、29、30、31。
表27血浆样品3次冷冻-解冻循环冻融稳定性-雷贝拉唑钠左旋体
表28血浆样品3次冷冻-解冻循环冻融稳定性-雷贝拉唑钠右旋体
表29血浆样品3次冷冻-解冻循环冻融稳定性-硫醚雷贝拉唑钠
表30血浆样品3次冷冻-解冻循环冻融稳定性-去甲基雷贝拉唑钠
表31血浆样品3次冷冻-解冻循环冻融稳定性-雷贝拉唑钠砜
血浆样品-80℃放置7天稳定性：按“标准曲线”项下的方法配制低(4ng/mL)、中(80ng/mL)、高(800ng/mL)三个浓度的血浆样品，放入-80℃冰箱中保存7天，取出后(每一浓度5个平行样品)，按“血浆样品处理”项下依法操作，然后进样检测，考察血浆样品中5个目标物在-80℃冰箱放置7天的稳定性。结果见表32、33、34、35、36。
表32血浆样品-80℃放置7日雷贝拉唑钠-左旋体稳定性
表33血浆样品-80℃放置7日雷贝拉唑钠-右旋体稳定性
表34血浆样品-80℃放置7日硫醚雷贝拉唑钠稳定性
表35血浆样品-80℃放置7日去甲基雷贝拉唑钠稳定性
表36血浆样品-80℃放置7日雷贝拉唑钠砜稳定性
4.检测结果
检测9只Beagle犬口服雷贝拉唑钠胶囊2h后，犬血浆中左旋、右旋雷贝拉唑钠及三种代谢物的浓度，见表37。
表37 9只Beagle犬口服雷贝拉唑钠胶囊2h后，犬血浆中左旋、右旋雷贝拉唑钠及三种代谢物的浓度
由表37可知，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为左旋、右旋雷贝拉唑钠及去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠、雷贝拉唑钠砜的血药浓度测定提供依据。

Claims (6)

1.一种同时检测Beagle犬血浆中雷贝拉唑钠光学异构体及其代谢产物的方法，其特征为：包括步骤：
(1)血浆样品预处理：取血浆样品加入非那西丁内标溶液，再加入乙酸乙酯萃取后氮吹，初始流动相复溶；
(2)色谱：将步骤(1)中预处理后的血浆样本进行色谱分离，初始流动相：甲醇/水A＝5/95；样品检测时间30min；流速：0.5mL/min；进样量：5.0μL；
(3)质谱：AB SCIEX 5500三重四级杆串联质谱系统，离子源为ESI源，正离子模式，气帘气压力：35psi，喷撞气:8psi，离子化电压：5500psi，离子源温度：550℃，喷雾气：55psi，辅助加热器：55psi，多重反应监测(MRM)模式；
(4)计算：采用内标法，以待测物和内标的峰面积比值代入标准曲线方程，计算各待测物的浓度。
2.如权利要求1所述检测方法，其特征是：步骤(1)包含：取100μL血浆样品置于1.5mL离心管中，加入50μL(浓度为200ng/mL)非那西丁内标溶液，再加入500μL乙酸乙酯溶液，充分混匀震荡3.0min，12000rpm离心5min，取450μL上清液于新的1.5mL离心管中，氮吹吹干，200μL甲醇：水＝5:95的初始流动相复溶，全部取出置于自动进样品中，进样5μL检测。
3.如权利要求1所述检测方法，其特征是：步骤(1)所述血浆样品为含左、右旋雷贝拉唑钠及雷贝拉唑钠代谢物去甲基雷贝拉唑钠、硫醚雷贝拉唑钠和雷贝拉唑钠砜的血浆。
4.如权利要求1所述检测方法，其特征是：步骤(2)中采用AGP 30713色谱柱(0.4cm×10cm I.D.，5μm)，色谱柱前安装与AGP色谱柱配套的预柱(0.4cm L×10cm I.D.，5μm，2-pack)。
5.如权利要求1所述检测方法，其特征是：步骤(2)中流动相梯度为：0～3min5％～12％B(甲醇)，3～5.5min 12％B，5.6～25min 15％B，25.1～30min 5％B。
6.如权利要求1所述检测方法，其特征是：步骤(3)包含：检测离子：雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z360.1→m/z150.1CE:30eV、[M+H]+m/z360.1→m/z195.2CE:20eV、DP:80eV；去甲基雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z346.1→m/z150.1CE:35eV、[M+H]+m/z346.1→m/z228.2CE:15eV、DP:95eV；硫醚雷贝拉唑钠选择性反应检测离子[M+H]+m/z344.1→m/z154.1CE:40eV、[M+H]+m/z344.1→m/z226.1CE:18eV、DP:120eV；雷贝拉唑钠砜选择性反应检测离子[M+H]+m/z376.2→m/z119.1CE:31eV、[M+H]+m/z376.2→m/z158.2CE:19eV、DP:98eV；非那西丁选择性反应检测离子[M+H]+m/z180.0→m/z110.1CE:25eV、[M+H]+m/z180.0→m/z138.1CE:20eV、DP:110eV。
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