CN109060984A

CN109060984A - 一种检测缬沙坦及其制剂中n-二甲基亚硝胺含量的方法

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Publication number: CN109060984A
Application number: CN201810951656.XA
Authority: CN
Inventors: 谭会洁; 胡德福; 石峰; 咸瑞卿; 巩丽萍; 邢晟; 程春雷
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明属于分析化学检测领域，涉及一种检测缬沙坦及其制剂中N‑二甲基亚硝胺含量的方法。检测方法采用的步骤为：将待测物粉碎，称取细粉，加极性有机溶剂溶解，滤膜过滤，制得待测溶液；标准曲线溶液制备；获得标准色谱图、回归方程；待测溶液用气相色谱‑热能分析仪进行检测，获得待测溶液色谱图；若待测溶液色谱图中存在与标准曲线色谱图中的色谱峰相应的色谱峰，则表明待测溶液中含有N‑二甲基亚硝胺；根据待测溶液色谱图中色谱峰的面积，计算得到N‑二甲基亚硝胺的浓度。本发明原理可靠,实验操作简单,利用了毛细管气相色谱的高分离效能和热能分析仪的高选择性和高灵敏度,确保了测量精度和准度,大大节约分析时间和测试成本。

Description

一种检测缬沙坦及其制剂中N-二甲基亚硝胺含量的方法

技术领域

本发明属于分析化学检测领域，涉及一种检测缬沙坦及其制剂中N-二甲基亚硝胺含量的方法。

背景技术

N-二甲基亚硝胺（NDMA），又名N-亚硝基二甲胺，具有很强的肝脏毒性，世界卫生组织将其划分为2A类致癌物质。近期在全球市场主流的降压药物缬沙坦中检出超量的NDMA，严重威胁患者的生命健康，导致全球范围20多个国家和地区紧急召回缬沙坦原料及制剂，成为全球关注的“缬沙坦事件”。药品质量标准中无适用的N-二甲基亚硝胺检测方法，无法有效监控产品质量是导致该事件的主要原因之一。

目前，N-二甲基亚硝胺的检测方法主要为气相色谱质谱法、液相色谱法质谱法、气相色谱热能分析仪法，主要应用于食品、化妆品和烟草行业，国内外对药品中N-二甲基亚硝胺检测方法的研究报道较少。目前文献报道的NDMA测定方法中前处理方法一般需蒸馏提取、萃取净化、蒸发浓缩等步骤，操作繁琐，灵敏度低，无法满足药品中NDMA限度检查的要求。本发明根据缬沙坦和NDMA在溶解性的特点，选用适宜有机溶剂，直接溶解后不需净化直接进样分析，前处理简单、专属性强、重现性好、灵敏度高。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺点，提供一种检测缬沙坦及其制剂中N-二甲基亚硝胺含量的方法，专属性强，灵敏度高，检验结果正确率高等优点，适用于缬沙坦及其制剂中N-二甲基亚硝胺的含量检测。

为实现上述目的本发明采取如下技术方案：

1、一种缬沙坦及其制剂中N-亚硝胺含量的检测方法，采用的步骤为：

1）待测溶液制备：将待测物粉碎，称取细粉，加极性有机溶剂溶解，滤膜过滤，制得待测溶液；

2）标准曲线溶液制备：量取 N-二甲基亚硝胺标准储备液溶液适量，用极性有机溶剂稀释制成梯度标准曲线溶液；

3）获得标准色谱图、回归方程：梯度标准曲线溶液用气相色谱-热能分析仪进行检测，获得标准色谱图；

以标准曲线色谱图的色谱峰面积为纵坐标，以标准曲线溶液中N-二甲基亚硝胺的相应浓度为横坐标作图，得线性回归方程；

4）定性分析：待测溶液用气相色谱-热能分析仪进行检测，获得待测溶液色谱图；若待测溶液色谱图中存在与标准曲线色谱图中的色谱峰相应的色谱峰，则表明待测溶液中含有N-二甲基亚硝胺；

5）定量计算：采用外标法定量：根据待测溶液色谱图中色谱峰的面积，采用步骤（2）的回归方程，计算得到N-二甲基亚硝胺的浓度。

优选地，步骤（1）所述的细粉和极性有机溶剂的质量体积比为1:1-50。

优选地，所述气相色谱检测条件为: 进样口温度200-230℃，不分流进样，进样量5μl，载气为氮气，流速为1.0 mL/min，采用程序升温；所述程序升温的条件为：初温为60℃，保持2min，以10℃/min 升至120℃，保持1 min，以50℃/min 升至200℃，保持2 min；所述氮气的纯度＞99.999%。

优选地，所述热能分析仪的条件为：接口温度250℃，热解室温度500℃，真空度59.85Pa~66.5Pa，氧气压力13.79kPa，臭氧水平240。

优选地，步骤1)或步骤2）中所述的有机溶剂为极性有机溶剂，优选乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或几种混合。

优选地，步骤1)中，滤膜采用0.22～0.45μm孔滤膜。

优选地，步骤2)中，所述梯度标准曲线溶液浓度范围为5～10000ng/mL。

优选地，所述毛细管色谱柱采用中等极性或极性色谱柱

有益效果

（1）提高检测效率

采用现行国家标准《食品中N-亚硝胺类化合物的测定》检测NDMA时样本检测时间需要数小时,本发明前处理简单，分析时间短，可实现15分钟内快速检测，能极大的提高检验效率，若进行批量化检验，检验效率高的优势更加明显。

(2)降低检测成本

仅用少量有机溶剂前处理，试剂消耗少，节能环保。

(3)定性定量准确

本发明选用极性或中等极性毛细管柱，通过优化的色谱条件分离，采用热能分析仪检测，灵敏度高，专属性好，定量准确。仪器检出限可达1ng/mL,方法检出限可达5ppb，方法定量限15ppb，远低于欧盟300ppb的限度标准。本发明适用于缬沙坦及其制剂中N-二甲基亚硝胺的实际检测,能够为药品中亚硝胺的检测和产品质量控制提供技术方法支持。

附图说明

图1为GC-TEA法NDMA对照品色谱图；

图2为GC-TEA法典型样品色谱图；

图3为GC-TEA法检出限色谱图；

图4为GC-TEA法对照品、缬沙坦原料及制剂中NDMA典型色谱图；

图5为GC-MS法500ng/mL NDMA对照品溶液的定量离子提取色谱图及质谱图；

图6为GC-MS法50ng/mL的NDMA对照品溶液的定量离子提取色谱图及质谱图；

图7为GC-MS法C厂样品的定量离子提取色谱图及质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。

实施例1

1、仪器与试药英国Ellutia 800系列热能分析仪；CP255D电子天平；INERTROAP-WAX，30m×0.32mm ×0.5μm； N- 二甲基亚硝胺标准储备液溶液（100μg/ml，AccusStandard）；甲醇为色谱纯；实验所用水均为Milli- Q超纯水；，缬沙坦原料（A药厂），缬沙坦分散片（B药厂），缬沙坦氢氯噻嗪胶囊（C药厂）。

2、标准曲线溶液

精密量取 N-二甲基亚硝胺标准储备液溶液（100μg/mL）适量，用甲醇稀释制成10、20、30、50、100、200ng/mL系列浓度的标准曲线溶液。

3、待测溶液制备

将待测物粉碎，精密称取细粉，加有机溶剂溶解，滤膜滤过，取滤液用有机溶剂稀释制得待测溶液。

表1

4、气相色谱和VF-WAX（30m×0.32mm ×0.25μm）

4.1 气相色谱条件和热能分析仪的条件

进样口温度200-230℃，不分流进样，进样量5μl，载气为氮气，流速为1.0 mL/min，采用程序升温；所述程序升温的条件为：初温为60℃，保持2min，以10℃/min 升至120℃，保持1min，以50℃/min 升至200℃，保持2 min；所述氮气的纯度＞99.999%。

4.2 热能分析仪的条件

接口温度250℃，热解室温度500℃，真空度59.85Pa~66.5Pa，氧气压力13.79kPa，臭氧水平240。

5、标准色谱图、回归方程

用气相色谱-热能分析仪，按照步骤4的条件，测定标准曲线溶液，获得不同浓度的标准溶液的色谱图。线性方程：A=12.6088C+1.0703，NDMA在浓度10～200 ng/mL范围内线性良好。超过线性范围则稀释后在进行分析。

6.方法精密度、重复性、检出限、定量限、回收率、溶液稳定性和专属性

6.1 精密度

精密量取30ng/mL的NDMA对照品溶液5μL，注入GC-TEA，连续进样6次，记录色谱图，峰面积RSD为0.75%，表明仪器精密度良好。

6.2重复性

取缬沙坦氢氯噻嗪胶囊内容物适量，制备供试品溶液，平行制备6份，进样测定，记录色谱图，按外标法计算NDMA含量，测定结果RSD为1.2%，表明方法的重复性良好。

6.3 检出限

取NDMA对照品溶液，稀释至适当浓度，按信噪比3:1计算检出限，信噪比10:1计算定量限，结果仪器检出限为1ng/mL，定量限为3ng/mL；稀释倍数为5计，方法检出限为5ppb，定量限为15ppb，具体色谱图见图3。

6.4 准确度

取已测得NDMA含量的样品粉末适量，精密称取9份，分成三组，分别加入一定量的NDMA，制得低中高三个不同浓度（15ppm、30ppm、45ppm）的回收试验用样品，加甲醇适量溶解，过滤，制得供试品溶液。进样测定，记录色谱图，按外标法计算NDMA含量。低中高三个不同浓度的回收率为94.3%~100.6%，RSD小于2.7%，说明方法准确度良好。

6.5 溶液稳定性

供试品溶液室温保存于棕色进样瓶中，于0h、6h、12h、24h、48h分别进样，峰面积RSD为1.8%，说明供试品溶液48小时稳定性良好。

6.6专属性

取空白辅料溶液、氢氯噻嗪溶液、甲醇及样品溶液各5μL，件进样测定，记录色谱图，NDMA出峰时间约为6.4min，相同保留时间处各溶液均无干扰峰，方法专属性良好。

7.样品检测

7.1 定性检测

采用保留时间定性，NDMA对照品出峰时间为6.4min，各样品在在相同保留时间处检出DNMA色谱峰，具体结果见图4。

7.2 定量检测

采用外表定量：根据试样色谱图中色谱峰的面积，采用步骤5的回归方程，计算各样品中N-二甲基亚硝胺的浓度。

表2

对比例1 气相色谱质谱法

（1）仪器与试药 Thermo Fisher Trace ISQ气质联用仪，色谱柱：DB-WAX，30m×0.25mm ×0.25μm，；CP255D电子天平； N- 二甲基亚硝胺标准储备液溶液（100μg/ml，AccusStandard）；甲醇为色谱纯；实验所用水均为Milli- Q超纯水；缬沙坦原料（A药厂），缬沙坦分散片（B药厂），缬沙坦氢氯噻嗪胶囊（C药厂）。

（2）色谱条件

色谱柱：DB-WAX，30m×0.25mm ×0.25μm；进样口温度：230 ℃；传输线温度：280℃；进样方式：不分流进样；进样量：1.0 μl；载气：氦气（纯度＞99.999%），流速为 1.0 mL/min；溶剂延迟：5 min；程序升温：初温为40 ℃，以10℃ /min 升至 90 ℃，保持 3 min，以50℃/min 升至 200 ℃，保持 2 min，。

（3）质谱条件电离方式：电子轰击离子化（EI）；电离能量：70eV；测定方式：选择离子扫描（SIM）模式；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280℃；四极杆温度：150 ℃；氮气流量：1.5 mL/min，氦气流量：2.25 mL/min；NDMA保留时间：6.0min，定量离子74.0，定性离子：42.0、43.0；

（4）标准曲线溶液

精密量取 N-二甲基亚硝胺标准储备液溶液（100μg/mL）适量，用甲醇稀释制成10、30、50、100、500、1000ng/mL系列浓度的标准曲线溶液。

（5）待测溶液制备

将待测物粉碎，精密称取细粉，加有机溶剂定容溶解，滤膜滤过，取滤液用有机溶剂稀释制得待测溶液。

（6）定性与定量分析

采用保留时间和定性离子定性，以标准梯度溶液浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，进行线性回归，将样品溶液定量离子峰面积代入回归方程，计算样品中NDMA含量。

（7）结果与分析

气相色谱质谱法是食品行业常用的NDMA检测方法，食品中NDMA检测前处理方法不适用于缬沙坦及其制剂中的NDMA检测，我们在本对比例中进行了前处理及色谱条件优化，但发现仍然存在专属性差，定量结果误差大的问题，主要缺点如下，具体结果见图5-7：

NDMA定量离子为74，定性为43和42，采用GC-MS法检测时，三个离子的响应值之比应约为100:45:78；但浓度值低于50ng/mL时背景和基质干扰较大，该三个离子响应值变化显著，且无规律，无法根据离子响应比值定性。

缬沙坦原料药DMNA保留时间附近有多个干扰小色谱峰，辅料不同的缬沙坦制剂中在NDMA保留时间附近存在较大干扰峰，导致低浓度样品定量结果不准确。

Claims

1.一种缬沙坦及其制剂中N-二甲基亚硝胺含量的检测方法，其特征在于，采用的步骤为：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的细粉和极性有机溶剂的质量体积比为1:1-50。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述气相色谱检测条件为: 进样口温度200-230℃，不分流进样，进样量5μl，载气为氮气，流速为1.0 mL/min，采用程序升温；所述程序升温的条件为：初温为60℃，保持2min，以10℃/min 升至120℃，保持1 min，以50℃/min 升至200℃，保持2 min；所述氮气的纯度＞99.999%。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述热能分析仪的条件为：接口温度250℃，热解室温度500℃，真空度59.85Pa~66.5Pa，氧气压力13.79kPa，臭氧水平240。

5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于，步骤1)或步骤2）中所述的有机溶剂为极性有机溶剂，优选乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或几种混合。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，滤膜采用0.22～0.45μm孔滤膜。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述梯度标准曲线溶液浓度范围为5～10000ng/mL。

8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤3)中, 所述毛细管色谱柱采用中等极性或极性色谱柱。