CN111537634A - 一种替丁类药物中ndma含量的检测方法 - Google Patents

一种替丁类药物中ndma含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种替丁类药物中NDMA含量的检测方法，采用液相色谱质谱联用检测，包括以下步骤：(1)将替丁类药物样品用液相色谱进行分离；其中，液相色谱采用亲水作用色谱柱，柱前流动相中不加酸；(2)将经液相色谱分离的样品结合质谱进行检测NDMA含量。本发明采用的亲水作用色谱分析方法来分离替丁类成分和NDMA，在柱前流动相中不加酸，使替丁和NDMA维持非离子型状态而达到分离，使两者分离时间相差12‑13min，因此，能够完全去除替丁类成分对NDMA的干扰，定量结果准确。本发明使用电喷雾离子化结合串联质谱，ESI为低温质谱，且质谱部分为非高分辨，造价成本相对低，因此应用推广性更强，转化应用前景强。

Description

一种替丁类药物中NDMA含量的检测方法
技术领域
本发明属于分析测试领域，尤其涉及一种检测替丁类药物中NDMA含量的方法。
背景技术
尼扎替丁为一种在临床上广泛用于治疗高胃酸分泌疾病的药物，是第三代新型H2-受体拮抗剂，与雷尼替丁相似，此类药物中也被检出含有不安全水平的致癌物质NDMA。NDMA，中文全名为N-亚硝基二甲胺，已确定是一种遗传毒性杂质，该物质可在很低浓度时造成人体遗传物质DNA损伤，进而导致基因突变致使肿瘤发生。目前，FDA、EMA、NMPA等药品监管部门发布的药物原料及制剂中NDMA杂质的检测方法主要为：GC-MS(气相色谱质谱法)、LC-APCI-MS/MS(液相色谱-大气压化学电离串联质谱法)、LC-HRMS(液相色谱-高分辨质谱法)等。对于替丁类药物的分析，因为气相色谱法的高温进样造成药物结构中的硝基和二甲胺从母核解离，再结合生成新的NDMA而出现假阳性结果，因此GC法无法在替丁类药物测定中使用；液相-质谱法目前采用的是反相液相色谱与APCI(大气压化学电离)结合用串联质谱进行检测，或与ESI(电喷雾电离)结合HRMS(高分辨质谱)进行检测。两种方式中的一个共性问题在于反相分离时，替丁类成分与NDMA的分离度有限。为促进后续的电离效率，流动相中添加的助电离剂(有机酸)也进一步减小了成分的分离效果。而且，由于APCI为高温离子源，亦会导致药物自身热裂解产生新的NDMA与样品中残留的NDMA重叠，进而出现假阳性结果，另外，HRMS仪器造价十分昂贵，很大程度上限制了LC-APCI-MS/MS和LC-HRMS的适用性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种仪器造价相对低、应用推广性更强的、灵敏度高、定量结果准确的检测尼扎替丁原料或其制剂中NDMA含量的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种替丁类药物中NDMA含量的检测方法，采用液相色谱质谱联用检测，包括以下步骤：
(1)将替丁类药物样品用液相色谱进行分离；
其中，液相色谱采用亲水作用色谱柱，柱前流动相(进入色谱柱的流动相为柱前流动相)中不加酸；
(2)将经液相色谱分离的样品结合质谱进行检测NDMA含量。
上述的检测方法，优选的，步骤(2)中，质谱分析采用ESI电喷雾离子源质谱。ESI电喷雾离子源质谱的离子源为低温离子源，且质谱部分为非高分辨，造价成本相对低，因此应用推广性更强。
上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，液相色谱分析过程中柱前流动相为：流动相A为纯水，流动相B为98％-50％乙腈。流动相A和流动相B可以互换。本发明的申请人发现通过选择98％-50％乙腈水作为流动相，可以让尼扎替丁在亲水作用色谱柱上保留时间更长，从而与NDMA达到完全分离。
上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，流动相A与流动相B的体积比为1:1。
上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，色谱柱选择Waters亲水柱、赛默飞亲水柱、安捷伦亲水柱、酰胺柱亲水色谱柱中的任一种。
上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，在柱尾流动相中添加促电离剂，所述促电离剂为甲酸或乙酸；所述促电离剂的浓度范围为1mmol/L-1000mmol/L。本发明在柱前流动相中先不加酸维持替丁类成分和NDMA为非离子型状态而达到分离，再在柱尾流动相(色谱柱出来之后为柱尾)中加酸，即柱前流动相带着样品进入亲水色谱柱分离，样品从色谱柱分离出来后并与柱尾泵入的酸混合，最后进入质谱检测，这样操作既保证了离子化效率，又不会影响成分的分离效果。
上述的检测方法，优选的，所述柱前流动相与柱尾流动相的流速比为(1：10)-(10：1)。
上述的检测方法，优选的，步骤(1)中，替丁类药物进样前，配成30mg/mL的乙腈样品溶液并经有机膜过滤；样品进样量为10uL-0.2mL。
上述的检测方法，优选的，步骤(2)中，质谱分析过程中喷雾电压为1.0kV-5.0kV，脱溶剂温度为100-300℃。
上述的检测方法，优选的，步骤(2)中，检测NDMA的特征离子对包括定量离子对：75.25/43.05和定性离子对：75.25/58.10。
上述的检测方法，优选的，所述替丁类药物为尼扎替丁原料或其制剂。
目前，在分析药物中NDMA含量的检测时，为了使药物成分和NDMA在色谱柱中保留时间更长，选择反相色谱柱分离，但反相流动相中水的比例较高，这样就要求质谱仪具有更高的灵敏度，必须使用高温离子源APCI与其匹配。然而，高温离子源APCI价格昂贵，本申请的发明人期望能够利用ESI质谱仪来测定替丁类药物中NDMA含量。基于此，本发明首先在液相色谱采用亲水作用色谱柱来分离替丁类成分和NDMA，以期与ESI质谱仪相匹配。但是如何利用液相色谱分析将替丁类成分和NDMA进行彻底分离开，以更好地利用ESI质谱仪来进行分析，是一直未曾解决的技术问题。本发明的申请人通过反复研究和实验验证发现，在亲水性色谱分析过程中柱前流动相中不能加入促电离剂(酸)，并且通过流动相的合理选择，可以使得NDMA与尼扎替丁能够被彻底分离开，能够完全去除替丁类成分对NDMA的干扰，定量结果准确；同时，在柱尾流动相中加入酸，将中性的NDMA转化为离子状态，保证了NDMA离子化效率，在ESI质谱中分析，测试灵敏度高。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明采用的亲水作用色谱分析方法来分离替丁类成分和NDMA，在柱前流动相中不加酸，使替丁类成分和NDMA维持非离子型状态而达到分离，使两者分离时间相差12-13min，因此，能够完全去除替丁类成分对NDMA的干扰，定量结果准确；
(2)本发明在柱尾流动相中加酸，保证了NDMA的离子效率，在ESI质谱测试灵敏度高，本发明的这样操作既保证了NDMA离子化效率，又不会影响替丁和NDMA的分离效果；
(3)本发明使用电喷雾离子化结合串联质谱，ESI为低温质谱，且质谱部分为非高分辨，造价成本相对低，因此应用推广性更强，转化应用前景强；
(4)本发明的前处理简单，分析时间短，分析一针样品的时间短，不超过20min；且本发明的申请人在研究过程中发现，采用本发明的分析方法NDMA出峰的保留时间在2min左右，2.5min之后不再出NDMA峰，而替丁类成分则在15min出峰，因此在产业化应用分析的过程中，注样3min后就可以通过阀切换把从液相色谱出来的样品切换至废液而不用进入质谱，避免替丁污染质谱，质谱污染小；
(5)本发明的检测方法对其它类似原料及制剂中NDMA的测定具有借鉴意义。
附图说明
图1是1ng/mL NDMA标准溶液通过本发明的检测方法检测后利用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
图2是1ng/mL NDMA标准溶液通过本发明的检测方法检测后利用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
图3是采用外标法，以75.25/43.05为定量离子对绘制的NDMA含量的标准曲线。
图4是本发明实施例1中尼扎替丁原料采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
图5是本发明实施例1中尼扎替丁原料采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
图6是本发明实施例1中利用液相紫外检测器检测尼扎替丁的紫外光谱图。
图7是本发明实施例2中尼扎替丁制剂采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
图8是本发明实施例2中尼扎替丁制剂采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
图9是本发明实施例3中尼扎替丁原料采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
图10是本发明实施例3中尼扎替丁原料采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
图11是本发明对比例1中尼扎替丁原料采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
图12是本发明对比例1中尼扎替丁原料采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
图13是本发明实施例4中尼扎替丁制剂采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
图14是本发明实施例4中尼扎替丁制剂采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
图15是本发明对比例2中尼扎替丁制剂采用定性离子对(75.25/58.10)分析的质谱结果。
图16是本发明对比例2中尼扎替丁制剂采用定量离子对(75.25/43.05)分析的质谱结果。
图17是本发明验证柱尾补充促电离剂能提高离子化效率的实验过程中采用定性离子对(75.25/58.10)的质谱结果。
图18为本发明验证柱尾补充促电离剂能提高离子化效率的实验过程中采用定量离子对(75.25/43.05)的质谱结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
制备标准曲线：
(1)配制不同浓度的N-二甲基亚硝胺(NDMA)标准样品，均用乙腈作为稀释溶剂，稀释至系列标准溶液，即NDMA的浓度依次为：1，2，5，10，50，100，500和1000ng/mL；
(2)使用液相色谱质谱LCMS-8050以MRM模式监测NDMA的特征离子对，如图1和图2所示，在质谱工作站上计算出1ng/mL NDMA标准溶液S/N＝21.90＞10，满足定量要求；
(3)采用外标法绘制标准曲线，以NDMA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，如图3所示，在1-1000ng/mL浓度范围内线性相关系数＝0.9999792。
实施例1：
一种本发明的从某批次尼扎替丁原料中检测NDMA含量的方法，具体步骤如下：
(1)称取120mg尼扎替丁原料药于15mL离心管中，加入4mL乙腈，涡旋2min振摇30min，离心5min，过0.22mm有机膜，制成进样液；
(2)将进样液用液相色谱进行分离，具体工艺条件包括：
色谱柱：Waters亲水柱：XBridge BEH HILIC(150×2.1mm，2.5μm)；
柱前流动相：流动相(B)95％乙腈、流动相(A)：纯水；等度洗脱；
柱尾流动相(C):10％乙腈+200mmol/L甲酸；
流速：柱前流动相流速/柱尾流速的流速比：2：1(0.2mL/min:0.1mL/min)；
进样量：20uL；
(3)将经液相色谱分离的样品联合质谱进行检测，离子源：ESI电喷雾离子源，喷雾电压(接口电压)：5.0kV，脱溶剂温度(DL温度)：270℃；MRM检测NDMA：定性离子对(75.25/58.10)的质谱结果如图4所示，定量离子对(75.25/43.05)的质谱结果如图5所示，同时对阳性检出样品做加标回收率测试，样品中检出NDMA为3.44ng/mL(带入标曲计算的结果)，换算成NDMA在尼扎替丁原料中的浓度0.11ppm，平均加标回收率为95.4％。
检测的过程中，液相色谱进样3min后通过阀切换把从液相色谱出来的样品切换至废液而不用进入质谱，避免替丁污染质谱。
检测过程中，在液相紫外检测器上设置波长为320nm(对应为尼扎替丁的最大吸收波长)检测尼扎替丁出峰的位置，如图6所示，尼扎替丁出峰的保留时间为t＝14.496min，同时从图4和图5的质谱分析可知，NDMA出峰的保留时间为t＝1.978min，由此可见，NDMA和尼扎替丁两者分离时间相差12-13min。由此可见，本发明的检测方法能够完全去除尼扎替丁对NDMA的干扰，测试灵敏度高，定量结果准确。
由于NDMA在2min左右出峰，而尼扎替丁在15min左右出峰，再加上平衡时间，分析一针样品的时间短，不超过20min。
实施例2：
一种本发明的从某批次尼扎替丁制剂中检测NDMA含量的方法，具体步骤如下：
(1)将分散片研碎后，称取150mg于15mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋2min,振摇60min，离心5min，过0.22mm有机膜，制成进样液；
(2)将进样液用液相色谱进行分离，具体工艺条件包括：
色谱柱：Waters亲水柱：XBridge BEH HILIC(150×2.1mm，2.5μm)；
柱前流动相：流动相(B)：95％乙腈、流动相(A)：纯水；等度洗脱；
柱尾流动相：10％乙腈+200mmol/L甲酸；
流速：柱前流动相流速/柱尾流动相流速的流速比：2：1(0.2mL/min:0.1ml/L)；
进样量：20uL；
(3)将经液相色谱分离的样品联合质谱进行检测，离子源：ESI电喷雾离子源，喷雾电压(接口电压)：5.0kV，脱溶剂温度(DL温度)：270℃；MRM检测NDMA：定性离子对(75.25/58.10)的质谱结果如图7所示，定量离子对(75.25/43.05)的质谱结果如图8所示，样品中检出NDMA为42.51ng/mL(带入标准曲线计算的结果)，换算成NDMA在尼扎替丁制剂中的浓度1.42ppm。
检测的过程中，液相色谱进样3min后通过阀切换把从液相色谱出来的样品切换至废液而不用进入质谱，避免替丁污染质谱。
实施例3：
一种本发明的从某批次尼扎替丁原料(与实施例1是不同批次)中检测NDMA含量的方法，具体步骤如下：
(1)称取120mg尼扎替丁原料药于15mL离心管中，加入4mL乙腈，涡旋2min振摇30min，离心5min，过0.22mm有机膜，制成进样液；
(2)将进样液用液相色谱进行分离，具体工艺条件包括：
色谱柱：Waters亲水柱：XBridge BEH HILIC(150×2.1mm，2.5μm)；
柱前流动相：流动相(B)：95％乙腈、流动相(A)：纯水；等度洗脱；
柱尾流动相(C):10％乙腈+200mmol/L甲酸；
流速：柱前流动相流速/柱尾流速的流速比：2：1(0.2mL/min:0.1mlLmin)；
进样量：20uL；
(3)将经液相色谱分离的样品联合质谱进行检测，离子源：ESI电喷雾离子源，喷雾电压(接口电压)：5.0kV，脱溶剂温度(DL温度)：270℃；MRM检测NDMA：定性离子对(75.25/58.10)的质谱结果如图9所示，定量离子对(75.25/43.05)的质谱结果如图10所示，样品中检出NDMA为4.3ng/mL(带入标准曲线计算的结果)，换算成NDMA在尼扎替丁原料中的浓度为0.14ppm。
检测的过程中，液相色谱进样3min后通过阀切换把从液相色谱出来的样品切换至废液而不用进入质谱，避免替丁污染质谱。
对比例1：
本对比例是采用现有技术中的LC-MS联合测定方法测试与实施例3中同一批的尼扎替丁原料中的检测NDMA含量的方法，具体步骤如下：
(1)称取120mg尼扎替丁原料药于15mL离心管中，加入4mL乙腈，涡旋2min振摇30min，离心5min，过0.22mm有机膜，制成进样液；
(2)将进样液用采用反相色谱串联电喷雾质谱分析，其中，液相条件：
色谱柱：C18柱(150×4.6mm，3μm)，
流动相：A：0.1％甲酸水、B：0.1％甲酸乙腈，等度洗脱：85％乙腈，
流速：0.4mL/min，
进样量：20uL；
质谱条件：
喷雾电压(接口电压)：5.0kV，脱溶剂温度(DL温度)：250℃；MRM检测NDMA：定性离子对(75.10/58.30)的质谱结果如图11所示，定量离子对(75.10/43.00)的质谱结果如图12所示，样品中未检出NDMA。
实施例4：
一种本发明的从某批次尼扎替丁制剂(与实施例2为不同的批次的分散片)中检测NDMA含量的方法，具体步骤如下：
(1)将分散片研碎后，称取150mg于15mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋2min,振摇60min，离心5min，过0.22mm有机膜，制成进样液；
(2)将进样液用液相色谱进行分离：具体工艺条件包括：
色谱柱：Waters亲水柱：XBridge BEH HILIC(150×2.1mm，2.5μm)
柱前流动相：流动相(B)95％乙腈、流动相(A)：纯水；等度洗脱；
柱尾流动相：10％乙腈+200mmol/L甲酸；
流速：柱前流动相流速/柱尾流动相流速的流速比：2：1(0.2mL/min:0.1mL/min)；
进样量：20uL；
(3)将经液相色谱分离的样品联合质谱进行检测，离子源：ESI电喷雾离子源，喷雾电压(接口电压)：5.0kV，脱溶剂温度(DL温度)：270℃；MRM检测NDMA：定性离子对(75.25/58.10)的质谱结果如图13所示，定量离子对(75.25/43.05)的质谱结果如图14所示，样品中检出NDMA为5.75ng/mL(带入标曲计算的结果)，换算成NDMA在尼扎替丁制剂中的浓度0.19ppm。
检测的过程中，液相色谱进样3min后通过阀切换把从液相色谱出来的样品切换至废液而不用进入质谱，避免替丁污染质谱。
对比例2：
本对比例是采用现有技术中的LC-MS联合测定方法测试与实施例4中同一批的尼扎替丁制剂中的检测NDMA含量的方法，具体步骤如下：
(1)将分散片研碎后，称取150mg于15mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋2min,振摇60min，离心5min，过0.22mm有机膜，制成进样液；
(2)将进样液用液相色谱进行分离，具体工艺条件包括：
液相条件：色谱柱C18柱(150×4.6mm，3μm)；
流动相：A：0.1％甲酸水，B：0.1％甲酸乙腈，等度洗脱：85％乙腈；
流速：0.4mL/min，
进样量：20uL；
质谱条件：喷雾电压(接口电压)：5.0kV，脱溶剂温度(DL温度)：250℃；MRM检测NDMA：定性离子对(75.10/58.30)的质谱结果如图15所示，定量离子对(75.10/43.00)的质谱结果如图16所示，样品中未检出NDMA。
验证补充促电离剂能提高离子化效率的实验：
采用与实施例4相同的液相和质谱条件进行检测验证补充促电离剂能提高离子化效率，使用0.5μg/mLNDMA标准溶液，进样量为5μL，采用连续进样方式进行加样(前4针加250mmol/L甲酸，后4针不加甲酸)，质谱结果如图17和18所示(图17为定性离子对(75.25/58.10)质谱结果，图18为定量离子对(75.25/43.05)质谱结果)，从NDMA的峰强度来看，均显示加酸比不加酸的峰强度高，且加酸的强度至少是不加酸峰强度的2倍，表明酸性环境能大大提高离子化效率。

Claims (10)

1.一种替丁类药物中NDMA含量的检测方法，其特征在于，采用液相色谱质谱联用检测，包括以下步骤：
(1)将替丁类药物样品用液相色谱进行分离；
其中，液相色谱采用亲水作用色谱柱，柱前流动相中不加酸；
(2)将经液相色谱分离的样品结合质谱进行检测NDMA含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，质谱分析采用ESI电喷雾离子源质谱。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，液相色谱分析过程中柱前流动相为：流动相A为纯水，流动相B为98％-50％乙腈。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，流动相A与流动相B的体积比为1:1。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，色谱柱选择Waters亲水柱、赛默飞亲水柱、安捷伦亲水柱、酰胺柱亲水色谱柱中的任一种。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，在柱尾流动相中添加促电离剂，所述促电离剂为甲酸或乙酸；所述促电离剂的浓度范围为1mmol/L-1000mmol/L。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述柱前流动相与柱尾流动相的流速比为(1：10)-(10：1)。
8.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，替丁类药物进样前，配成30mg/mL的乙腈样品溶液并经有机膜过滤；样品进样量为10uL-0.2mL。
9.如权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，质谱分析过程中喷雾电压为1.0kV-5.0kV，脱溶剂温度为100-300℃。
10.如权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，检测NDMA的特征离子对包括定量离子对：75.25/43.05和定性离子对：75.25/58.10。
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