CN112710763A - 一种hplc法检测尼扎替丁中n-亚硝基二甲胺的方法 - Google Patents

一种hplc法检测尼扎替丁中n-亚硝基二甲胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种运用高效液相色谱法检测药品尼扎替丁中所含微量杂质N‑亚硝基二甲胺的方法，方法操作简单，提高了现有检测方法的检测速度和效率，且重复性较好，能更好地实现质量控制，有利于药品安全性。

Description

一种HPLC法检测尼扎替丁中N-亚硝基二甲胺的方法
技术领域
本发明涉及药品检测分析技术领域，具体的说涉及一种HPLC法检测药品尼扎替丁中所含杂质N-亚硝基二甲胺的方法。
背景技术
尼扎替丁(英文名称：Nizatidine、Axid、Nizax、Caemaxid)，为一种强效的H2受体拮抗剂，是继西咪替丁、雷尼替丁之后疗效更高、不良反应更少，在消化性溃疡疾病更具竞争力的优势品种。其分子式为C12H21N5O2S2，分子量为331.46，化学结构式如下：
Figure BSA0000230606520000011
尼扎替丁以噻唑环取代了雷尼替丁的呋喃环，基本化学结构与法莫替丁相似，因此在水溶液或固体存放中极不稳定，即使在室温下放置也极易产生大量杂质，其中可能产生微量的N-亚硝基二甲胺(NDMA)杂质的风险。根据世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单，NDMA属于2A类致癌物质，同时亚硝胺类化合物属于ICH M7指南中明确提出的具有较高致癌性(“关注队列”)的物质。因此该类化合物给用药的安全性带来隐患，应在药品中予以严格控制。故通过对尼扎替丁或其制剂中微量NDMA的检测来判断其是否可用于临床在本领域非常必要的。
目前对于药品中含有的极少量物质(如基因毒性杂质等)，在对其进行痕量分析时，通常采用的检测手段是：利用先进的液质联用(如LC-MS或LC-MS/MS等)、气质联用(如GC-MS或GC-MS/MS等)设备，对其微量物质进行检测时所需液相色谱系统可能为更高级的超高效液相色谱仪。如检测药物中含有亚硝胺类基因毒性杂质NDMA，根据不同原料药的性质不同，目前国际上公布的方法主要有GC-MS法、GC-MS/MS法、UPLC-APCI-MS/MS法，HPLC-UV法(EDQM公布)，国内官方公布的方法主要有GC-MS法、GC-MS/MS法、UPLC-APCI-MS/MS法，如中国药典2015年版二部推荐使用GC-MS法(详见《缬沙坦》原料中N-亚硝基二甲胺的含量测定方法)，不推荐使用HPLC-UV法，因为HPLC-UV法灵敏度比质谱仪的灵敏度差很多，而且专属性差些，容易受到检测干扰，故HPLC-UV法具有很大的局限性，只能准确测定那些含量相对较高的物质。
然而现有检测技术中，质谱仪价格昂贵，运行成本高，所需的试剂要求高，抗干扰能力差，维护保养费用很高，同时对质谱仪操作人员的水平要求非常高，需要高层次的人才方能准确操控；故质谱仪普及率非常低，一般企业较少购置，对于需要使用质谱仪进行痕量分析时只能委托特定的机构使用质谱仪进行检测；且气相色谱/质谱法操作过程繁琐，经过前处理后样品损失严重，而高效液相色谱仪价格便宜，操作容易，覆盖面广，一般企业均很常见。但是单纯使用HPLC-UV法进行检测含量极少的物质时，其灵敏度差，不能准确定量检测出复杂原料药中含量极低的物质，且检测过程中目标化合物所受干扰亦较大，目标化合物与其它杂峰之间的分离难度较大。
本发明人通过对药品中所含痕量杂质N-亚硝基二甲胺检测方法进行了长期研究，探索出一种采用高效液相色谱法测定样品中NDMA的方法，该方法比上述现有技术所提及的检测方法更加简便快速，且测定结果准确。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种HPLC法(高效液相色谱法)检测尼扎替丁原料或制剂样品中所含微量N-亚硝基二甲胺(NDMA)杂质的方法。该方法尤其适用于痕量N-亚硝基二甲胺(NDMA)杂质的检测，具体方案如下：
一种高效液相色谱法检测N-亚硝基二甲胺杂质的方法，其中所述方法包括以下步骤：
A、标准溶液的配制
称取N-亚硝基二甲胺对照品适量，用醇水混合溶液稀释配制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为对照品溶液母液；再量取所得对照品溶液母液适量，加水分别配制成每1ml中约含0.2ug、0.3ug、0.5ug、1.0ug的N-亚硝基二甲胺溶液，分别作为标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)；
B、待测样品溶液的制备
将待测样品研细，加稀释剂振摇使其充分溶解，振摇，离心，过滤，取续滤液5份，并分别向每份溶液中加入水、标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)及标准溶液(4)各0.1ml，混匀，分别作为样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)和样品溶液(5)；
C、选择色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
柱温：25℃～35℃；
流速：0.7～0.9ml/min
流动相：以乙腈-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱；
D、检测与计算
精密量取样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)、样品溶液(5)各20ul，分别注入液相色谱仪，在检测波长为226～230nm下记录色谱图，计算待测样品中N-亚硝基二甲胺杂质的含量。
以NDMA峰面积为纵坐标，以NDMA的加入量(ng)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，相关系数(r)应不低于0.995，按下式计算样品中各组分的浓度。
Figure BSA0000230606520000031
式中：A为标准曲线在X轴的截距
150为样品溶液中含有尼扎替丁的量(mg)
在具体实施过程中，记录样品溶液的谱图可以确定样品溶液中N-亚硝基二甲胺的峰面积，采用标准加入法，再根据已确定的标准曲线，即可确定供试品溶液中N-亚硝基二甲胺的含量，再经简单换算，即可确定样品中N-亚硝基二甲胺杂质的含量。
需要说明的是，标准加入法是所属领域的一种公知的定量方法，本发明在此不进行限定。
其中，步骤A所述醇水混合溶液中的醇为甲醇或乙醇中的一种或其组合，优选甲醇；更进一步的所述醇水混合溶液为10～30％醇水溶液，最优选20％甲醇水溶液。
另外，步骤B所述稀释剂选自水、极性有机溶剂，或它们的混合物；优选地，所述极性有机溶剂选自二甲亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、甲基叔丁基醚、乙腈、乙二醇、丙二醇、丙三醇、甲酸、乙酸、丙酸、甲磺酸、三乙胺、二甲胺、二甲基丙基胺、吡啶、吗啉、哌嗪、四氢吡咯、哌啶中的一种或其任意组合；
进一步的，步骤C所述色谱柱为粒径3um的C18柱，优选月旭Ultimate ODS-3色谱柱。
更进一步的，步骤C所述流动相以乙腈-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，以0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；梯度洗脱程序如下：
时间：0～8min，流动相A：94％，流动相B：6％；
时间：8～9min，流动相A：94％至10％，流动相B：6％至90％；
时间：9～15min，流动相A：10％，流动相B：90％；
时间：15～16min，流动相A：10％至94％，流动相B：90％至6％；
时间：16～30min，流动相A：94％，流动相B：6％。
在本发明的一些实施方式中，待测样品包括但不限于替丁类原料药中间体、替丁类原料药合成工艺中所使用的溶剂、替丁类原料药或含替丁类原料药的组合物；优选地，所述替丁类原料药为尼扎替丁；
进一步的，待测样品溶液的制备中将待测样品溶液用稀释剂配制成1mL体积中含替丁类原料药中间体或替丁类原料药1～1000mg、优选为1～200mg、最优选为5～50mg的样品溶液。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供的N-亚硝基二甲胺杂质的检测方法，其可以包括以下步骤：
A、标准溶液的配制
称取N-亚硝基二甲胺对照品适量，用20％醇水混合溶液稀释配制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为对照品溶液母液；量取所得对照品溶液母液适量，加水分别配制成每1ml中约含0.2ug、0.3ug、0.5ug、1.0ug的溶液，分别作为标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)；
B、待测样品溶液的制备
称取待测样品，加乙腈振摇使其充分溶解，振摇，离心，将上清液全部倾出至50ml量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液5份，并分别向每份溶液中加入水、标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)及标准溶液(4)各0.1ml，混匀，分别作为样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)和样品溶液(5)；
C、选择色谱条件
色谱柱：型号为Ultimate ODS-3的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
柱温：30℃；
流动相：以乙腈醇-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱；以0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；梯度洗脱程序如下：
时间：0～8min，流动相A：94％，流动相B：6％；
时间：8～9min，流动相A：94％至10％，流动相B：6％至90％；
时间：9～15min，流动相A：10％，流动相B：90％；
时间：15～16min，流动相A：10％至94％，流动相B：90％至6％；
时间：16～30min，流动相A：94％，流动相B：6％；
D、检测与计算
精密量取样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)、样品溶液(5)各20ul，分别注入液相色谱仪，在检测波长为228nm下记录色谱图，采用标准加入法计算待测样品中N-亚硝基二甲胺杂质的含量。
本发明提供的高效液相色谱法检测N-亚硝基二甲胺杂质的方法，分离效果好，操作简单，并且方法灵敏度高，线性范围宽，可以有效地检测待测样品中N-亚硝基二甲胺(NDMA)含量，包括进行痕量分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1、本发明实施例1提供的样品溶液(1)的液相色谱图；
图2、本发明实施例1提供的样品溶液(2)的液相色谱图；
图3、本发明实施例1提供的样品溶液(3)的液相色谱图；
图4、本发明实施例1提供的样品溶液(4)的液相色谱图；
图5、本发明实施例1提供的样品溶液(5)的液相色谱图；
图6、本发明检测方法的线性关系。
具体实施方式
本发明已在下述实施例中公开了一种运用高效液相色谱法检测药品中所含杂质N-亚硝基二甲胺的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种运用高效液相色谱检测药品中所含杂质N-亚硝基二甲胺的方法进行详细说明。在具体实施方式中，所用各试剂、药品、试验环境等在未经特殊说明下，均来源相同和一致。
实施例1：尼扎替丁分散片中NDMA检测方法
仪器：THERMO U3000型高效液相色谱仪
色谱柱：Ultimate ODS-3 4.0×250mm，3um
流动相：以乙腈-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱；以0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；
梯度洗脱程序如下：
时间：0～8min，流动相A：94％，流动相B：6％；
时间：8～9min，流动相A：94％至10％，流动相B：6％至90％；
时间：9～15min，流动相A：10％，流动相B：90％；
时间：15～16min，流动相A：10％至94％，流动相B：90％至6％；
时间：16～30min，流动相A：94％，流动相B：6％。
检测波长：228nm
固定相温度：30℃
流速：0.8ml/min
进样量：20μl
工作站：Thermo Scientific Dionex Chromeleon 7色谱数据系统
精密称取N-亚硝基二甲胺(NDMA)对照品适量，用20％甲醇水溶液稀释配制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为对照品溶液母液，精密量取对照品溶液母液适量，加水分别配制成每1ml中约含0.2ug、0.3ug、0.5ug、1.0ug的溶液，分别作为标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)。取本品20片，研细，称取粉末约2.7g(约含尼扎替丁1.5g)，置50ml离心管中，加乙腈5ml振摇使尼扎替丁溶解，加水20ml，混匀，振摇10min，离心(4000r/min)10min，立即将上清液全部倾出至50ml量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，经0.45μm滤头过滤，取续滤液5份各5ml，并分别向每份溶液中加入水、标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)各0.1ml，混匀，分别作为样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)、样品溶液(5)。照高效液相色谱法按上述色谱条件进行样品检测，记录色谱图，见图1～5。
实施例2尼扎替丁原料中NDMA检测方法
仪器：THERMO U3000型高效液相色谱仪
色谱柱：Ultimate ODS-3 4.0×250mm，3um
流动相：以乙腈-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱；以0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；
梯度洗脱程序如下：
时间：0～8min，流动相A：94％，流动相B：6％；
时间：8～9min，流动相A：94％至10％，流动相B：6％至90％；
时间：9～15min，流动相A：10％，流动相B：90％；
时间：15～16min，流动相A：10％至94％，流动相B：90％至6％；
时间：16～30min，流动相A：94％，流动相B：6％。
检测波长：226nm
固定相温度：35℃
流速：0.7ml/min
进样量：20μl
工作站：Thermo Scientific Dionex Chromeleon 7色谱数据系统
精密称取N-亚硝基二甲胺(NDMA)对照品适量，用10％甲醇水溶液稀释配制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为对照品溶液母液，精密量取对照品溶液母液适量，加水分别配制成每1ml中约含0.2ug、0.3ug、0.5ug、1.0ug的溶液，分别作为标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)。取本品尼扎替丁1.5g，置50ml离心管中，加丙酮5ml振摇使尼扎替丁溶解，加水20ml，混匀，振摇10min，离心(4000r/min)10min，立即将上清液全部倾出至50ml量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，经0.45μm滤头过滤，取续滤液5份各5ml，并分别向每份溶液中加入水、标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)各0.1ml，混匀，分别作为样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)、样品溶液(5)。照高效液相色谱法按上述色谱条件进行样品检测，记录色谱图。
实施例3尼扎替丁胶囊中NDMA检测方法
仪器：THERMO U3000型高效液相色谱仪
色谱柱：Ultimate ODS-3 4.0×250mm，3um
流动相：以乙腈-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱；以0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；
梯度洗脱程序如下：
时间：0～8min，流动相A：94％，流动相B：6％；
时间：8～9min，流动相A：94％至10％，流动相B：6％至90％；
时间：9～15min，流动相A：10％，流动相B：90％；
时间：15～16min，流动相A：10％至94％，流动相B：90％至6％；
时间：16～30min，流动相A：94％，流动相B：6％。
检测波长：230nm
固定相温度：25℃
流速：0.9ml/min
进样量：20μl
工作站：Thermo Scientific Dionex Chromeleon 7色谱数据系统
精密称取N-亚硝基二甲胺(NDMA)对照品适量，用30％甲醇水溶液稀释配制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为对照品溶液母液，精密量取对照品溶液母液适量，加水分别配制成每1ml中约含0.2ug、0.3ug、0.5ug、1.0ug的溶液，分别作为标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)。取尼扎替丁胶囊粉末适量(约含尼扎替丁1.5g)，置50ml离心管中，加异丙醇5ml振摇使尼扎替丁溶解，加水20ml，混匀，振摇10min，离心(4000r/min)10min，立即将上清液全部倾出至50ml量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，经0.45μm滤头过滤，取续滤液5份各5ml，并分别向每份溶液中加入水、标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)各O.1ml，混匀，分别作为样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)、样品溶液(5)。照高效液相色谱法按上述色谱条件进行样品检测，记录色谱图。
为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1
1、线性关系
精密量取实施例1中的NDMA对照品溶液母液适量，加水配制成溶液浓度每1ml中约含5ng、10ng、50ng、100ng、200ng、300ng及定量限浓度的溶液，按实施例1的检测条件对上述对照品溶液进行检测，即量取各溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表1：
表1 线性结果
Figure BSA0000230606520000081
以NDMA溶液浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性，线性回归方程：y＝0.151x-0.0525，R2＝0.9999；如图6所示。
实验结果表明在此色谱条件下，NDMA溶液在2.9047ng/ml～290.4660ng/ml的浓度范围内与主峰峰面积具有良好的线性关系，且Y轴截距在100％响应值的3.6％，远小于25.0％，其已非常接近原点。
2、溶液稳定性试验
(1)NDMA标准溶液(10ng/ml)
精密量取实施例1所得NDMA对照品溶液母液适量，加水配制成每1ml中约含10ng的溶液，取该溶液，即得。
(2)尼扎替丁分散片样品溶液
取样品20片，研细，称取粉末2.7009g(约含尼扎替丁1.5g)，置50ml离心管中，加乙腈5ml振摇使尼扎替丁溶解，加水20ml，混匀，振摇10min，离心(4000r/min)10min，立即将上清液全部倾出至50ml量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，经0.45μm滤头过滤，取续滤液，即得。
将以上两种溶液置于室温条件下，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h时各量取20μl，按实施例1的检测条件对上述溶液进行检测，记录色谱图，结果见表2。
表2 溶液稳定性试验结果
Figure BSA0000230606520000091
试验结果表明，NDMA标准溶液与尼扎替丁分散片供试品溶液中的NDMA在常温下放置12h内，溶液基本稳定。
3、重复性试验
按照实施例1所述样品溶液的制备方式平行配制6份样品的供试品溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)，精密量取以上6份样品的供试品溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)各20μl，注入液相色谱仪，按实施例1的检测条件对上述溶液进行检测，记录色谱图，按标准加入法求得线性方程，以及计算出的结果见表3。表3重复性试验结果
Figure BSA0000230606520000092
本试验例中6份样品中含有NDMA的量的相对标准偏差(RSD)为6.1％，小于10.0％，则试验结果表明本发明检测方法重复性较好，符合检测方法的方法验证要求。
本发明检测方法的线性关系好、稳定性好且重复性好，检测结果准确可靠；同时，具有易操作、省时节能等优点。

Claims (9)

1.一种高效液相色谱法检测尼扎替丁中所含微量杂质N-亚硝基二甲胺的方法，其中所述方法包括以下步骤：
A、标准溶液的配制
称取N-亚硝基二甲胺对照品适量，用醇水混合溶液稀释配制成对照品溶液母液；量取所得对照品溶液母液适量，加水分别配制成每1ml中约含0.2ug、0.3ug、0.5ug、1.0ug的溶液，分别作为标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)；
B、待测样品溶液的制备
将待测样品加稀释剂振摇使其充分溶解，振摇，离心，过滤，取续滤液5份，并分别向每份溶液中加入水、标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)及标准溶液(4)各0.1ml，混匀，分别作为样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)和样品溶液(5)；
C、选择色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
柱温：25～35℃；
流速：0.7～0.9ml/min
流动相：以乙腈-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱；
D、检测与计算
精密量取样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)、样品溶液(5)各20ul，分别注入液相色谱仪，在检测波长为226～230nm下记录色谱图，采用标准加入法计算待测样品中N-亚硝基二甲胺杂质的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A所述醇水混合溶液中的醇为甲醇或乙醇中的一种或其组合，优选甲醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤A所述醇水混合溶液为10～30％醇水溶液，优选20％甲醇水溶液；所述对照品溶液母液为每1ml中约含0.2mg的N-亚硝基二甲胺对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤B所述待测样品为替丁类原料药中间体、替丁类原料药合成工艺中所使用的溶剂、替丁类原料药或含替丁类原料药的组合物；优选地，所述替丁类原料药为尼扎替丁。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤B所述稀释剂选自水、极性有机溶剂，或它们的混合物；优选地，所述极性有机溶剂选自二甲亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、甲基叔丁基醚、乙腈、乙二醇、丙二醇、丙三醇、甲酸、乙酸、丙酸、甲磺酸、三乙胺、二甲胺、二甲基丙基胺、吡啶、吗啉、哌嗪、四氢吡咯、哌啶中的一种或其任意组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B所述待测样品溶液的制备中将待测样品溶液用稀释剂配制成1mL体积中含替丁类原料药中间体或替丁类原料药1～1000mg、优选为1～200mg、最优选为5～50mg的样品溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C所述色谱柱为粒径3um的C18柱，优选月旭Ultimate ODS-3色谱柱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C所述流动相以乙腈-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，以0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；梯度洗脱程序如下：
时间：0～8min，流动相A：94％，流动相B：6％；
时间：8～9min，流动相A：94％至10％，流动相B：6％至90％；
时间：9～15min，流动相A：10％，流动相B：90％；
时间：15～16min，流动相A：10％至94％，流动相B：90％至6％；
时间：16～30min，流动相A：94％，流动相B：6％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测样品尼扎替丁中N-亚硝基二甲胺杂质的检测方法包括以下步骤：
A、标准溶液的配制
称取N-亚硝基二甲胺对照品适量，用20％醇水混合溶液稀释配制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为对照品溶液母液；量取所得对照品溶液母液适量，加水分别配制成每1ml中约含0.2ug、0.3ug、0.5ug、1.0ug的溶液，分别作为标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)、标准溶液(4)。
B、待测样品溶液的制备
称取待测样品尼扎替丁分散片粉末2.7g(约含尼扎替丁1.5g)，加乙腈振摇使其充分溶解，振摇，离心，将上清液全部倾出至50ml量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液5份，并分别向每份溶液中加入水、标准溶液(1)、标准溶液(2)、标准溶液(3)及标准溶液(4)各0.1ml，混匀，分别作为样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)和样品溶液(5)。
C、选择色谱条件
色谱柱：型号为Ultimate ODS-3的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
柱温：30℃；
流动相：以乙腈醇-乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱；以0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；梯度洗脱程序如下：
时间：0～8min，流动相A：94％，流动相B：6％；
时间：8～9min，流动相A：94％至10％，流动相B：6％至90％；
时间：9～15min，流动相A：10％，流动相B：90％；
时间：15～16min，流动相A：10％至94％，流动相B：90％至6％；
时间：16～30min，流动相A：94％，流动相B：6％；
D、检测与计算
精密量取样品溶液(1)、样品溶液(2)、样品溶液(3)、样品溶液(4)、样品溶液(5)各20ul，分别注入液相色谱仪，在检测波长为228nm下记录色谱图，采用标准加入法计算待测样品中N-亚硝基二甲胺杂质的含量。
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