CN104076101A - 利用hplc测定尼扎替丁及注射制剂中有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明旨在提供一种更方便、快捷，能够准确检测尼扎替丁及其注射制剂中杂质含量的方法。分别取尼扎替丁和尼扎替丁杂质F用溶剂稀释，作为系统适用性溶液（1）。取测试样品1支，热降解后用溶剂稀释，作为系统适用性溶液（2）。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录VD）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为甲醇；流速为每分钟1.0ml，按下表线性梯度洗脱；检测波长为254nm。
Description
技术领域
本发明涉及尼扎替丁及注射制剂中有关物质的检测方法，具体涉及一种利用HPLC（高效液相色谱）测定尼扎替丁及注射制剂的降解产物的方法。
背景技术
尼扎替丁(英文名称：Nizatidine、Axid、Nizax、Caemaxid)为一种强效的H2受体拮抗剂，以噻唑环取代了雷尼替丁的呋喃环，基本化学结构与法莫替丁相似。其分子式为C12H21N5O2S2，分子量为331.46。
尼扎替丁是继西咪替丁、雷尼替丁之后疗效更高、不良反应更少，在消化性溃疡疾病更具竞争力的优势品种。
尼扎替丁是一个含有氨基的噻唑类化合物，因此其在水溶液或固体存放中极不稳定，即使在室温下放置也极易产生大量杂质，给用药的安全性带来隐患，因此通过对尼扎替丁或其制剂的检测来判断其是否可用于临床在本领域非常必要的。
现有技术中针对尼扎替丁原料标准（USP27）、尼扎替丁原料标准（BP2011）、尼扎替丁原料标准（EP7.5）、尼扎替丁胶囊标准（USP27）及尼扎替丁注射液标准 （BP2011）中有关物质测定色谱条件有较大差别，主要体现在洗脱方法和限度两个方面：1、洗脱方法的差异：尼扎替丁胶囊标准（USP27）使用等度洗脱法，而其他4个标准均为梯度洗脱法；2、洗脱流动相的差异：尼扎替丁注射液标准（BP2011）使用的流动相为醋酸铵缓冲液:甲醇=76：24或醋酸铵缓冲液:甲醇=50：50，而另外3个原料标准流动相为醋酸铵缓冲液；3、限度差异：上述4个标准中的限度有较大差别，其中USP27、EP7.5和BP2011中原料标准限度一致均为单个杂质峰面积不得过0.3%,所有杂质峰面积的和不得过1.5%；尼扎替丁胶囊（USP27）的限度为单个杂质峰面积不得过0.5%,所有杂质峰面积的和不得过1.5%；尼扎替丁注射液（BP2011）的限度为杂质E不得过2%；杂质F不得过1%；其他单个杂质峰面积不得过0.3%；其他总杂质峰面积不得过3.5%。
本发明旨在提供一种更方便、快捷，能够准确检测尼扎替丁及其注射制剂中杂质含量的方法。本发明使用了分离效果更好的梯度洗脱法，并进行了有针对性的专属性研究；增加了杂质F的分离度检测，并创新性的增加了一个热破坏杂质的分离适用性，这两个适用性选择条件的增加可以检测到以前任何方法都检测不到的杂质：尤其是经热降解产生的主色谱峰前的一杂质，TTR=0.94；此适用性能够将与主成分峰较接近且容易重叠在一起的热降解杂质。
发明内容
本发明提供一种快速分析分离尼扎替丁及注射制剂中的降解产物的高效液相色谱法，从而实现了尼扎替丁及其相关制剂中的有关物质在同一色谱条件下的分离测定。
所述有关物质包括（参见表1）：
仪器
液相色谱仪：戴安U3000高效液相色谱仪，包括四元泵（LPG-3400D）、自动进样器（WPS-3000）、柱温箱（TCC-3000RS）、DAD检测器（DAD-3000）、变色龙色谱工作站。岛津LC-10AT 系列色谱仪，包括LC-10AT VP高压输液泵、SPD-10A VP紫外检测器、LC Solution色谱工作站。
有关物质测定方法验证总结
强制破坏试验
检测试剂：尼扎替丁注射制剂，按照中国专利申请CN103462909A的方法自制的制剂。
流动相选择：流动相A为醋酸铵缓冲液（取5.9g醋酸铵，加水溶解并稀释至760ml，加入1ml二乙胺，用醋酸调节pH值至7.5），流动相B为甲醇。
系统适用性样品：分别取尼扎替丁对照品和尼扎替丁杂质F对照品适量，用流动相A-B（76:24）混合液溶解并制成每1ml中各含50μg的混合溶液，量取20μl进样，记录色谱图。
热破坏样品 精密称取尼扎替丁注射制剂内容物适量（约相当于尼扎替丁10mg），置10ml量瓶中，用流动相A-B（76:24）混合液溶解并稀释至刻度，摇匀，密封，置105℃烘箱中，加热15min后，进样，记录色谱图。
酸破坏样品 精密称取尼扎替丁注射制剂内容物适量（约相当于尼扎替丁10mg），置10ml量瓶中，加0.5mol/L 盐酸溶液0.5ml，浸润，放置6小时后，用0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml中和，用流动相A-B（76:24）混合液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏供试品，进样，记录色谱图。
碱破坏样品 精密称取尼扎替丁注射制剂内容物适量（约相当于尼扎替丁10mg），置10ml量瓶中，加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，浸润，放置3小时后，用0.5mol/L 盐酸溶液0.5ml中和，用流动相A-B（76:24）混合液溶解稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏供试品，进样，记录色谱图。
光照破坏样品 精密称取尼扎替丁注射制剂内容物适量（约相当于尼扎替丁10mg），置10ml量瓶中，于紫外灯下照射约8小时，用流动相A-B（76:24）混合液溶解稀释至刻度，摇匀，作为光破坏样品，进样，记录色谱图。
氧化破坏样品精密称取尼扎替丁注射制剂内容物适量（约相当于尼扎替丁10mg），置10ml量瓶中，加入6%过氧化氢溶液0.5ml，浸润，放置4小时后，用流动相A-B（76:24）混合液溶解稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏样品，进样，记录色谱图。
强制破坏试验结果可见： 尼扎替丁制剂进行各项破坏试验，产生的主要降解产物较为统一。其中酸、碱、光照、氧化试验分解出的杂质均能与尼扎替丁主成分峰有良好的分离，但是热破坏样品在与主成分峰较接近位置有一杂质峰，容易与主成分峰混合，需进一步验证。
6. 热降解试验
检测试剂：尼扎替丁注射制剂，按照中国专利申请CN103462909A的方法自制的制剂。
流动相选择：流动相A为醋酸铵缓冲液（取5.9g醋酸铵，加水溶解并稀释至760ml，加入1ml二乙胺，用醋酸调节pH值至7.5），流动相B为甲醇。
混合杂质对照品溶液：分别取已知杂质A、B、C、D、E、G、H、K及系统适用性溶液各适量,配制成每1ml分别含杂质A、B、C、D、E、G、H、K 0.01mg及尼扎替丁、杂质F5μg的溶液，作为混合杂质对照品溶液
混合溶液：取尼扎替丁注射制剂1支，置105℃烘箱中放置20分钟后，放冷后，精密加流动相A-B（76:24）混合液5ml使溶解后，混匀，精密量取0.5ml与5ml混合杂质对照品溶液置10ml量瓶中，用流动相A-B（76:24）混合液稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液；
尼扎替丁杂质E对照溶液：取尼扎替丁杂质E对照品适量，用流动相A-B（76:24）混合液溶解并制成每1ml中含100μg的溶液，作为尼扎替丁杂质E溶液。
强制破坏（60℃条件下放置20天）样品溶液：取60℃条件下放置20天样品，用流动相A-B（76:24）混合液溶解并制成每1ml中含1mg的溶液。
分别精密量取系统适用性溶液、混合溶液、尼扎替丁杂质E和60度20天样品溶液对照溶液20μl，分别在不同品牌色谱柱下进样，记录色谱图。所选用的色谱柱柱长均为0.25m，内径均为4.6mm，粒径均为5μm。色谱柱品牌信息见表2。
根据强制破坏（60℃条件下放置20天）样品溶液的色谱图，确定尼扎替丁色谱峰前紧邻的主要的降解杂质（命名为：DP-1）色谱峰位置，根据尼扎替丁杂质E对照溶液确定杂质E峰位置，计算混合溶液中杂质E、杂质DP-1和尼扎替丁各峰之间的分离度。
色谱柱选择：
试验结果：
通过上述实验，我们将不同品牌色谱柱条件下系统适用性结果与DP-1杂质、尼扎替丁杂质E与尼扎替丁之间的分离度见表1，尼扎替丁各已知杂质在不同品牌色谱柱条件下的相对保留时间总结于表1。
表1不同品牌色谱柱系统适用性结果及DP-1、杂质E与尼扎替丁之间的分离度
由试验结果可得出以下结论：
1）不同品牌色谱柱条件下，各杂质的相对保留时间基本一致。
2）迪马色谱柱DP-1杂质与杂质E无法有效分离。除迪马色谱柱外，其他品牌色谱柱DP-1杂质、尼扎替丁杂质E与尼扎替丁之间的分离度均大于1.5。
因DP-1杂质为热降解的主要易产生的杂质之一，故对于该杂质与尼扎替丁主峰之间的分离度应作为筛选适用的色谱柱条件之一。
取注射用尼扎替丁1支，置105℃烘箱中放置20-60分钟后，放冷，精密加入流动相A-B（76:24）混合液溶解并制成每1ml中含1mg尼扎替丁的溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，尼扎替丁杂质DP-1色谱峰（相对尼扎替丁保留时间0.9）与尼扎替丁色谱峰之间的的分离度应符合要求。
为严格药品质量，保障用药安全，选取了严格的方法和限度，进行了系统的方法学验证研究。
最终制订的具体有关物质测定方法如下：
有关物质 取本品5瓶，分别精密加溶剂[注1] 5ml使溶解后，混匀，精密量取5.0ml，置100ml量瓶中，用溶剂[注1]稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂[注1]稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别取尼扎替丁和尼扎替丁杂质F适量，用溶剂[1]溶解并稀释制成每1ml中含尼扎替丁和尼扎替丁杂质F各50μg的混合溶液，作为系统适用性溶液（1）。取注射用尼扎替丁1 支，置105℃烘箱中放置20分钟后，冷却至室温后，用溶剂[注1]溶解并稀释制成每1ml中约含尼扎替丁1mg的溶液，作为系统适用性溶液（2）。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为醋酸铵缓冲液（取5.9g醋酸铵，加水溶解并稀释至760ml，加入1ml二乙胺，用醋酸调节pH值至7.5），流动相B为甲醇；流速为每分钟1.0ml，按下表线性梯度洗脱；检测波长为254nm。
溶剂[注1]:流动相A-流动相B（76:24v/v）的混合液。
实施例1：
样品：注射用尼扎替丁，批号1212264B，规格：0.1g
对照品：尼扎替丁杂质F，批号: N1090060, EDQM；尼扎替丁对照品，批号100853-200601，中国药品生物制品检定研究院
色谱柱：菲罗门，Gemini C18，608477-11
系统适用性溶液（1）制备：取杂质F 5.01mg，尼扎替丁对照品4.96mg，放置于10ml容量瓶中，用溶剂[注1]定容至刻度，取1ml至10ml容量瓶，用溶剂[注1]定容至刻度，记得；系统适用性溶液（1）的色谱图如图1所示。
系统适用性溶液（2）制备：取样品1支，开盖后放置于105℃烘箱中放置20分钟后，冷却至室温，将内容物用溶剂[注1]定容于100ml容量瓶中，记得；系统适用性溶液（2）的色谱图如图2所示。
样品溶液：取本品5瓶，分别精密加溶剂[注1] 5ml使溶解后，混匀，精密量取5.0ml，置100ml量瓶中，用溶剂[注1]稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；样品测定色谱图如图3所示；
对照溶液：精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂[注1]稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；对照溶液色谱图如图4所示。
照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为醋酸铵缓冲液（取5.9g醋酸铵，加水溶解并稀释至760ml，加入1ml二乙胺，用醋酸调节pH值至7.5），流动相B为甲醇；流速为每分钟1.0ml，按下表线性梯度洗脱；检测波长为254nm。
结果：
经测定，1212264B批次注射用尼扎替丁，单个最大杂质为0.27%，总杂质量为0.56%。
使用此方法检测尼扎替丁及注射制剂的有关物质较原有的《英国药典》、《欧洲药典》、《美国药典》方法能够更准确的检测出有关物质的含量结果，并能检测出原有标准中未能预见的降解杂质。此方法更准确，细致，高效快捷。
附图说明
图1是本发明的系统适用性溶液（1）色谱图；
图2是本发明的系统适用性溶液（2）色谱图；
图3是本发明的样品测定色谱图；
图4是本发明的对照溶液色谱图。
Claims (3)
1.一种快速分析分离尼扎替丁及注射制剂中的降解产物的高效液相色谱法，其特征在于：分别取尼扎替丁和尼扎替丁杂质F适量，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中含尼扎替丁和尼扎替丁杂质F各50μg的混合溶液，作为系统适用性溶液（1）；取测试样品1支，置105℃烘箱中放置20分钟后，冷却至室温后，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含尼扎替丁1mg的溶液，作为系统适用性溶液（2）；照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为甲醇；流速为每分钟1.0ml，按下表线性梯度洗脱；检测波长为254nm；
时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 76 24
3 76 24
20 50 50
45 50 50
50 76 24
60 76 24 。
2.如权利要求1所述的方法，其中流动相A醋酸铵缓冲液采用如下方法制备：取5.9g醋酸铵，加水溶解并稀释至760ml，加入1ml二乙胺，用醋酸调节pH值至7.5。
3.如权利要求1和2的方法，其中所用的溶剂为流动相A和流动相B按照76:24（v/v）的混合液。
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