CN110988246B - 一种检测z-l-缬氨酸及其中间体(s)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测Z‑L‑缬氨酸及其中间体(S)‑4‑异丙基恶唑‑2,5‑二酮含量的方法，该方法包括如下步骤：(1)设置检测的HPLC条件：色谱柱：
XB‑C18‑250×4.6mm×5.0μm，流动相：纯乙腈；流速：0.6mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；检测波长：210nm；(2)绘制标准曲线；(3)Z‑L‑缬氨酸及其中间体(S)‑4‑异丙基恶唑‑2,5‑二酮的样品含量测定。利用C18反相色谱法检测(S)‑3‑苄氧羰基‑4‑异丙基‑2,5‑恶唑烷二酮(Z‑L‑缬氨酸)及其中间体(S)‑4‑异丙基恶唑‑2,5‑二酮含量，专属性、重复性、精密度、回收率良好。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种利用C18反相色谱法检测(S)-3-苄氧羰基-4-异丙基-2,5-恶唑烷二酮(Z-L-缬氨酸)及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮含量的方法。
背景技术
(S)-3-苄氧羰基-4-异丙基-2,5-恶唑烷二酮是制备口服抗巨细胞病毒感染药物盐酸缬更昔洛韦的重要中间体；(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮是一类重要的环状单体，广泛用于有机合成反应中间体，通过开环聚合反应后形成以多肽为基础的功能性材料，可用于药物制备缓释载体、组织工程和表面改性。虽然(S)-3-苄氧羰基-4-异丙基-2,5-恶唑烷二酮及(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮已经开发出多种用途，但关于其液相含量测定方面还未见报道。由于二者在含水、醇类的溶剂中或者碱性环境下都极易变性，且紫外吸收较强区域与溶剂紫外吸收区大部分重合，极大限制了液相流动相的选择范围，基于市场需求，亟待研究出操作简单、灵敏度高、快速、准确的检测方法，从而对该系列化合物定量以推动研究进展。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用C18反相色谱法检测(S)-3-苄氧羰基-4-异丙基-2,5-恶唑烷二酮(Z-L-缬氨酸)及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮含量的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种检测Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮含量的方法，包括如下步骤：
(1)设置检测条件
HPLC条件：
色谱柱：Ultimate C18色谱柱，粒径为5μm，内径为4.6mm，柱长为250mm，柱温：25℃；
进样量：20μL；
流动相：流动相为乙腈，乙腈＝100％，等度洗脱；
流速：0.4mL/min-1mL/min；
检测波长：190nm-230nm；
(2)绘制标准曲线
分别配制Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的标准样品，以乙腈作为溶剂，在步骤(1)的条件下进行检测，获得相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以相应物质含量为横坐标，制作标准曲线；
(3)检测分析
在步骤(1)的条件下对样品进行检测分析，根据获得的峰面积及步骤(2)制作的标准曲线，分别计算出样品中Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的含量。
优选地，流速为0.6mL/min。
优选地，检测波长为210nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明所采用的流动相比例为乙腈＝100％，便于操作，避免了样品被水及醇类溶剂的破坏。
(2)采用色谱柱为普通C18柱，可以降低成本，避免了正相色谱的繁琐操作，且可用于制备Z-L-缬氨酸的反应监控。
(3)流速为0.6mL/min，检测波长为210nm的方法下，Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的含量测定，专属性、重复性、精密度、回收率良好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。
图1为本发明Z-L-缬氨酸标准品的HPLC图谱；
图2为本发明(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮标准品的HPLC图谱；
图3为本发明Z-L-缬氨酸的标准曲线；
图4为本发明(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的标准曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。凡在本发明的精髓和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
一种利用C18反相色谱法检测(S)-3-苄氧羰基-4-异丙基-2,5-恶唑烷二酮(Z-L-缬氨酸)及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮含量的方法，包括如下步骤：
1、设置检测条件
HPLC条件：
色谱仪：Ultimate3000高效液相色谱仪(Thermo公司)
色谱柱：Ultimate XB-C18 4.6mm×250mm，粒径5μm，C18色谱柱，柱温：25℃；
流动相：流动相A为乙腈；等度洗脱：乙腈＝100％；
流速：0.6mL/min；
检测波长：210nm；
2、溶液的配制
标准品母液的配制：
2.1称取25mg的Z-L-缬氨酸标准品(百灵威科技有限公司，纯度>99.0％)于100mL容量瓶中用乙腈稀释至刻度摇匀，得含量为250μg/mL母液备用；
2.2称取25mg的(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮标准品(百灵威科技有限公司，纯度>98.0％)于100mL容量瓶中用乙腈稀释至刻度摇匀，得含量为250μg/mL母液备用。
样品母液的配制：
2.3称取50mg的Z-L-缬氨酸样品(自制)于100mL容量瓶中用乙腈稀释至刻度摇匀，得含量为500μg/mL母液备用；
2.4称取50mg的(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮样品(自制)于100mL容量瓶中用乙腈稀释至刻度摇匀，得含量为500μg/mL溶液备用。
3、绘制标准曲线
3.1绘制Z-L-缬氨酸的标准曲线
3.1.1用移液管分别移取步骤2.1中所述Z-L-缬氨酸标准品母液1mL、2mL、5mL、10mL、20mL于25mL容量瓶中，用乙腈分别定容稀释至刻度，分别配制成Z-L-缬氨酸含量为10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的乙腈溶液，将五组Z-L-缬氨酸乙腈溶液用步骤1的检测条件进行检测，得到五组Z-L-缬氨酸的峰面积；
3.1.2以Z-L-缬氨酸的峰面积为纵坐标，以Z-L-缬氨酸含量为横坐标，根据各组检测的数据进行绘图，拟合后得到Z-L-缬氨酸的标准曲线，如图3所示，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系式y＝3.5119x+62.827，R2＝0.9993；
3.2绘制(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的标准曲线
3.2.1用移液管分别移取步骤2.2中所述(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮标准品母液1mL、2mL、5mL、10mL、20mL于25mL容量瓶中，用乙腈分别定容稀释至刻度，分别配制成(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮含量为10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的乙腈溶液，将五组(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮乙腈溶液用步骤1的检测条件进行检测，得到五组(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的峰面积；
3.2.2以(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的峰面积为纵坐标，以(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮含量为横坐标，根据各组检测的数据进行绘图，拟合后得到(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的标准曲线，如图4所示，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系式y＝1.7415x+53.294，R2＝0.9991；
由Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的标准曲线可以看出，Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮在10～200μg范围内线性关系良好。
4、方法学考察实验
4.1检测限和定量限
分别取Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮标准品工作曲线最低浓度逐步稀释后进样20μL，分别以信号和信噪比(S/N)为3:1和10:1作为定量限和检测限，Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的检出限分别为0.3μg/mL、0.5μg/mL，Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮定量限为1.5μg/mL、3.5μg/mL。
4.2仪器精密度实验
分别取Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮标准品含量为50μg/mL的乙腈溶液，进样20μL，分别平行进样6次，以峰面积计算，得到Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的RSD分别为1.4％、2.0％，表明仪器精密度良好。
4.3重复性实验
分别取Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮标准品含量为50μg/mL的乙腈溶液，进样20μL，分别平行进样6次，以峰面积计算，得到Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的RSD分别为1.8％、2.1％，RSD<3％，表明该方法具有良好重现性。
4.4稳定性试验
分别取Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮标准品含量为50μg/mL的乙腈溶液，在0h，2h，4h，8h，12h，24h，48h进样20μL，以峰面积计算，得到Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的RSD分别为2.0％、2.8％，RSD<3％，表明样品稳定性良好。
4.5回收率试验
4.5.1称取Z-L-缬氨酸标准品5mg及步骤2.3中所述Z-L-缬氨酸样品母液5mL加入25mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度摇匀，平行配制5份，每份进样20μL，以峰面积计算，带入Z-L-缬氨酸的标准曲线，计算平均回收率为99.13％，RSD为2.47％，RSD<3％，表明Z-L-缬氨酸回收率良好。结果如表1所示。
4.5.2称取(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮标准品5mg及步骤2.4中所述(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮样品母液5mL加入25mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度摇匀，平行配制5份，每份进样20μL，以峰面积计算，带入(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的标准曲线，计算平均回收率为99.8％，RSD为2.45％，RSD<3％，表明(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮回收率良好。结果如表1所示。
表1检测条件对Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮测定的影响
表2流速对于Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮保留时间影响
流速低于0.5以后峰宽会突然增大，导致样品和杂质的分离度不达标。
表3检测波长对于Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮检出限影响
如表2、表3所示，通过流速、检测波长对Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮测定的影响，优选出Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮的测定条件：流动相：乙腈＝100％；流速为0.6mL/min，检测波长为210nm。
实施实例1：Z-L-缬氨酸样品的含量测定
称取10.2mg的Z-L-缬氨酸样品(批号：ZL20180921)于100mL容量瓶中用乙腈稀释至刻度摇匀，用步骤1的检测条件进行检测，进样20μL，仪器测得峰面积417.672mAu*min，带入Z-L-缬氨酸的标准曲线，得到浓度为101.04ug/mL，含量为99.01％。
实施实例2：(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮样品的含量测定
称取10.5mg的(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮样品(批号：NCA20180920)于100mL容量瓶中用乙腈稀释至刻度摇匀，用步骤1的检测条件进行检测，进样20μL，仪器测得峰面积232.852mAu*min，带入Z-L-缬氨酸的标准曲线，得到浓度为103.1ug/mL，含量为98.20％。
实施实例3：Z-L-缬氨酸制备反应监控
将(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮(143g，1mol)、氯甲酸苄酯(180g，1.05mol)及干燥的四氢呋喃750mL加入2L三口瓶中，氮气保护下降至-20℃(吸取0.1mL反应液至100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度摇匀，进样20uL，对(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮、氯甲酸苄酯在液相中定位)缓慢滴入N-甲基吗啉(101g，1mol),滴毕升至室温搅拌(每30min取样0.1mL反应液至100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度摇匀，进样20uL，测定(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮峰面积)至HPLC检测(S)-4-异丙基恶唑-2,5-二酮反应完全。将反应液过滤，弃去滤渣，滤液中加入石油醚1500mL后冷冻析晶。再次过滤，滤渣加入甲基叔丁基醚：石油醚＝1:1的混合溶剂500mL中重结晶得到白色固体(S)-3-苄氧羰基-4-异丙基-2,5-恶唑烷二酮200g，收率72％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.49–7.33(m,5H),5.41–5.27(m,2H),4.72(d,J＝3.6Hz,1H),2.42(dtd,J＝13.9,7.0,3.6Hz,1H),1.07(d,J＝7.1Hz,3H),0.85(d,J＝6.9Hz,3H)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种检测Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2 ,5-二酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)设置检测条件
HPLC条件：
色谱柱：Ultimate C18色谱柱，粒径为5μm，内径为4.6mm，柱长为250mm，柱温：25℃；
进样量：20μL；
流动相：流动相为乙腈，乙腈＝100％，等度洗脱；
流速：0.5mL/min-0.9mL/min；
检测波长：190nm-230nm；
(2)绘制标准曲线
分别配制Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2 ,5-二酮的标准品溶液，以乙腈作为溶剂，在步骤(1)的条件下进行检测，获得相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以相应物质含量为横坐标，制作标准曲线；
(3)检测分析
在步骤(1)的条件下对Z-L-缬氨酸样品、(S)-4-异丙基恶唑-2 ,5-二酮样品进行检测分析，根据获得的峰面积及步骤(2)制作的标准曲线，分别计算出样品中Z-L-缬氨酸、(S)-4-异丙基恶唑-2 ,5-二酮的含量；
所述Z-L-缬氨酸样品制备方法：称取50mg自制的Z-L-缬氨酸样品于100mL
容量瓶中用乙腈稀释至刻度摇匀，得含量为500μg/mL溶液备用；
所述(S)-4-异丙基恶唑-2 ,5-二酮样品制备方法：称取50mg自制的(S)-4-异丙基恶唑-2 ,5-二酮样品于100mL容量瓶中用乙腈稀释至刻度摇匀，得含量为500μg/mL溶液备用。
2.根据权利要求1所述的检测Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2 ,5-二酮含量的方法，其特征在于，流速为0.6mL/min。
3. 根据权利要求1所述的检测Z-L-缬氨酸及其中间体(S)-4-异丙基恶唑-2 ,5-二酮含量的方法，其特征在于，检测波长为210nm。
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