CN114216972A - 一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，属于氨基酸含量技术领域。二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，包括如下步骤：S1.配置对照品溶液；S2.配置供试品溶液；S3.将对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱进行检测，记录色谱图，计算得到二棕榈酰羟脯氨酸的含量。本发明的二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，通过特定的十八烷基硅烷键合硅胶固定相和乙腈‑磷酸水溶液的流动相控制，极大地改善了检测的峰型和分离度，色谱峰对称因子为0.96～0.99，提高了检测的准确性，方法还具有良好的可重复性，专属性好，线性相关性高，方法回收率好，稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸含量技术领域，更具体地，涉及一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法。
背景技术
二棕榈酰羟基脯氨酸(DPHP)是一种完全植物来源的羟基脯氨酸，羟基脯氨酸是一种胶原蛋白纤维所必需的特殊的氨基酸，在胶原蛋白中羟脯氨酸含量最高，而皮肤衰老与胶原蛋白含量的减少密切相关。羟基脯氨酸经过生化转化变成脂肪氨基酸，从而达到最理想的皮肤亲和力及羟基脯氨酸在皮肤细胞内最好的媒介传递作用。DPHP是非常有潜力的抗衰老物质，能达到最佳的保湿和抗皱效果，具有优异的去除眼角鱼尾纹的效果、减轻皮肤深度皱纹和减少皮肤皱纹数量的效果。DPHP作为一种极为有效的抗皱抗衰老添加剂被广泛应用于化妆品行业。该活性成分作为羟脯氨酸的载体可与任何有抗皮肤衰老、抗皱、皮肤松弛或抗氧自由基作用的产品配合使用，在抗衰老类化妆品中有很大的应用潜力。但目前国内外对DPHP的研究较少，未见有高效、准确的DPHP的含量测定方法，对产品的研发和产品的质量控制产生影响，难以保证产品可以达到预期抗皱抗衰老功效，因此，建立DPHP含量测定具有重要意义。
由于溶剂甲醇和乙醇在210nm波长处有吸收，用紫外分光光度计寻找DPHP的紫外吸收波长时，难以发现药物在210nm处有紫外吸收，因此，未见有报道使用紫外检测设备对DPHP进行检测。现有研究公开了采用化学法及分光光度法对含有DPHP的抗皱乳膏中的DPHP进行含量测定，该检测方法中，先用酸将其水解为游离的羟脯氨酸，游离的羟脯氨酸被氧化为吡咯，再与对二甲氨基苯甲醛反应生成紫红色化合物，在可见光区有吸收，进行含量测定。虽然该方法可用于DPHP的含量测定，但前期需要进行复杂的衍生化处理，且容易受衍生化试剂用量、种类、衍生化时间和温度等条件影响，从而使得测定方法复杂化、重现性差、准确性差和成本高。
CN104614452A公开了一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)内标法测定乳品中L-羟脯氨酸的方法，其不仅定量检测方法方法复杂，需要使用液相色谱-串联质谱，且样品也需要经过复杂的前处理，需要与水解标样和盐酸溶液进行水解处理，且定量检测的相对误差RSD为4.2～12.6％，回收率低，整体的重现性差和准确性差。
发明内容
本发明的目的是克服现有二棕榈酰羟基脯氨酸定量检测的检测方法操作复杂化、重现性差和准确性差的缺陷和不足，提供一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，包括如下步骤：
S1.配置对照品溶液；
S2.配置供试品溶液；
S3.将对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱进行检测，记录色谱图的峰面积，计算得到二棕榈酰羟脯氨酸的含量，
其中，S3中高效液相色谱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-磷酸水溶液，所述乙腈-磷酸水溶液的体积比为70～85：15～30。
其中，需要说明的是：
乙腈、水为常用流动相，本发明检测波长在210nm，短波长受到的溶剂影响较大，流动相选择乙腈吸收最小，在检测时产生的噪声最小。且乙腈的极性较甲醇强，洗脱能力较强。水溶液中加入一定体积比磷酸溶液，可以通过调节流动相的pH值来调节峰型，磷酸不易挥发，流动相的pH相对稳定，而挥发性酸可能随时间造成pH缓慢改变而影响重现性。
控制乙腈-磷酸水溶液的体积比通过调节流动相的极性来调整出峰时间，改善色谱峰对称性。
本发明的二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法采用特定的十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相，并协同流动相乙腈-磷酸水溶液，有效改善了常规的流动相洗脱的色谱峰对称性差、基线不平稳等问题，提高了二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定的重现性和准确性。
优选地，所述乙腈-磷酸水溶液的体积比为77～82：18-23。
优选地，所述对照品溶液的配置方法如下：
取DPHP对照品，加甲醇超声溶解，制备得到0.80～1.20mg/mL的对照品溶液，其中DPHP对照品的纯度≥98.91％。
优选地，所述供试品溶液的配置方法如下：
将供试品加甲醇超声溶解即可制备得到供试品溶液。
其中，需要说明的是：
相对于现有的二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，本发明的供试品处理步骤简单，只需要通过甲醇超声溶解即可，无需经过复杂的酸水解，氧化或衍生化处理，极大地简化了供试品制备，提高了检测效率，降低了检测成本。
优选地，所述磷酸水溶液的体积分数为0.05～0.10％。
进一步优选地，所述磷酸水溶液的体积分数为0.08％。
磷酸水溶液的体积分数用来调节流动相的pH，DPHP为酸性物质，加入酸可以抑制电离，调整保留时间，改善分离度，调整峰型。优选在0.05～0.10％可以改善峰型，防止色谱峰拖尾等现象，影响检测的准确性。
优选地，本发明的液相色谱条件如下：
色谱柱为YMC C18色谱柱：4.6×150mm，3μm；
检测器：紫外吸收光检测器，检测波长：210nm；
柱温：30～35℃；流速：0.8～1.2mL/min。
进一步优选地，所述液相色谱洗脱为等度洗脱，具体等梯度条件为：0～12min，77～82A，18～23B。
本发明的二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法可以针对二棕榈酰羟脯氨酸单一原料本身含量的测定，也可以针对含有二棕榈酰羟脯氨酸的各种产品制剂中的二棕榈酰羟脯氨酸含量的测定，例如以二棕榈酰羟脯氨酸纳米结构脂质体(DPHP-NLC)作为供试品，也可以制备得到相应的供试品溶液进行二棕榈酰羟脯氨酸含量的测定。
相比于单一原料的含量测定，DPHP-NLC制剂中除待测成分外还添加了很多其他辅料成分，检测条件需要使待测组分与其他组分完全分离，检测难度加大，检测的准确性更难控制。
优选地，二棕榈酰羟脯氨酸纳米结构脂质体供试品的具体制备方法如下：
将二棕榈酰羟脯氨酸纳米结构脂质体加甲醇超声溶解即可制备得到供试品溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，通过特定的十八烷基硅烷键合硅胶固定相和乙腈-磷酸水溶液的流动相控制，极大地改善了检测的峰型和分离度，色谱峰对称因子为0.96～0.99，提高了检测的准确性。
本发明的二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法中供试品溶液只需要溶剂溶解即可，无需进行复杂的酸水解和衍生化处理步骤，极大地简化了样品的制备，提升了检测效率，降低了检测成本。
本发明的二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法还具有良好的可重复性，误差范围RSD小于0.5％，专属性好，线性相关性高，方法回收率好，稳定性高。
附图说明
图1是实施例1中DPHP对照品的高效液相色谱图。
图2是实施例1中DPHP NLC供试品的高效液相色谱图。
图3是实施例2中DPHP对照品的高效液相色谱图。
图4是实施例2中DPHP NLC供试品的高效液相色谱图。
图5是实施例3中DPHP对照品的高效液相色谱图。
图6是实施例3中DPHP NLC供试品的高效液相色谱图。
图7是实施例4中DPHP NLC供试品的高效液相色谱图
图8是对比例1中DPHP NLC供试品的高效液相色谱图。
图9是对比例2中DPHP NLC供试品的高效液相色谱图。
图10是对比例3中DPHP NLC供试品的高效液相色谱图。
图11是空白溶液的高效液相色谱图。
图12是DPHP含量测定方法的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，包括如下步骤：
S1.配置对照品溶液；
S2.配置供试品溶液；
S3.将对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱进行检测，记录色谱图的峰面积，计算得到二棕榈酰羟脯氨酸的含量。
色谱条件为：
固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为色谱纯乙腈(A)-磷酸水溶液(B)，乙腈-磷酸水溶液的体积比为79：21。
其中，固定相为YMC C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)；磷酸水溶液的体积分数为0.08％，等度洗脱(0～12min，79％A，21％B)，检测器：紫外吸收光检测器；检测波长：210nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。理论板数按二棕榈酰羟脯氨酸峰计不低于5000。
溶液的配制：
(1)对照品溶液的制备：取DPHP对照品(纯度98.91％)约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，制成约1.0mg/mL的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：精密移取DPHP NLC 0.5mL，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图的峰面积。
对照品溶液的色谱图参见图1，供试品溶液的色谱图参见图2。
色谱峰对称因子为0.99。
实施例2
一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，包括如下步骤：
S1.配置对照品溶液；
S2.配置供试品溶液；
S3.将对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱进行检测，记录色谱图的峰面积，计算得到二棕榈酰羟脯氨酸的含量，
色谱条件为：
固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为色谱纯乙腈(A)-磷酸水溶液(B)，乙腈-磷酸水溶液的体积比为77：23。
其中，固定相为YMC C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)；磷酸水溶液的体积分数为0.1％，等度洗脱(0～12min，77％A，23％B)，检测器：紫外吸收光检测器；检测波长：210nm；柱温：35℃；流速：0.8mL/min；进样量：10μL，理论板数按二棕榈酰羟脯氨酸峰计不低于5000。
溶液的配制：
(1)对照品溶液的制备：取DPHP对照品(纯度98.91％)约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，制成约1.00mg/mL的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：精密移取与实施例1相同的DPHP NLC 0.5mL，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图的峰面积。
对照品溶液的色谱图参见图3，供试品溶液的色谱图参见图4。
色谱峰对称因子为0.96。
实施例3
一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，包括如下步骤：
S1.配置对照品溶液；
S2.配置供试品溶液；
S3.将对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱进行检测，记录色谱图的峰面积，计算得到二棕榈酰羟脯氨酸的含量，
色谱条件为：
固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为色谱纯乙腈(A)-磷酸水溶液(B)，乙腈-磷酸水溶液的体积比为82：18。
其中，固定相为YMC C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)；磷酸水溶液的体积分数为0.05％，等度洗脱(0～12min，82％A，18％B)，检测器：紫外吸收光检测器；检测波长：210nm；柱温：30℃；流速：1.2mL/min；进样量：10μL。理论板数按二棕榈酰羟脯氨酸峰计不低于5000。
溶液的配制：
(1)对照品溶液的制备：取DPHP对照品(纯度98.91％)约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，制成约1.00mg/mL的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：精密移取与实施例1相同的DPHP NLC 0.5ml，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图的峰面积。
对照品溶液的色谱图参见图5，供试品溶液的色谱图参见图6。
色谱峰对称因子为0.97。
其中，所述DPHP NLC中DPHP的含量测定计算式为：
公式中，C对照表示DPHP对照品浓度，A样品表示DPHP对照品溶液的峰面积，A样品表示DPHP供试品溶液的峰面积。
实例1至实例3，DPHP NLC中DPHP的含量分析结果见表1。
表1实例1-3样品含量测定的结果
从表1的数据可以看出，本发明的检测方法的准确性良好，相对误差RSD小于0.70％。
实施例4
一种DPHP的含量测定方法，采用高效液相色谱法对DPHP NLC中DPHP的含量进行检测，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈(A)-磷酸水溶液(B)。
其中，固定相为YMC C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)；磷酸水溶液的体积分数为0.1％，梯度洗脱(0～3min 55％A，5～15min 82％A，16～20min 55％A)，检测器：紫外吸收光检测器；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。
溶液的配制：
精密移取DPHP NLC 0.5ml，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
测定方法：精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪测定。记录色谱图的峰面积，供试品溶液的色谱图参见图7。
该系统流动相条件下基线不平。
方法学考察
对DPHP NLC含量测定方法的以下项目进行了验证，结果证明了本方法简便可行，符合含量测定方法学的有关要求。
1.专属性
(1)空白溶液的制备：精密移取空白NLC 0.5ml，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到空白溶液。
精密量取空白溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图的峰面积，色谱图测定结果见图10。
由图1-2、11可见，空白溶液在DPHP主峰对应保留时间处无吸收，说明空白辅料在该方法下不影响主峰的测定，且DPHP主峰与相邻杂质峰之间的分离度为4.01，大于1.5，表明此条件下各杂质峰与主峰之间分离度符合要求，该方法专属性好。
2.线性
线性贮备液的制备：取DPHP对照品约10mg，精密称定，置10mL容量瓶，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，作为线性贮备液(浓度约1.00mg/mL)。
精密量取上述线性贮备液2、5、10、15、20、30μL，注入液相色谱仪，记录色谱图的峰面积。以浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积(mV·s)为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数。得到线性方程式为Y＝159805x+2543.5(Y表示峰面积，X表示浓度)，r＝1，表明线性良好。结果见图12所示。
3.精密度
分别精密移取DPHP NLC 0.5ml，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液，平行配制6份。分别精密吸取6份供试品溶液各10μL，测定峰面积，RSD为0.46％。表明方法精密度良好，结果见表2。
表2精密度结果
4.回收率
分别精密移取空白NLC 0.5mL，加入适量DPHP对照品贮备液，用甲醇定容，得到加药浓度分别为DPHP-NLC制剂药物浓度80％、100％、120％的三种供试品溶液，各浓度平行配制3份。分别精密移取10μL供试品溶液进样，按含量测定方法测定，记录色谱图的峰面积。计算测得量和回收率，实验结果见表3。由结果可见，平均回收率为98.95％，RSD为0.54％，说明该方法回收率良好。
表3回收率实验结果
5.溶液稳定性
取实施例1下的DPHP NLC供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12h进样10μL，考察本品含量测定高效液相法的溶液稳定性，结果见表4。由结果可见，RSD为0.37％，表明在此分析方法下供试品溶液室温放置12h较稳定。
表4溶液稳定性结果
对比例1
一种DPHP的含量测定方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱法对DPHP NLC中DPHP的含量进行检测，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈(A)-水溶液(B)。
其中，固定相为YMC C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)；等度洗脱(0～12min，79％A，21％B)，检测器：紫外吸收光检测器；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。
溶液的配制：
精密移取DPHP NLC 0.5ml，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
测定方法：精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪测定。记录色谱图的峰面积，供试品溶液的色谱图参见图8。
该系统流动相条件下色谱峰对称因子为2.92，色谱峰对称性差，拖尾严重。
对比例2
一种DPHP的含量测定方法，采用高效液相色谱法对DPHP NLC中DPHP的含量进行检测，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)。
其中，固定相为YMC C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)；甲酸水溶液的体积分数为0.1％，等度洗脱(0～12min，79％A，21％B)，检测器：紫外吸收光检测器；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。
溶液的配制：
精密移取DPHP NLC 0.5ml，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
测定方法：精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪测定。记录色谱图的峰面积，供试品溶液的色谱图参见图9。
该系统流动相条件下色谱峰理论塔板数低于5000，色谱峰对称性差，前延严重。
对比例3
一种DPHP的含量测定方法，采用高效液相色谱法对DPHP NLC中DPHP的含量进行检测，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇(A)-0.1％磷酸水溶液(B)。
其中，固定相为YMC C18色谱柱(4.6×150mm，3μm)；磷酸水溶液的体积分数为0.1％，等度洗脱(0～12min，79％A，21％B)，检测器：紫外吸收光检测器；柱温：30℃；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。
溶液的配制：
精密移取DPHP NLC 0.5ml，置10mL量瓶中，加甲醇超声5min溶解，定容至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
测定方法：精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪测定。记录色谱图的峰面积，供试品溶液的色谱图参见图10。
该系统流动相条件下色谱峰与杂质峰未能分离。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.配置对照品溶液；
S2.配置供试品溶液；
S3.将对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱进行检测，记录色谱图，计算得到二棕榈酰羟脯氨酸的含量。
其中，S3中高效液相色谱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-磷酸水溶液，所述乙腈-磷酸水溶液的体积比为70～85：15～30。
2.如权利要求1所述二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，所述乙腈-磷酸水溶液的体积比为77～82：18-23。
3.如权利要求1所述二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，所述对照品溶液的配置方法如下：
取二棕榈酰羟脯氨酸对照品，加醇溶液超声溶解，制备得到0.80～1.20mg/mL的对照品溶液，其中DPHP对照品的纯度≥98.91％。
4.如权利要求3所述二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，所述醇溶液为甲醇溶液。
5.如权利要求1所述二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，所述磷酸水溶液的体积分数为0.05～0.10％。
6.如权利要求1所述二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，所述磷酸水溶液的体积分数为0.08％。
7.如权利要求1所述二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，所述液相色谱条件如下：
色谱柱为YMC C18色谱柱：4.6×150mm，3μm；
检测器：紫外吸收光检测器，检测波长：210nm；
柱温：30～35℃；流速：0.8～1.2mL/min。
8.如权利要求5所述二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，所述液相色谱洗脱为等度洗脱，具体等梯度条件为：0-12min，77～82：18～23。
9.如权利要求1～6任意一项所述二棕榈酰羟脯氨酸的含量测定方法，其特征在于，所述供试品为二棕榈酰羟脯氨酸纳米结构脂质体。
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