CN111458435A - 直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法 - Google Patents

直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋氨酸亚砜的检测方法，具体涉及一种直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法。步骤如下：(1)配制蛋氨酸亚砜对照品溶液；(2)将对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标构建标准曲线；(3)配制供试品溶液；(4)将供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算蛋氨酸亚砜的含量；采用氨基键合硅胶为固定相的色谱柱；磷酸水‑乙腈体系为流动相；等度洗脱；检测波长210nm；流速0.7mL/min；柱温35℃。该方法专属性强、灵敏度高、重复性好，解决了处方中其他氨基酸成分干扰，以及因衍生反应导致测定结果不准确等技术难题，保证了产品质量。

Description

直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法
技术领域
本发明涉及蛋氨酸亚砜的检测方法，具体涉及一种直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法。
背景技术
复方氨基酸注射液处方中含有甲硫氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸等几种到几十种氨基酸，其作为重要的肠外营养药，广泛应用于临床，满足患者体内氨基酸需要。其中，甲硫氨酸作为人体内必需氨基酸，因其结构中含有巯基，易被氧化降解成蛋氨酸亚砜，对人体健康有害。蛋氨酸亚砜的结构式如下：
Figure BDA0002456519960000011
蛋氨酸亚砜
因复方氨基酸类产品处方成分较复杂，并且大多数成分结构近似，很容易干扰蛋氨酸亚砜的测定。目前可检索到的方法大多采用柱前衍生或柱后衍生法进行检测，或使用离子对试剂梯度洗脱方式检测，对实验人员的操作要求较高，色谱柱的损伤较大，因此，需建立一种专属性强、简便可行的检测方法，用于控制复方氨基酸产品中蛋氨酸亚砜的含量。
发明内容
针对以上不足，本发明的目的是提供一种直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，无需衍生化前处理，流动相采用常见溶剂，色谱柱的使用寿命长，具有准确、简便、专属性强、灵敏度高、重复性好的特点。
本发明所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，包括如下步骤：
(1)配制蛋氨酸亚砜对照品溶液；
(2)将对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标构建标准曲线；
(3)配制供试品溶液；
(4)将供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算蛋氨酸亚砜的含量；
其中，液相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱：采用氨基键合硅胶色谱柱；
流动相：磷酸水-乙腈体系；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.65-0.75mL/min；
检测波长：210nm；
柱温：30-40℃；
进样量：5-100μL。
其中：
优选地，所述的氨基键合硅胶色谱柱选自Hichrom氨基柱、Thermo Hypersil氨基柱、月旭Ultimate XB氨基柱、Merck Purospher STAR氨基柱、Merck LiChrospher氨基柱、Phenomenex Luna氨基柱、岛津Inertsil氨基柱、COSMOSIL氨基柱、YMC-Pack氨基柱、Agilent ZORBAX氨基柱、Waters Spherisorb氨基柱或SHISEIDO Capcell Pak氨基柱中的一种。
所述的色谱柱长度为250mm、150mm、100mm或80mm。
所述的流动相中，磷酸水的pH为2.7-2.9，优选2.8。
所述的流动相中，磷酸水与乙腈的体积比为30-36:70-64，优选33:67。
优选地，所述的流速为：0.7mL/min。
优选地，所述的柱温为：35℃。
优选地，所述的进样量：20μL。
所述的供试品溶液的配制方法为：精密量取复方氨基酸注射液，加流动相稀释制成含甲硫氨酸0.1-1.0mg/mL的溶液，作为供试品溶液。
所述的对照品溶液的配制方法为：精密称取蛋氨酸亚砜适量，加流动相溶解并定量稀释制成约含5μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明提供的方法专属性强、灵敏度高、重复性好，解决了处方中其他氨基酸成分干扰的技术难题。
2、本发明采用的流动相为常见的磷酸水和乙腈体系，无其他离子对试剂或缓冲盐，能较大程度的延长色谱柱的使用寿命，大大降低成本。
3、本发明提供的方法操作简便、准确性高，无需衍生化前处理，避免了其他检测方法中采用氨基酸衍生程序测定导致测定结果不准确、平行性差等问题，保证了复方氨基酸类产品的质量。
附图说明
图1为本发明的阴性空白溶液的HPLC图；
图2为本发明的蛋氨酸亚砜对照品溶液的HPLC图；
图3为本发明的供试品溶液的HPLC图；
图4为本发明的加标供试品溶液的HPLC图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不仅仅局限于下述实施例。
实施例1
1、色谱条件
色谱柱：Hichrom氨基柱(250×4.6mm，5μm)，检测波长：210nm，流速0.7mL/min，柱温：35℃，进样量20μL。
2、溶液制备
2.1流动相：水(用磷酸调节pH值至2.8)-乙腈(33：67)。
2.2供试品溶液：精密量取复方氨基酸注射液，加流动相稀释制成含甲硫氨酸0.56mg/mL的溶液，作为供试品溶液。
2.3对照品溶液：精密称取蛋氨酸亚砜适量，加流动相溶解并定量稀释制成约含5μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
3、测定方法
精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
(1)专属性试验
阴性空白溶液的制备：按制剂处方量配制不含甲硫氨酸的溶液，作为空白辅料溶液。从中取2ml，用流动相稀释定容至20mL。
未破坏样品的制备：取供试样品2mL，用流动相稀释定容至20mL。
酸破坏样品的制备：取供试样品2mL，加入1mol/L盐酸0.2mL，加水10mL，水浴加热2h，加入1mol/L氢氧化钠溶液中和，流动相定容至20mL。
碱破坏样品的制备：取供试样品2mL，加入1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL，加水10mL，水浴加热2h，加入1mol/L盐酸中和，流动相定容至20mL。
氧化样品的制备：取供试样品2mL，加入30％过氧化氢0.2mL，加水10mL，水浴加热2h，流动相定容至20mL。
高温样品的制备：取供试样品2mL，加水10mL，水浴加热2h，流动相定容至20mL。
光照样品的制备：取光照24h(光照度约5000Lx、近紫外能量约100μW/cm2)的供试样品2mL，流动相定容至20mL。
分别取上述样品，依法检验，结果见表1。
表1蛋氨酸亚砜强制降解试验结果汇总
样品名称 蛋氨酸亚砜峰面积 结果
未破坏 11029 ——
酸 13588 蛋氨酸亚砜含量基本无变化，与相邻峰的分离良好
碱 13914 蛋氨酸亚砜含量基本无变化，与相邻峰的分离良好
氧化 98144 蛋氨酸亚砜含量明显升高，与相邻峰的分离良好
高温 13248 蛋氨酸亚砜含量基本无变化，与相邻峰的分离良好
光照 10803 蛋氨酸亚砜含量基本无变化，与相邻峰的分离良好
结论：阴性空白溶液不影响蛋氨酸亚砜的检测，在酸、碱、氧化、高温、光照降解试验色谱图中，蛋氨酸亚砜峰与相邻峰之间分离度均符合要求；酸、碱、高温、光照降解试验中，蛋氨酸亚砜含量基本无变化；氧化降解试验蛋氨酸亚砜含量升高很多。由此可见，甲硫氨酸对氧敏感，易降解为蛋氨酸亚砜。
(2)定量限
取已知浓度的蛋氨酸亚砜对照品溶液，逐级稀释。计算蛋氨酸亚砜峰的信号峰高与基线噪音的比值，即S/N值，S/N在8-12时对应的浓度即为其定量限浓度，平行配制6份定量限浓度溶液，依法检测，记录色谱图，蛋氨酸亚砜峰面积的RSD应不大于5.0％。结果见表2。
表2蛋氨酸亚砜的定量限测定结果
Figure BDA0002456519960000041
结论：蛋氨酸亚砜的定量限为0.3690μg/mL，RSD符合要求。
(3)线性范围
取蛋氨酸亚砜对照品适量，用流动相溶解并定量稀释制成0.3690、1.9681、3.9362、4.9230、5.9040μg/mL的溶液，作为线性溶液1-5。
分别取上述样品，依法检验，以蛋氨酸亚砜的浓度C(μg/mL)为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程。结果见表3。
表3蛋氨酸亚砜线性测定结果
浓度(μg/mL) 峰面积
0.3690 4444
1.9681 21863
3.9362 43590
4.9230 54841
5.9040 65080
线性方程：A＝11002C+336.61 相关系数：0.9999
结论：蛋氨酸亚砜在0.3690-5.9040μg/mL范围，线性关系良好，线性相关系数R为0.9999，符合要求。
(4)精密度
取蛋氨酸亚砜对照品适量，加入供试样品中，加流动相溶解并稀释制成一定浓度的加标供试品溶液，平行制备6份，依法检验，要求6次测定结果的RSD≤3.0％，以证实方法具有良好的精密度，结果见表4。
表4蛋氨酸亚砜检查精密度测定结果
溶液序号 蛋氨酸亚砜(mg/L)
1 64.1
2 64.4
3 63.8
4 64.0
5 63.7
6 63.7
RSD(n＝6) 0.43
结论：精密度6次测定结果，蛋氨酸亚砜含量的RSD小于3.0％，符合要求。
(5)准确度
在供试样品中加入定量限、60％、80％、100％不同限度浓度的蛋氨酸亚砜，测定回收率所得。要求回收率在90-108％之间，以证实该方法具有良好的准确度，结果见表5。
表5蛋氨酸亚砜回收率测试结果
Figure BDA0002456519960000051
Figure BDA0002456519960000061
结论：蛋氨酸亚砜回收率在92.59-99.35％之间，符合要求。
(6)溶液稳定性
考察蛋氨酸亚砜对照品溶液与供试品溶液随时间的变化规律，对照品溶液与供试品溶液室温放置0、3、6、12、18、24h，依法检测。要求对照品溶液与供试品溶液中蛋氨酸亚砜峰面积的RSD≤10.0％，结果见表6。
表6蛋氨酸亚砜溶液稳定性试验结果
时间(h) 对照品溶液 供试品溶液
0 52694 69219
3 52699 68714
6 52504 68447
12 52499 68915
18 52699 69276
24 52776 69368
RSD％ 0.22 0.52
结论：对照品溶液与供试品溶液室温放置24h内，蛋氨酸亚砜峰面积的RSD小于10.0％，溶液稳定性良好。
(7)耐用性
通过改变不同的柱温、流速、流动相比例及pH值、更换不同品牌色谱柱等来评估测定条件参数有微小变动时，测定结果的影响程度，结果见表7。
表7蛋氨酸亚砜耐用性试验结果
Figure BDA0002456519960000071
结论：柱温30-40℃、流速0.65-0.75mL/min、流动相pH值2.7-2.9、流动相比例30-36:70-64之间、更换不同品牌色谱柱，蛋氨酸亚砜含量的RSD均符合要求。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对于熟悉本领域的技术人员，在本发明的基础上，依然可以进行一定程度的方法优化，因此凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)配制蛋氨酸亚砜对照品溶液；
(2)将对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标构建标准曲线；
(3)配制供试品溶液；
(4)将供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算蛋氨酸亚砜的含量；
其中，液相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱：采用氨基键合硅胶色谱柱；
流动相：磷酸水-乙腈体系；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.65-0.75mL/min；
检测波长：210nm；
柱温：30-40℃；
进样量：5-100μL。
2.根据权利要求1所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的氨基键合硅胶色谱柱选自Hichrom氨基柱、Thermo Hypersil氨基柱、月旭Ultimate XB氨基柱、Merck Purospher STAR氨基柱、Merck LiChrospher氨基柱、Phenomenex Luna氨基柱、岛津Inertsil氨基柱、COSMOSIL氨基柱、YMC-Pack氨基柱、Agilent ZORBAX氨基柱、Waters Spherisorb氨基柱或SHISEIDO Capcell Pak氨基柱中的一种。
3.根据权利要求1所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的色谱柱长度为250mm、150mm、100mm或80mm。
4.根据权利要求1所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的流动相中，磷酸水的pH为2.7-2.9。
5.根据权利要求4所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的流动相中，磷酸水的pH为2.8。
6.根据权利要求1所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的流动相中，磷酸水与乙腈的体积比为30-36:70-64。
7.根据权利要求6所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的流动相中，磷酸水与乙腈的体积比为33:67。
8.根据权利要求1所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的流速为：0.7mL/min。
9.根据权利要求1所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的柱温为：35℃。
10.根据权利要求1所述的直接测定复方氨基酸注射液中氧化产物蛋氨酸亚砜的方法，其特征在于：所述的进样量：20μL。
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