CN109374791A - 一种用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的方法，配制乙酸、丙酸、丙烯酸对照品溶液，分别或共同置于容器中；取供试品溶液注入高效液相色谱仪，供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中乙酸、丙酸、丙烯酸的出峰时间及峰形进行比对，判定供试品溶液是否含有乙酸、丙酸、丙烯酸，将峰面积数值代入线性方程，计算出盐酸瑞芬太尼中酸的含量。本方法通过筛选波长，找到了三者的最大吸收，并利用乙腈/水二元流动相，通过调节pH值或者调节两相配比，选择合适的PH值及两相比例来调控乙酸、丙酸、丙烯酸在色谱柱上的保留时间，提高乙酸、丙酸、丙烯酸的分离度及理论塔板数，改善色谱峰型，且空白溶剂不干扰三者的检测。

Description

一种用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的 方法

技术领域

本发明涉及一种测定盐酸瑞芬太尼中酸残留的方法，具体为采用高效液相色谱法检测盐酸瑞芬太尼中乙酸、丙酸、丙烯酸的残留的方法。

背景技术

盐酸瑞芬太尼(Remifentanil Hydrochloride)，化学名称为4-(甲氧羰基)-4-[(1-氧丙基)苯氨基]-1-哌啶丙酸甲酯盐酸盐，属于新型阿片类镇痛药，具有起效快、体内无蓄积、血药浓度平稳、作用时间短、镇痛效价强、病人用药后恢复迅速、不良反应轻等优点。临床上主要用于全麻诱导和全麻中维持镇痛。

结构式如下所示：

从上述结构式中可以看出，盐酸瑞芬太尼存在一个丙酸甲酯的支链，现有技术中多采用丙烯酸甲酯作为加成试剂，引入该支链，参见(毕小玲，盐酸瑞芬太尼的合成，中国化学药物杂志，第12卷，第六期，P354-354)。

本申请人采用丙烯酸甲酯作为加成试剂合成盐酸瑞芬太尼，对成品质量进行检测时发现盐酸瑞芬太尼成品中往往会出现少量的不明杂质峰，通过进一步研究确证这些杂质峰包括乙酸、丙酸和丙烯酸。乙酸是反应过程中的溶剂残留，而丙酸和丙烯酸则是加成试剂丙烯酸甲酯水解后得到的产物。2015版中国《药典》通则0861残留溶剂测定法中附表1对乙酸溶剂残留的含量进行了限定，但并未对丙酸和丙烯酸的含量进行限定，也无相应测定方法指导，虽然这三种酸的含量非常微小，但其残留量的控制对提高产品质量却非常重要，是影响产品质量的重要因素。且现有技术中并未有对盐酸瑞芬太尼产品中的上述三种酸残留的测定方法的记载。

发明内容

本发明的技术方案利用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的检测方法，利用高效液相色谱仪，通过外标法对盐酸瑞芬太尼中的乙酸、丙酸、丙烯酸进行定性、定量检测。本方法通过筛选波长，找到了三者的最大吸收，并利用乙腈/水二元流动相(其中水相中添加磷酸二氢钾)，通过调节pH值或者调节两相配比，选择合适的pH值及两相比例来调控乙酸、丙酸、丙烯酸在色谱柱上的保留时间，提高乙酸、丙酸、丙烯酸的分离度及理论塔板数，改善色谱峰型，且空白溶剂不干扰三者的检测。本方法简单，高效，该方法同时检测了三种酸，为控制盐酸瑞芬太生产工艺中乙酸、丙酸、丙烯酸的检测提供了质量标准的检测方法。具体检测方法如下：

一种用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的方法，所述的酸为乙酸、丙酸、丙烯酸，包括如下步骤：

(1)制备对照物质：量取乙酸对照品溶液，丙酸对照品溶液，丙烯酸母对照品溶液分别、以及共置量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀；

(2)制备供试品溶液：取盐酸瑞芬太尼原料用流动相溶解、定容，摇匀；

(3)混合对照品溶液：精密量取乙酸对照品溶液1ml，丙酸对照品溶液1ml，丙烯酸母对照品溶液0.1ml共置10ml量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，对照品溶液浓度如下：

Cr_乙酸＝0.05mg/ml

Cr_丙酸＝0.03mg/ml

Cr_丙烯酸＝0.0053mg/ml

系统适用性试验

取系统适应性试验溶液(对照溶液)进样6次，结果如图表1所示：

结果：丙烯酸与乙酸的分离度为17.1，丙烯酸与乙酸的分离度为4.6，乙酸的理论板数为19018，丙酸的理论板数为26421，丙稀酸的理论板数为24749。

重复进样中乙酸峰面积RSD为0.2％，丙酸峰面积RSD为0.4％，丙烯酸峰面积RSD为0.2％。

(4)高效液相色谱法测定：分别对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以乙酸、丙酸、丙烯酸为横坐标，相应的等面积为纵坐标进行线性回归分析，制得线性方程，取供试品溶液注入高效液相色谱仪，供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中乙酸、丙酸、丙烯酸的出峰时间及峰形进行比对，判定供试品溶液是否含，乙酸、丙酸、丙烯酸将供试品色谱图中乙酸、丙酸、丙烯酸峰面积数值代入线性方程，即可计算出盐酸瑞芬太尼中酸的含量，

取混合对照溶液和供试品溶液分别进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各溶剂峰，公式如下：

式中：

X：供试品溶液中待测溶剂；

As：供试品溶液中待测溶剂的峰面积；

Ar：对照品溶液中待测溶剂的峰面积；

Cr：对照品溶液中待测溶剂的浓度；

Cs：供试品溶液的浓度。

所述的对照品中乙酸、丙酸、丙烯酸的浓度分别为：Cr_乙酸＝0.05mg/ml、Cr_丙酸＝0.03mg/ml、Cr_丙烯酸＝0.0053mg/ml。

上述检测方法中，上述的色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；流速：0.8-1.2ml/min；柱温：35-45℃；进样体积：20μL；流动相：磷酸二氢钾溶液：乙腈按体积比5-100：3-10的混合物，该磷酸二氢钾溶液的pH＝2.5-3.0；波长：220-230nm。

进一步优选方案中的色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；流速：1ml/min；柱温：40℃℃；进样体积：20μL；流动相：0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液：乙腈＝95:5的混合物，该磷酸二氢钾溶液的pH＝3.0

波长：225nm。

本领域技术人员知晓，上述检测的乙酸、丙酸、丙烯酸中，因同时含有羧基基团，理化性质相似，本申请人在常规检测过程中，紫外线吸收接近，因此难以检测出。但采用本申请的检测方法，即采用本申请的检测条件，调控了乙酸、丙酸、丙烯酸在色谱柱上的保留时间，提高乙酸、丙酸、丙烯酸的分离度及理论塔板数，改善色谱峰型，使三种酸在检测时分离，并准确定量。

附图说明

图1为实施例1中样品RF8170901的高效液相图。

图2为实施例1中样品RF8171001的高效液相图。

图3为实施例1中样品RF8171002的高效液相图。

图4为混合对照品溶液平行6次进样试验的高效液相图。

具体实施方式

实施例1

一种用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的方法，所述的酸为乙酸、丙酸、丙烯酸，包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液：量取乙酸对照品，丙酸对照品，丙烯酸对照品分别、以及共置量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，(三批样品，进样两针，取平均值)；

(2)制备供试品溶液：取盐酸瑞芬太尼原料用流动相溶解、定容，摇匀，(三批样品，进样两针，取平均值)；

(3)高效液相色谱法测定：分别取对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以乙酸，丙酸，丙烯酸浓度为横坐标，相应的等面积为纵坐标进行线性回归分析，制得线性方程，取供试品溶液注入高效液相色谱仪，供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中乙酸，丙酸，丙烯酸的出峰时间及峰形进行比对，判定供试品溶液是否含乙酸，丙酸，丙烯酸，将供试品色谱图中乙酸，丙酸，丙烯酸峰面积数值代入线性方程，即可计算出乙酸，丙酸，丙烯酸的含量。

取混合对照品溶液和供试品溶液分别进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各溶剂峰，公式如下取混合对照品溶液和供试品溶液分别进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各溶剂峰，公式如下：

取混合对照溶液和供试品溶液分别进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各溶剂峰，公式如下：

式中：

X：供试品溶液中待测溶剂；

As：供试品溶液中待测溶剂的峰面积；

Ar：对照品溶液中待测溶剂的峰面积；

Cr：对照品溶液中待测溶剂的浓度；

Cs：供试品溶液的浓度。

色谱条件：

色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm×5μm YMC Hydrosphere；

流速：1ml/min；

检测器：UV；

柱温：40℃；

进样体积：20μL；

流动相：0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液(pH＝3.0)：乙腈(95:5)；

波长：225nm；

试剂及样品

乙酸对照品1803141效期至2019.05.01纯度≥99.8％西陇科学股份有限公司

丙酸对照品STBF9605V效期至2020.04.30纯度≥99.5％Sigma-Aldrior

丙烯酸对照品65JSJAS效期至2020.05.14纯度≥99.0％东京仪成工业株式会社

流动相MP-A51806015有效期至2018.07.16

盐酸瑞芬太尼三批：RF8170901、RF8171001、RF8171002

制备对照品溶液：

乙酸对照品溶液：精密量取乙酸对照品47μl(约50mg)置100ml量瓶中，并用流动相稀释至刻度。

丙酸对照品溶液：精密量取丙酸对照品30μl(约30mg)置100ml量瓶中，并用流动相稀释至刻度。

丙烯酸对照品溶液：精密量取丙烯酸对照品50μl(约53mg)置100ml量瓶中，并用流动相稀释至刻度。

混合对照品溶液：精密量取乙酸对照品溶液1ml，丙酸对照品溶液1ml，丙烯酸对照品溶液0.1ml共置10ml量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀。

对照品溶液的浓度为：

Cr_乙酸＝0.05mg/ml；

Cr_丙酸＝0.03mg/ml；

Cr_丙酸＝0.0053mg/ml；

样品溶液的浓度为：

RF8170901:Cs＝9.993mg/ml

RF8171001:Cs＝9.982mg/ml

RF8171002:Cs＝10.102mg/ml

系统适用性溶液：取混合对照品溶液。

样品溶液制备：

分别精密称量RF8170901、RF8171001、RF8171002的盐酸瑞芬太尼原料99.93mg、99.82mg、101.02mg，用流动相稀释至10ml。

进样，记录数据，计算结果如下：

RF8170901：Ar＝11826.078,Cr_乙酸＝0.05mg/ml，As₁＝236，As₂＝237，Cs＝9.993mg/ml将上述数据代入公式：取两次的平均值，得乙酸含量为：99.8ppm，丙酸和丙烯酸未检出；

同理：

RF8171001中乙酸含量为：54.6ppm，丙酸和丙烯酸未检出；

RF8171002中乙酸含量为：187.9ppm丙酸和丙烯酸未检出；

系统适用性结果：乙酸RSD为0.5％；丙酸RSD为0.5％；丙烯酸RSD为0.3％；

结论：样品合格。

在上述技术方案的基础上，本申请考察了准确度、精密度、专属性、检测限、定限量、线性及范围、耐用性的试验。其中，准确度、精密度、专属性、检测限、定限量、线性及范围的试验参考实施例1的技术方案。

准确度

制备对照品溶液：

供试品溶液(80％)：取本品100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入乙酸对照品溶液0.8ml，丙酸对照品溶液0.8ml，丙烯酸对照品溶液0.08ml，并用流动相溶解并定容，平行配制3份。

供试品溶液(100％)：取本品100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入乙酸对照品溶液1ml，丙酸对照品溶液1ml，丙烯酸对照品溶液0.1ml,并用流动相溶解并定容，平行配制3份。

供试品溶液(120％)：取本品100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入乙酸对照品溶液1.2ml，丙酸对照品溶液1.2ml，丙烯酸对照品溶液0.12ml，并用流动相溶解并定容，平行配制3份。

空白溶液：按照供试品溶液制备。

混合对照溶液：按照混合对照溶液制备。

测定：

九份供试品溶液及空白溶液，混合对照品溶液各进2针。

可接受标准：

乙酸、丙酸的回收率为90％-108％(n＝9)，丙烯酸回收率为85％-110％(n＝9)，它们回收率的RSD≤2.0％(n＝9)。

表2乙酸的回收率

表3丙酸的回收率

表4丙烯酸的回收率

精密度

乙酸对照品溶液：精密量取乙酸47μl(约50mg)置100ml量瓶中，并用流动相稀释至刻度。

丙酸对照品溶液：精密量取丙酸30μl(约30mg)置100ml量瓶中，并用流动相稀释至刻度。

丙烯酸对照品溶液：精密量取丙烯酸50μl(约53mg)置100ml量瓶中，并用流动相稀释至刻度。

混合对照品溶液：精密量取乙酸对照品溶液1ml，丙酸对照品溶液1ml，丙烯酸母对照品溶液0.1ml共置10ml量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，对照品溶液浓度如下：

Cr_乙酸＝0.05mg/ml

Cr_丙酸＝0.03mg/ml

Cr_丙烯酸＝0.0053mg/ml。

供试品溶液：取本品100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入乙酸对照品溶液1ml，丙酸对照品溶液1ml，丙烯酸对照品溶液0.1ml，并用流动相稀释至刻度。平行配制6份。

测定：

重复性：六份的供试品溶液及混合对照溶液各进2针。

中间精密度：不同的人，不同的时间按照重复性方法重新配制六份供试品溶液及混合对照溶液，进行中间精密度的测定，计算乙酸、丙酸和丙烯酸的含量。

可接受标准：

重复性：乙酸、丙酸的含量的RSD(n＝6)≤10％，丙烯酸含量的RSD(n＝6)≤15％；中间精密度：乙酸、丙酸含量的RSD(n＝6)≤10％，丙烯酸含量的RSD(n＝6)≤15％，重复性及中间精密度乙酸、丙酸含量RSD(n＝12)≤10％，丙烯酸含量的RSD(n＝12)≤15％。

表5重复性及中间精密度数据

专属性

空白溶剂，乙酸对照溶液，丙酸对照溶液，混合对照溶液，样品溶液，样品与对照混合溶液各进1针。a空白溶剂在乙酸、丙酸及丙烯酸的保留时间处未出峰；b乙酸、丙酸及丙烯酸的保留时间与混合对照溶液及样品混合溶液中的保留时间一致；具体数据见下表：

表6专属性数据

检测限

逐步稀释乙酸、丙酸、丙烯酸对照溶液各进一针，记录当峰高与噪声的比值约等于3左右时所进溶液的浓度，并换算成在样品中的含量即为检测限。具体数据见下表：

表7各待测溶剂的检测限

定限量

逐步稀释乙酸、丙酸、丙烯酸对照溶液各进一针，记录当峰高与噪声的比值≥10时所进溶液的浓度，并换算成在样品中的含量即为定量限。具体数据见下表：

表8各待测溶剂的定量限

线性及范围

分别取乙酸、丙酸、丙烯酸定量限浓度溶液，50％限度溶液，80％限度溶液，100％限度溶液，120％限度溶液各进两针，进行浓度与峰面积响应值之间的线性回归分析，并计算相关系数，相关系数≥0.9900。具体数据见下表：

表9各待测溶剂的定量限

耐用性

取样品+混合对照溶液分别在改变流速至0.8ml/ml，改变流速至1.2ml/ml，改变柱温至45℃，改变柱温至35℃，改变流动相PH：0.03mol/L的磷酸二氢钾(pH＝3.5)：乙腈(95:5)

改变流动相pH：为0.03mol/L的磷酸二氢钾(pH＝2.5)：乙腈(95:5)

改变流动相比例为0.03mol/L的磷酸二氢钾(pH＝3.0)：乙腈(93:7)

改变流动相比例为0.03mol/L的磷酸二氢钾(pH＝3.0)：乙腈(97:3)后，乙酸、丙酸、丙烯酸的分离度均大于1.5，理论板数均大于2000；具体数据见下表：

表10耐用性数据

Claims (4)

1.一种用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的方法，所述的酸为乙酸、丙酸、丙烯酸，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备对照品：量取乙酸对照品溶液，丙酸对照品溶液，丙烯酸对照品溶液分别置于不同量瓶中，用流动相稀释、定容，摇匀；或将上述三种对照品共置量瓶中，用流动相稀释、定容，摇匀；

(2)制备供试品溶液：取盐酸瑞芬太尼原料用流动相溶解、定容，摇匀；

(3)高效液相色谱法测定：分别取对照品注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以乙酸、丙酸、丙烯酸浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归分析，制得线性方程；

取供试品溶液注入高效液相色谱仪，供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中乙酸、丙酸、丙烯酸的出峰时间及峰形进行比对，判定供试品溶液含有乙酸、丙酸、丙烯酸，将供试品色谱图中乙酸、丙酸、丙烯酸峰面积数值代入线性方程，即可计算出盐酸瑞芬太尼中酸的含量；

取混合对照品和供试品溶液分别进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各溶剂峰，公式如下：

式中：

X：供试品溶液中待测溶剂；

As：供试品溶液中待测溶剂的峰面积；

Ar：对照品溶液中待测溶剂的峰面积；

Cr：对照品溶液中待测溶剂的浓度；

Cs：供试品溶液的浓度。

2.根据权利要求1所述的用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的方法，其特征在于，所述的对照品中乙酸、丙酸、丙烯酸的浓度分别为：Cr_乙酸＝0.05mg/ml、Cr_丙酸＝0.03mg/ml、Cr_丙烯酸＝0.0053mg/ml。

3.根据权利要求1所述的用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的方法，其特征在于，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；流速：0.8-1.2ml/min；柱温：35-45℃；进样体积：20μL；流动相：0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液：乙腈按体积比5-100：3-10的混合物，该磷酸二氢钾溶液的pH＝2.5-3.0；波长：220-230nm。

4.根据权利要求1所述的用高效液相色谱法测定盐酸瑞芬太尼原料中酸残留的方法，其特征在于，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；流速：1ml/min；柱温：40℃；进样体积：20μL；流动相：0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液：乙腈＝95:5的混合物，该磷酸二氢钾溶液的pH＝3.0波长：225nm。