CN107490629A - 一种阿法替尼中间体的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种阿法替尼中间体的高效液相色谱分析方法，用于阿法替尼中间体的质量控制，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱(C18，4.6×250mm，3μm)，以浓度为0.005～0.03mol/L的醋酸盐水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，梯度洗脱，以检测波长为240nm，柱温为25～35℃，进行高效液相色谱法分析测定。本发明的分析检测方法可以有效的将阿法替尼中间体及其杂质分开，而且该方法具有分离度高，重复性及耐用性好，分析时间短，操作简单，结果稳定可靠的优点。

Description

一种阿法替尼中间体的高效液相色谱分析方法
技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱分析方法，尤其是一种阿法替尼中间体的高效液相色谱分析方法。
背景技术
阿法替尼为苯胺奎那唑啉化合物，是一种不可逆的EGFR-HER2双重酪氨酸激酶受体抑制剂，它能不可逆的与EGFR-HER2酪氨酸激酶结合，抑制其酪氨酸激酶活性，进而阻断EGFR-HER2主导的肿瘤细胞信号传导，抑制肿瘤细胞的转移与增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。
P-[2-[[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]氨基]-2-氧代乙基]膦酸二乙酯是合成阿法替尼的重要中间体之一，其化学式为C24H27ClFN4O6P，结构式为：
文献中尚未公开该中间体的分析检测方法，但该中间体的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着终产品阿法替尼的质量，所以建立一种稳定有效的分析检测方法对该中间体进行质量控制是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿法替尼中间体的高效液相色谱分析方法，用于阿法替尼中间体的质量控制。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验，最终获得如下技术方案：
一种阿法替尼中间体的高效液相色谱分析方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以浓度为0.005～0.03mol/L的醋酸盐水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱，包括以下步骤：
a、取阿法替尼中间体适量，加流动相B溶解，配制成每1ml含阿法替尼中间体0.06～0.43mg的样品溶液；
b、设置流动相流速为0.9～1.1ml/min，检测波长240nm，柱温为25～35℃；
c、取a的样品溶液10μl注入液相色谱仪，执行梯度洗脱程序，完成阿法替尼中间体的分析检测；
所述色谱柱的规格为C18，4.6×250mm，3μm。
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
进一步的，梯度洗脱的设置优选为：
所述的样品溶液浓度优选为0.3mg/ml。
所述的醋酸盐水溶液的浓度优选为0.02mol/L。
所述的醋酸盐优选为醋酸铵或醋酸钠，进一步的优选为醋酸铵。
所述流动相的流速优选为1.0ml/min，柱温优选为30℃。
实施例中对本发明的方法进行了详细说明，并对本发明的方法进行了方法验证，结果证明：本发明涉及的分析方法，可以有效的将阿法替尼中间体及其杂质分开，而且该方法分离度高，重复性及耐用性好，分析时间短，操作简单，结果稳定可靠，从而可用于阿法替尼中间体的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障。
附图说明
图1实施例1的阿法替尼中间体HPLC图谱。
图2实施例2的阿法替尼中间体HPLC图谱。
图3实施例3的阿法替尼中间体HPLC图谱。
图4实施例4的阿法替尼中间体HPLC图谱。
图5实施例5的阿法替尼中间体HPLC图谱。
图6实施例6的阿法替尼中间体HPLC图谱。
图7实施例7的阿法替尼中间体HPLC图谱。
图8实施例8的阿法替尼中间体HPLC图谱。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，流动相是以0.02mol/L的醋酸铵水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，以体积比计，按下表进行梯度洗脱：
实验步骤：将阿法替尼中间体用流动相B溶解并定量稀释制成每1ml中含阿法替尼中间体0.3mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1。
附图1表明，在该色谱条件下，阿法替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，分离度较高，阿法替尼中间体峰的保留时间在22.355min，分离度11.23。
实施例2
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，柱温30℃，流速0.9ml/min，流动相是以0.02mol/L的醋酸铵水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，以体积比计，按下表进行梯度洗脱：
实验步骤：同实施例1，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图2。
附图2表明，在该色谱条件下，阿法替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，分离度较高，阿法替尼中间体峰的保留时间在23.033min，分离度10.84。
实施例3
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，柱温30℃，流速1.1ml/min，流动相是以0.02mol/L的醋酸铵水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，以体积比计，按下表进行梯度洗脱：
实验步骤：同实施例1，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图3。
附图3表明，在该色谱条件下，阿法替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，分离度较高，阿法替尼中间体峰的保留时间在21.852min，分离度10.56。
实施例4
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，柱温35℃，流速1.0ml/min，流动相是以0.005mol/L的醋酸铵水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，以体积比计，按下表进行梯度洗脱：
实验步骤：同实施例1，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图4。
附图4表明，在该色谱条件下，阿法替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，分离度较高，阿法替尼中间体峰的保留时间在22.249min，分离度10.52。
实施例5
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，柱温25℃，流速1.0ml/min，流动相是以0.03mol/L的醋酸铵水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，以体积比计，按下表进行梯度洗脱：
实验步骤：同实施例1，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图5。
附图5表明，在该色谱条件下，阿法替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，分离度较高，阿法替尼中间体峰的保留时间在22.556min，分离度11.23。
实施例6
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，流动相是以0.005mol/L的醋酸钠水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，以体积比计，按下表进行梯度洗脱：
实验步骤：同实施例1，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图6。
附图6表明，在该色谱条件下，阿法替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，分离度较高，阿法替尼中间体峰的保留时间在22.516min，分离度10.85。
实施例7
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，流动相是以0.02mol/L的醋酸钠水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，以体积比计，按下表进行梯度洗脱：
实验步骤：同实施例1，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图7。
附图7表明，在该色谱条件下，阿法替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，分离度较高，阿法替尼中间体峰的保留时间在22.426min，分离度10.90。
实施例8
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，流动相是以0.03mol/L的醋酸钠水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，以体积比计，按下表进行梯度洗脱：
实验步骤：同实施例1，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图8。
附图8表明，在该色谱条件下，阿法替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离，且峰形较好，分离度较高，阿法替尼中间体峰的保留时间在22.472min，分离度11.68。
实施例9
系统适用性实验
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取本品适量，精密称定，用流动相B溶解并稀释制成每1ml中含0.3mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，分别计算阿法替尼中间体峰峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表1。
表1 阿法替尼中间体系统适用性实验结果
由表1可知，阿法替尼中间体峰的分离度均大于1.5，理论板数均高于3000，峰面积的相对标准偏差为0.075％(限度2.0％)，保留时间的相对标准偏差为0.032％(限度1.0％)。可见，本方法系统适用性良好，相对标准偏差较小，所得结果稳定可靠。
实施例10
重复性实验
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取本品适量，精密称定，用流动相B溶解并稀释制成每1ml中含0.3mg的溶液，作为供试品溶液，同法配制6份供试品溶液。取供试品溶液，依本方法测定，按面积归一化法计算阿法替尼中间体含量，并计算其相对标准偏差，实验结果见表2。
表2 阿法替尼中间体重复性实验结果
由表2可知，各供试品溶液中阿法替尼中间体的含量没有明显差异，相对标准偏差为0.001％，可见本分析检测方法的重复性良好。
实施例11
耐用性实验
仪器与条件：Agilent 1260液相色谱系统，色谱柱：welch Ultimate XB-C18(4.6×250mm，3μm)，检测波长240nm，流动相及梯度洗脱设置同实施例1。
实验步骤：取本品适量，精密称定，用流动相B溶解并稀释制成每1ml中含0.3mg的溶液，作为供试品溶液。分别通过改变柱温、流速和柱子批次，记录阿法替尼中间体含量的变化情况(按面积归一化法计算)，实验结果见表3。
表3 阿法替尼中间体耐用性实验结果
由表3可知，改变柱温、流速和柱子批次后，阿法替尼中间体含量的测定结果没有明显差异，可见本发明分析检测方法的耐用性良好。
实施例12
线性与范围
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取阿法替尼中间体30mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度，即得线性储备液。精密量取线性储备液1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，7.0ml分别置10ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度，摇匀，依法测定。以供试品溶液的浓度为横坐标，以阿法替尼中间体峰峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程为y＝33239x–65.314，结果见表4。
表4 阿法替尼中间体线性试验结果
由表4可知，线性回归方程的相关系数R2＝0.9996，可见在该色谱条件下，阿法替尼中间体在0.06～0.43mg/ml的浓度范围内线性关系良好。

Claims (6)

1.一种阿法替尼中间体的高效液相色谱分析方法，其特征在于采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以浓度为0.005～0.03mol/L的醋酸盐水溶液为流动相A，以含20％(体积比)甲醇的乙腈为流动相B，梯度洗脱，包括以下步骤：
a、取阿法替尼中间体适量，加流动相B溶解，配制成每1ml含阿法替尼中间体0.06～0.43mg的样品溶液；
b、设置流动相流速为0.9～1.1ml/min，检测波长240nm，柱温为25～35℃；
c、取a的样品溶液10μl注入液相色谱仪，执行梯度洗脱程序，完成阿法替尼中间体的分析检测；
其中，色谱柱：C18，4.6×250mm，3μm；
以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：
。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的醋酸盐水溶液的浓度为0.02mol/L。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的醋酸盐为醋酸铵或醋酸钠。
4.如权利要求3所述的分析方法，其特征在于所述的醋酸盐为醋酸铵。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的流动相流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述流动相梯度洗脱的设置为：
。
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