CN109374778B - 一种测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定2‑巯基苯并咪唑中有机杂质的方法，采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱作为分离柱，以磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液为流动相，以二极管阵列检测器或紫外检测器为检测器，进行高效液相色谱检测。本发明采用高效液相色谱法对2‑巯基苯并咪唑中有机杂质进行定量检测，保证了2‑巯基苯并咪唑的质量可控，具有专属性强、灵敏度高和操作简捷等优势。

Description

一种测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法。
背景技术
2-巯基苯并咪唑是一种药物中间体，主要用于制备质子泵抑制剂系列原料药如雷贝拉唑及其盐、右旋雷贝拉唑及其盐、兰索拉唑及其盐等。2-巯基苯并咪唑一般由邻苯二胺与二硫化碳在KOH甲醇溶液中进行反应而得，2-巯基苯并咪唑中可能存在的有机杂质有邻苯二胺(起始原料残留)、甲基黄原酸钾(反应副产物)和2-羟基苯并咪唑(反应副产物)。2-巯基苯并咪唑的质量直接影响相关原料药及制剂的质量，如果能对2-巯基苯并咪唑中可能存在的有机杂质进行检测，对相关原料药和制剂的质量控制具有重要意义。
关于2-巯基苯并咪唑中有机杂质的定量测定方法，未见文献报道。因此，开发一种可灵敏检测2-巯基苯并咪唑中各有机杂质的高效液相色谱(HPLC)方法，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供利用HPLC测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法，专属性强、灵敏度高的测定2-巯基苯并咪唑中各有机杂质的含量。
为解决上述技术问题，提供了一种测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法，所述方法采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱作为分离柱，以磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液为流动相，以二极管阵列检测器或紫外检测器为检测器，进行高效液相色谱检测。
上述的方法，优选的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为9.0～10.0。
上述的方法，优选的，所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钾缓冲溶液；和/或，所述缓冲溶液的浓度为0.005mo1/L～0.05mol/L。进一步的，所述缓冲溶液的浓度为0.01mol/L。
上述的方法，优选的，所述磷酸盐缓冲溶液中添加有离子对试剂。
上述的方法，优选的，所述离子对试剂为四丁基溴化铵。
上述的方法，优选的，所述磷酸盐缓冲溶液中四丁基溴化铵的浓度为0.1g/L～0.15g/L。进一步的，所述磷酸盐缓冲溶液中四丁基溴化铵的浓度为0.15g/L。
上述的方法，优选的，所述流动相中磷酸盐缓冲溶液的体积百分含量为85％～95％，其余为乙腈。进一步的，所述磷酸盐缓冲溶液中缓冲溶液的体积百分含量为90％，其余为乙腈。
上述的方法，优选的，所述分离柱为YMC Triart-C18柱。
上述的方法，优选的，所述高效液相色谱检测的具体方法为：
(1)调节流动相流速为0.8mL/min～1.2mL/min、柱温为25℃～40℃和检测波长为230±5nm；
(2)取邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑和2-巯基苯并咪唑的对照品各适量，先用少量甲醇溶解，再补充适量甲醇，然后用10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至所需要的体积，控制溶液中10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液和甲醇的体积比为1︰1，制得一系列不同浓度的混合对照品溶液；取供试品适量，采取配制混合对照品溶液类似的方法配制浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；
(3)取所述(2)步骤中不同浓度的混合对照品溶液各20μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；以各组分浓度为横坐标，以各组分峰面积为纵坐标进行线性回归，得到各组分的响应标准曲线；
(4)取所述(2)步骤中供试品溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图；将供试品溶液中各已知杂质的峰面积代入该杂质的响应标准曲线求出该已知杂质的浓度及含量，将供试品溶液中各未知杂质的峰面积代入2-巯基苯并咪唑的响应标准曲线求出该未知杂质的浓度及含量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法，采用C18色谱柱快速准确地测定2-巯基苯并咪唑中的有机杂质，邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑的定量限均可低至0.02％，具有专属性强、灵敏度高、操作简捷等优势，适用于2-巯基苯并咪唑生产和应用过程中的质量控制，在原料药合成和制剂生产过程的质量控制方面具有重要意义。
(2)本发明提供了一种测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法，在缓冲溶液中加入离子对试剂，离子对试剂中的阳离子能与甲基黄原酸根阴离子形成中性的对离子，从而增强色谱柱对甲基黄原酸钾的保留，导致甲基黄原酸钾出峰后移，实现与溶剂峰的分离，能明显改善甲基黄原酸钾与溶剂峰的分离效果。
(3)本发明提供了一种测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法，流动相的pH为9.0～10.0，能有效抑制甲基黄原酸钾溶液的分解，提高甲基黄原酸钾溶液的稳定性。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中稀释剂(空白溶液)的典型HPLC图。
图2为本发明实施例1中分离度试验溶液的典型HPLC图。
图3为本发明实施例1中定量限溶液的典型HPLC图。
图4为本发明实施例3中以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液-乙腈＝85：15(V：V)为流动相时分离度试验溶液的典型HPLC图。
图5为本发明实施例3中以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈为流动相时分离度试验溶液的典型HPLC图，图5A、5B、5C和5D对应的流动相中10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)的体积百分含量分别为85％、90％、95％和80％。
图6为本发明实施例4中以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵)-乙腈＝90：10(V：V)为流动相时分离度试验溶液的典型HPLC图，图6A、6B和6C对应的四丁基溴化铵在流动相缓冲溶液中的浓度分别为0.10g/L、0.15g/L和0.30g/L。
图7为本发明实施例8中混合对照品贮备溶液的典型色谱图(含2-巯基苯并咪唑及每个已知杂质各约5μg/ml)。
图8为本发明实施例8中供试品溶液的典型HPLC图(供试品批号：20170801；供试品溶液浓度约为1mg/ml)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1
一种本发明的测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的HPLC方法，包括以下步骤：
(1)所用仪器与试剂
液相色谱仪：Agilent 1100四元低压高效液相色谱仪(配置二极管阵列检测器)。
光度计：TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。
万分之一电子天平：Sartorious BSA 124S，d＝0.1mg。
十万分之一电子天平：Sartorious BT 25S，d＝0.01mg。
邻苯二胺对照品(纯度为99.69％)、甲基黄原酸钾对照品(纯度为97.90％)、2-羟基苯并咪唑对照品(纯度为99.54％)、2-巯基苯并咪唑对照品(纯度为99.68％)由湖南如虹制药有限公司提供。水为超纯水。甲醇、乙腈为色谱纯。其余试剂均为分析纯。2-巯基苯并咪唑供试品由湖南如虹制药有限公司提供，批号为20170801、20170802和20170803。
(2)溶液的配制
10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液：称取三水合磷酸氢二钾2.28g，加水溶解并稀释至1000ml混匀，即得，pH约为9.2。
10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)：称取三水合磷酸氢二钾2.28g和四丁基溴化铵0.15g，加水溶解并稀释至1000ml混匀，即得。pH约为9.2。
稀释剂(空白溶液)：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液：甲醇＝1︰1(V︰V)。
邻苯二胺对照品贮备溶液Ⅰ(浓度约为100μg/ml)：取邻苯二胺对照品约10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，先用50ml甲醇溶解，再用10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到邻苯二胺对照品贮备溶液Ⅰ的准确浓度为107.4μg/ml，于冰箱冷藏室(约4℃)保存备用。
邻苯二胺对照品贮备溶液Ⅱ(浓度约为10μg/ml)：准确移取邻苯二胺对照品贮备溶液Ⅰ2.00ml于20ml容量瓶中，再用稀释剂稀至刻度，于冰箱冷藏室(约4℃)保存备用。
甲基黄原酸钾对照品贮备溶液Ⅰ(浓度约为100μg/ml)：取甲基黄原酸钾对照品约10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，先用50ml甲醇溶解，再用10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到甲基黄原酸钾对照品贮备溶液Ⅰ的准确浓度为108.6μg/ml。该溶液需临用新配，保存于冰箱冷藏室(约4℃)并在24h内使用。
甲基黄原酸钾对照品贮备溶液Ⅱ(浓度约为10μg/ml)：准确移取甲基黄原酸钾对照品贮备溶液Ⅰ2.00ml于20ml容量瓶中，再用稀释剂稀至刻度，即得。该溶液需临用新配，保存于冰箱冷藏室(约4℃)并在24h内使用。
2-羟基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ(浓度约为100μg/ml)：取2-羟基苯并咪唑对照品约10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，先用50ml甲醇溶解，再用10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到2-羟基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ的准确浓度为105.8μg/ml，于冰箱冷藏室(约4℃)保存备用。
2-羟基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅱ(浓度约为10μg/ml)：准确移取2-羟基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ2.00ml于20ml容量瓶中，再用稀释剂稀至刻度，于冰箱冷藏室(约4℃)保存备用。
2-巯基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ(浓度约为100μg/ml)：取2-巯基苯并咪唑对照品约10mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，先用50ml甲醇溶解，再用10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，得到2-巯基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ的准确浓度为105.7μg/ml，于冰箱冷藏室(约4℃)保存备用。
2-巯基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅱ(浓度约为10μg/ml)：准确移取2-巯基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ2.00ml于20ml容量瓶中，再用稀释剂稀至刻度，于冰箱冷藏室(约4℃)保存备用。
混合对照品贮备溶液(含每个组分各约5μg/ml)：于200ml容量瓶中，准确加入邻苯二胺对照品贮备溶液Ⅰ、甲基黄原酸钾对照品贮备溶液Ⅰ、2-羟基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ和2-巯基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ各10.00ml，再用稀释剂稀至刻度，摇匀，即得。混合对照品贮备溶液中含邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑分别为5.37μg/ml、5.43μg/ml、5.29μg/ml和5.28μg/ml。
混合对照品溶液(含每个组分各约1μg/ml)：准确移取上述混合对照品贮备溶液10ml于50ml容量瓶中，再用稀释剂稀至刻度，摇匀，即得。
分离度试验溶液(每1ml溶液中含供试品约1mg、含每个已知杂质各约为5μg)：取2-巯基苯并咪唑供试品(批号：20170801)约20mg，精密称定，置于20ml容量瓶中，加入8.50ml甲醇将其溶解至澄清，再准确加入邻苯二胺对照品贮备溶液Ⅰ、甲基黄原酸钾对照品贮备溶液Ⅰ和2-羟基苯并咪唑对照品贮备溶液Ⅰ各1.00ml，再用10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液稀至刻度，摇匀，即得。
定量限溶液(含各组分均约为0.2μg/ml)：准确移取上述混合对照品溶液5.00ml于25ml容量瓶中，再用稀释剂稀至刻度，摇匀，即得。定量限溶液中各已知杂质的质量相对于同体积2-巯基苯并咪唑供试品溶液(1mg/ml)中供试品质量的百分比各约为0.02％。
(3)液相色谱测定条：
分离柱：YMC Triart-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)︰乙腈＝9︰1(V︰V)；10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液的pH值约为9.2。
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：20μl。
(4)检测结果
稀释剂(空白溶液)的典型色谱图见图1，分离度试验溶液的典型色谱图见图2(每1ml溶液中含2-巯基苯并咪唑供试品约1mg、含每个已知杂质各约5μg)，定量限溶液的典型色谱图见图3(每1ml溶液中含2-巯基苯并咪唑及每个已知杂质各约0.2μg)，图2和图3的详细信息分别见表1和表2。
表1：分离度试验溶液的HPLC图谱信息表
Figure BDA0001905333090000061
从表1中可知：按照实施例1的色谱条件，各峰拖尾因子均小于2.0、峰形良好，各峰彼此之间的分离度均大于1.5、能实现彼此完全分离。
表2：定量限溶液的HPLC图谱信息表
Figure BDA0001905333090000062
从表2中可知：当邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑在2-巯基苯并咪唑供试品中的质量百分含量各约为0.02％时，各峰的信噪比均不低于10，表明邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑的定量限均可低至0.02％。由此可知，实施例1的方法的检测灵敏度高，当邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑在供试品中含量低至0.02％时也能进行准确的定量测定，故该方法能实现对2-巯基苯并咪唑中有机杂质的有效监控。
实施例2
考察流动相中缓冲溶液pH值对2-巯基苯并咪唑中有机杂质测定的影响：
(1)所用仪器与试剂：同实施例1。
(2)溶液的配制
100mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液：称取三水合磷酸氢二钾22.8g，加水溶解并稀释至1000ml混匀，即得。
10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液：取上述100mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液500ml，用水稀释至5000ml，即得，pH值约为9.2。
不同pH值的缓冲溶液：取10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液适量，用0.1mol/L KOH或磷酸分别调节溶液pH值至8.0、9.0、9.2、10.0或11.0。
不同pH值的缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)：取上述100mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液100ml，加入四丁基溴化铵0.15g，再用水稀释至1000ml，然后用0.1mol/L KOH或磷酸分别调节溶液pH值分别为8.0、9.0、9.2、10.0或11.0。
混合对照品贮备溶液的配制方法同实施例1。
(3)液相色谱测定条件
流动相1：缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝9︰1(V︰V)，缓冲溶液的pH值为8.0。
流动相2：缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝9︰1(V︰V)，缓冲溶液的pH值为9.0。
流动相3：缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝9︰1(V︰V)，缓冲溶液的pH值为9.2。
流动相4：缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝9︰1(V︰V)，缓冲溶液的pH值为10.0。
流动相5：缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝9︰1(V︰V)，缓冲溶液的pH值为11.0。
其他测定条件同实施例1。
(4)检测结果
将混合对照品贮备溶液于室温放置不同时间后取样进行色谱分析，结果发现放置24h时邻苯二胺、2-羟基苯并咪唑和2-巯基苯并咪唑的峰面积几乎保持不变，溶液稳定性好，但甲基黄原酸钾溶液的稳定性与流动相中缓冲溶液pH值密切相关。当流动相中缓冲溶液pH值在9.0～10.0范围内时，混合对照品贮备溶液中甲基黄原酸钾峰面积于24h内基本不变；当流动相中缓冲溶液pH值高于10.0或低于9.0时，混合对照品贮备溶液中甲基黄原酸钾峰面积会逐渐变小，这可能是因为甲基黄原酸钾在pH高于10.0或低于9.0时会缓慢分解所致，甲基黄原酸钾在酸性介质中会迅速分解生成CS2和甲醇。因此，流动相中缓冲溶液pH值宜选择在9.0～10.0之间。若将适量磷酸氢二钾溶于水得到的缓冲溶液pH值约为9.2，配制方法简单、容易，因此，流动相中所用缓冲溶液优选为磷酸氢二钾缓冲溶液。
实施例3
考察流动相组成对2-巯基苯并咪唑中有机杂质分离效果的影响：
(1)所用仪器、试剂及溶液的配制同实施例1。
(2)液相色谱测定条件：改变流动相组成，其他测定条件同实施例1。
(3)流动相中不加离子对试剂时的分离效果考察
以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(水相)-乙腈(有机相)混合溶液为流动相，取分离度试验溶液进行色谱分析，通过改变流动相中水相与有机相的体积比例进行一系列尝试，考察当流动相中不添加离子对试剂时的分离效果。
考察结果发现：无论流动相中水相与有机相的体积比例如何调整，甲基黄原酸钾峰总是离溶剂峰很近，导致溶剂峰对测定产生干扰。这可能是因为甲基黄原酸钾的极性太强，与色谱柱固定相的作用力太弱所致。流动相中不加离子对试剂时分离度试验溶液的典型色谱图见图4。
图4是以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液-乙腈＝85︰15(V︰V)为流动相时分离度试验溶液的典型色谱图，图中保留时间为3.829min、7.666min、11.325min和13.202min处分别为甲基黄原酸钾、邻苯二胺、2-羟基苯并咪唑和2-巯基苯并咪唑峰。
(4)流动相中加入离子对试剂时的分离效果考察
为了使甲基黄原酸钾峰与溶剂峰分离开，我们尝试向流动相缓冲溶液中加入离子对试剂来改善分离效果。具体为：向流动相缓冲溶液中加入离子对试剂四丁基溴化铵0.15g/L，即以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝85：15(V：V)为流动相时，取分离度试验溶液进行色谱分析，所得色谱图见图5A。
图5A中保留时间为7.635min、8.225min、10.970min和13.881min处分别为甲基黄原酸钾、邻苯二胺、2-羟基苯并咪唑和2-巯基苯并咪唑峰。将图5A与图4进行对比可以看出，由于流动相中离子对试剂四丁基溴化铵的加入，甲基黄原酸钾出峰时间明显后移，能与溶剂峰完全分开，而其他组分出峰时间变化很小，这主要是因为四丁基铵阳离子能与甲基黄原酸根阴离子形成中性的对离子，从而增强色谱柱对甲基黄原酸钾的保留，导致甲基黄原酸钾出峰后移，实现与溶剂峰的分离。
另外，还考察了以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈为流动相时，水相在流动相中所占体积比不同时的分离效果。分别以以下试剂为流动相，取分离度试验溶液进行HPLC检测。
流动相A：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝85︰15(V︰V)。
流动相B：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝90︰10(V︰V)。
流动相C：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝95︰5(V︰V)。
流动相D：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈＝80︰20(V︰V).
采用上述不同流动相的试验结果见图5，其中图5A、5B、5C和5D分别是采用上述流动相A、B、C和D时分离度试验溶液的HPLC图。由图5可知，当以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈为流动相，若水相在流动相中所占体积比为80％时，前2个已知杂质峰不能达到基线完全分离；当水相在流动相中所占体积比为85％～95％时，各已知杂质峰、主峰之间均能实现彼此完全基线分离；当水相在流动相中所占体积比为90％时，各已知杂质及主峰之间彼此均能分得很开，即使色谱柱在使用较长时间后出现柱效降低、峰拖尾的情况下也能确保各峰完全分离。因此，当以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈为流动相时，水相在流动相中所占体积百分含量为85％～95％比较合适，更优选为90％。
实施例4
考察流动相中离子对试剂加入量对2-巯基苯并咪唑中有机杂质分离效果的影响：
(1)所用仪器、试剂及溶液的配制：同实施例1。
(2)流动相中四丁基溴化铵加入量对分离效果的影响
改变流动相缓冲溶液中离子对试剂的加入量，其他测定条件同实施例1。以以下试剂为流动相，取分离度试验溶液进行HPLC检测，考察分离度试验溶液中各组分的分离情况。
流动相A：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.10g/L)︰乙腈＝90︰10(V︰V)。
流动相B：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)︰乙腈＝90︰10(V︰V)。
流动相C：10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.30g/L)︰乙腈＝90︰10(V︰V)。
采用上述不同流动相的试验结果见图6，图6A、6B和6C分别为采用流动相A、B和C时分离度试验溶液的典型HPLC图。从图6中可知，流动相缓冲溶液中四丁基溴化铵的加入浓度在0.1g/L～0.15g/L范围内比较合适，更优选为0.15g/L。
实施例5
考察缓冲溶液浓度对2-巯基苯并咪唑中有机杂质测定的影响：
(1)所用仪器、试剂：同实施例1。
(2)溶液的配制与测定
缓冲溶液A：称取三水合磷酸氢二钾适量，加水溶解并稀释，配制浓度为0.002mol/L的缓冲溶液。
缓冲溶液B：称取三水合磷酸氢二钾适量，加水溶解并稀释，配制浓度为0.005mol/L的缓冲溶液。
缓冲溶液C：称取三水合磷酸氢二钾适量，加水溶解并稀释，配制浓度为0.010mol/L的缓冲溶液。
缓冲溶液D：称取三水合磷酸氢二钾适量，加水溶解并稀释，配制浓度为0.050mol/L的缓冲溶液。
缓冲溶液E：称取三水合磷酸氢二钾适量，加水溶解并稀释，配制浓度为0.10mol/L的缓冲溶液。
分离度试验溶液配制方法同实施例1。
(3)液相色谱测定条件
分别以缓冲溶液A(含四丁基溴化铵0.15g/L)︰乙腈＝90︰10(V︰V)、缓冲溶液B(含四丁基溴化铵0.15g/L)︰乙腈＝90︰10(V︰V)、缓冲溶液C(含四丁基溴化铵0.15g/L)︰乙腈＝90︰10(V︰V)、缓冲溶液D(含四丁基溴化铵0.15g/L)︰乙腈＝90︰10(V︰V)、缓冲溶液E(含四丁基溴化铵0.15g/L)︰乙腈＝90︰10(V︰V)为流动相，取分离度试验溶液进行色谱分析，其他测定条件同实施例1。
(4)检测结果：当缓冲溶液浓度在0.005mol/L～0.050mol/L范围内时，各杂质、主成分峰之间均能彼此完全分离、分离度在1.5以上；当缓冲溶液浓度大于0.050mol/L时，色谱柱寿命会明显缩短；当缓冲溶液浓度小于0.005mol/L时，各组分的保留时间容易发生漂移，这可能是因为缓冲溶液的浓度太小时缓冲效果不好所致。因此，流动相中所用缓冲溶液浓度为0.005mol/L～0.050mol/L比较合适，更优选浓度为10mmol/L。
实施例6
考察检测波长对2-巯基苯并咪唑中有机杂质分离效果的影响：
用紫外可见分光光度计分别对邻苯二胺对照品储备液Ⅱ、甲基黄原酸钾对照品储备液Ⅱ、2-羟基苯并咪唑对照品储备液Ⅱ、2-巯基苯并咪唑对照品储备液Ⅱ(所用仪器、试剂及溶液的配制同实施例1)在190nm～400nm范围内进行紫外吸收扫描，结果显示：邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑在200nm～290nm范围内均有紫外吸收，但在230nm±5nm处上述各物质同时具有比较强的吸光度，因此测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质含量时的检测波长优选为230nm±5nm。
实施例7
考察色谱柱温度、流动相流速改变对2-巯基苯并咪唑中有机杂质分离效果的影响：
(1)所用仪器、试剂及溶液的配制：同实施例1。
(2)考察不同柱温对2-巯基苯并咪唑中有机杂质测定的影响：
分别设置柱温为25℃、30℃、35℃、40℃，其他测定条件同实施例1。取分离度试验溶液进行HPLC检测，结果发现柱温在25℃～40℃范围内，溶液中各峰均能彼此完全分离，分离度均大于2.0，溶剂峰对测定无干扰。优选的柱温为30℃。
(3)考察不同流速对2-巯基苯并咪唑中有机杂质测定的影响：
分别设置流速为0.8、1.0、1.2mL/min，其他测定条件同实施例1。取分离度试验溶液进行HPLC检测，结果发现流速为0.8～1.2mL/min范围内，试验溶液中各峰均能彼此完全分离，分离度均大于2.0，溶剂峰对测定无干扰，优选流速为1.0mL/min。
综上所述，测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的最佳色谱条件如下：以YMC Triart-C18柱为分离柱，以10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)-乙腈的混合溶液为流动相，流动相中乙腈所占体积百分含量为10％，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，供试品溶液进样浓度为1.0mg/ml，溶解样品的溶剂及稀释剂组成为10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液：甲醇＝1︰1(V︰V)，进样量20μl。在此条件下，各已知杂质峰及2-巯基苯并咪唑峰之间均能彼此完全分离，各相邻峰之间的分离度均大于1.5。
实施例8
一种本发明的采用HPLC方法测定2-巯基苯并咪唑供试品中有机杂质的方法，包括以下步骤：
(1)仪器与试剂
仪器同实施例1。
2-巯基苯并咪唑供试品(批号：20170801、20170802、20170803)由湖南如虹制药有限公司提供，其他试剂同实施例1。
(2)色谱测定条件
检测器：二极管阵列检测器(DAD检测器)；
检测波长：230nm；
色谱柱：YMC Triart-C18(4.6mm×250mm，5μm)
柱温：30℃；
流动相：10mmol/L的磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)和乙腈按体积比90︰10组成；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl。
(3)溶液的配制
10mmol/L的磷酸氢二钾缓冲溶液、10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(含四丁基溴化铵0.15g/L)、稀释剂、混合对照品贮备溶液(含各组分均约为5μg/ml)的配制方法同实施例1。
混合对照品贮备溶液：含邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑分别为5.37μg/ml、5.43μg/ml、5.29μg/ml和5.28μg/ml。
供试品溶液：取2-巯基苯并咪唑供试品约20mg，精密称定，置于20ml容量瓶中，先用10ml甲醇溶解，再用10mmol/L的磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至刻度，制成每1ml中含2-巯基苯并咪唑约为1mg的溶液，即得。每批供试品平行配制2份溶液。
添加不同质量杂质的准确度试验溶液：取2-巯基苯并咪唑供试品(批号：20170801)约500mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，先用50ml甲醇溶解，再用10mmol/L的磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至刻度；准确移取此溶液3份，每份5.00ml，置于3个不同的25ml容量瓶，再分别准确加入上述混合对照品贮备溶液5.00ml、10.00ml和15.00ml，最后用稀释剂稀至刻度，得到3份加入了不同质量杂质的准确度试验溶液。
(4)各有机杂质的响应标准曲线测定
取混合对照品贮备溶液适量，用稀释剂逐级稀释，制得梯度浓度的混合对照品溶液，然后精密移取各溶液20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图。以各杂质浓度X(μg/ml)为横坐标，以各杂质峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得到对照品的标准曲线。
邻苯二胺标准曲线方程为：Y＝71.9253X+2.1459(R＝0.9997)；
甲基黄原酸钾标准曲线方程为：Y＝53.7505X+1.2085(R＝0.9997)；
2-羟基苯并咪唑标准曲线方程为：Y＝49.8215X+0.9995(R＝0.9998)；
2-巯基苯并咪唑标准曲线方程为：Y＝105.6308X-5.1661(R＝0.9996)。
图7为混合对照品贮备溶液(含各组分均约为5μg/ml)的典型HPLC图谱，保留时间10.287min为邻苯二胺峰，保留时间14.700min为甲基黄原酸钾峰，保留时间18.907min为2-羟基苯并咪唑峰，保留时间25.040min为2-巯基苯并咪唑峰。
(5)待测样品中有机杂质含量的测定
精密量取各供试品溶液20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图，20170801批供试品溶液的典型HPLC图见图8。供试品溶液中各已知杂质的浓度根据步骤(4)中各杂质的响应标准曲线求得，供试品溶液中未知杂质浓度根据(4)中2-巯基苯并咪唑的响应标准曲线求得，再利用各杂质浓度除以供试品溶液浓度，得到各杂质在供试品中的百分含量，具体结果见表3。
表3：2-巯基苯并咪唑供试品中有机杂质含量的检测结果表
Figure BDA0001905333090000131
(6)加标回收试验
精密量取各准确度试验溶液20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图。某准确度试验溶液中各杂质的实测浓度根据步骤(4)中各杂质的响应标准曲线求得，再计算出该准确度试验溶液中各杂质的实测质量，然后用该准确度试验溶液中各杂质的实测质量减去由供试品所带入的初始质量，得到各杂质的实测加入质量。用各杂质的实测加入质量除以理论加入质量，得到各杂质的加标回收率，试验结果见表4。
表4：回收率试验结果表
Figure BDA0001905333090000132
从表4的结果可知：上述加标回收试验结果表明，各杂质的加标回收率高，说明采用本方法测定各杂质的准确度高。
由上述实施例可知，本发明的检测方法操作简便，专属性强，能灵敏、准确地检测出2-巯基苯并咪唑中的有机杂质，适用于2-巯基苯并咪唑制备和应用过程中的质量监控。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (4)

1.一种测定2-巯基苯并咪唑中有机杂质的方法，其特征在于，所述方法采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱作为分离柱，以磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液为流动相，以二极管阵列检测器或紫外检测器为检测器，进行高效液相色谱检测；
所述磷酸盐缓冲溶液的pH为9.0～10.0；
所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钾缓冲溶液，所述缓冲溶液的浓度为0.005mo1/L～0.05mol/L；
所述磷酸盐缓冲溶液中添加有离子对试剂，所述离子对试剂为四丁基溴化铵，所述磷酸盐缓冲溶液中四丁基溴化铵的浓度为0.1g/L～0.15g/L；
所述流动相中磷酸盐缓冲溶液的体积百分含量为85%～95%，其余为乙腈；
所述有机杂质为邻苯二胺、甲基黄原酸钾和2-羟基苯并咪唑。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相中磷酸盐缓冲溶液的体积百分含量为90%，其余为乙腈。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离柱为YMCTriart-C18柱。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的具体方法为：
（1）调节流动相流速为0.8mL/min～1.2mL/min、柱温为25℃～40℃和检测波长为230±5nm;
（2）取邻苯二胺、甲基黄原酸钾、2-羟基苯并咪唑和2-巯基苯并咪唑的对照品各适量，先用少量甲醇溶解，再补充适量甲醇，然后用10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至所需要的体积，控制溶液中10mmol/L磷酸氢二钾缓冲溶液和甲醇的体积比为1:1，制得一系列不同浓度的混合对照品溶液；取供试品适量，采取配制混合对照品溶液类似的方法配制浓度为1.0mg/ml的供试品溶液；
（3）取所述（2）步骤中不同浓度的混合对照品溶液各20μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；以各组分浓度为横坐标，以各组分峰面积为纵坐标进行线性回归，得到各组分的响应标准曲线；
（4）取所述（2）步骤中供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图；将供试品溶液中各已知杂质的峰面积代入该杂质的响应标准曲线求出该已知杂质的浓度及含量，将供试品溶液中各未知杂质的峰面积代入2-巯基苯并咪唑的响应标准曲线求出该未知杂质的浓度及含量。
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