CN107561174A - 一种快速分析和检测内生真菌中紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10‑去乙酰巴卡亭ⅲ的含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测技术领域。一种快速分析和检测内生真菌中紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10‑去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量的方法，步骤为：首先制备内生真菌提取液；经高分辨质谱分析，证实提取液中是否含有紫杉醇和/或巴卡亭Ⅲ和/或10‑去乙酰巴卡亭Ⅲ；含有紫杉醇和/或巴卡亭Ⅲ和/或10‑去乙酰巴卡亭Ⅲ的提取液用HPLC分离和分析，得到提取液中上述物质的含量。高分辨质谱和高效液相色谱相结合的方法简化了分析和检测紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10‑去乙酰巴卡亭Ⅲ的程序，有望成为筛选产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10‑去乙酰巴卡亭Ⅲ的内生真菌的标准方法。该方法不需要对样品进行分离纯化，节约了时间，简化了过程，减少了试剂消耗，可靠性强。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域。
背景技术
高效液相色谱（High performance liquid chromatograph, HPLC）和质谱（Massspectrum, MS）是分析和检测小分子物质的常用手段和方法。目前，对紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的分析和含量测定主要是分别建立分离和分析紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的HPLC法，以及基于此基础上的高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）。利用该方法，对上述3种物质分别进行分析检测和含量分析，其特点是操作繁琐，工作量大，化学试剂消耗量及花费较大。此外，研究工作中，需要对红豆杉中紫杉醇的合成代谢途径中的紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ进行分析和检测，特别是在筛选产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的内生真菌，也需要对上述3种物质进行分析和检测。目前，尚未建立一种通过一步操作，能对上述3种物质进行分析和检测的技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种能同时分析和检测紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭Ⅲ的技术。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种快速分析和检测内生真菌中紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量的方法，步骤为：
（1）首先制备内生真菌提取液；
（2）经高分辨质谱分析，证实提取液中是否含有紫杉醇和/或巴卡亭Ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ；
（3）含有紫杉醇和/或巴卡亭Ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的提取液用HPLC分离和分析，得到提取液中紫杉醇和/或巴卡亭Ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。
进一步的，所述内生真菌提取液的提取方法为：将纯化的内生真菌接种于PDA平板培养基上培养以活化菌株；活化后接种于装有250 mL的YES液体培养基的500 mL三角瓶中，置于AW-211C大容量恒温培养震荡器中，于28℃、150 r /min下培养7 d；过滤收集菌丝体，置于-18℃冰箱中冷冻；将解冻后的菌丝体置于研钵中研磨成匀浆，加入适量水和等体积的乙酸乙酯，萃取3次，合并3次上清液，置于旋转蒸发仪中，经80℃减压蒸发浓缩得提取液。
进一步的，HPLC梯度洗脱分离紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的梯度洗脱条件是，在流速1 mL/ min，检测波长227 nm，柱温为45℃，进样量为10 µL的条件下，甲醇∶水的梯度洗脱条件为：0~2 min，35∶65; 2~5 min, 55∶45；6~23 min，65∶35；24~35 min，100∶0；35~37 min，100∶35~35∶65；37~40 min，35∶65。
本发明具有如下有益效果：
1、高分辨质谱和高效液相色谱相结合的方法简化了分析和检测紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的程序，有望成为筛选产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的内生真菌的标准方法。
2、高分辨质谱检测样品提取物中的紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ不需要对样品进行分离纯化，节约了时间，简化了过程，减少的试剂消耗，可靠性强。
3、建立梯度洗脱分离和分析紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的HPLC法，可实现对真菌提取物和红豆杉细胞提取物中紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ进行分析和含量测定。
附图说明
图1 为内生真菌SJ17菌株提取物高分辩质谱分析图。
图2为内生真菌JA13菌株提取物高分辩质谱分析图。
图3 为内生真菌JA5菌株提取物高分辩质谱分析图。
图4 为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ和紫杉醇标样在梯度洗脱条件下的分离图谱。
图5为梯度洗脱条件下内生真菌MA4可检测到紫杉醇（a）和巴卡亭Ⅲ(b)的高分辩质谱分析图。
图6为梯度洗脱条件下内生真菌JA5中可检测到紫杉醇（1），巴卡亭Ⅲ（b）和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的高分辩质谱分析图。
图7为紫杉醇标样的回归曲线和回归方程。
图8为巴卡亭Ⅲ标样的回归曲线和回归方程。
图9 为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ标样的回归曲线和回归方程。
具体实施方式
下面通过试验对本发明进行详细的说明。试验中采用的内生真菌SJ17为间座壳属的内生真菌，JA13为木霉属的内生真菌，JA5为也为木霉属的内生真菌。
一、试验方法
1、内生真菌提取物的制备和紫杉醇、巴卡这和巴卡亭Ⅲ的鉴定。
将纯化的内生真菌接种于PDA平板培养基上培养以活化菌株。活化后接种于装有250 mL的YES（80 g/L葡萄糖，10 g/L 酵母粉，5 g/L蛋白胨，2.0 g/L磷酸二氢钾，1.0g/L七水硫酸镁）液体培养基的500 mL三角瓶中，置于AW-211C大容量恒温培养震荡器中，于28℃、150 r /min下培养7 d。过滤收集菌丝体，置于-18℃冰箱中冷冻。将解冻后的菌丝体置于研钵中研磨成匀浆，加入适量水和等体积的乙酸乙酯，萃取3次，合并3次上清液，置于旋转蒸发仪中，经80℃减压蒸发浓缩得浓缩提取液。
浓缩提取液中紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭Ⅲ的鉴定通过高分辨质谱进行分析检测。采用德国Brucker公司的maXis impact超高分辨质谱仪，高分辨质谱条件为喷雾压力：0.3Bar，干燥温度：180℃，干燥压力：4.0 L/ min，喷雾电压：3500 V，离子源：ESI。
、紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭Ⅲ的分离和含量测定。
经高分辨质谱分析证实具有紫杉醇和（或）巴卡亭Ⅲ和（或）10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的样品提取液经调整体积至0.5 mL以及通过0.22 μm的微孔滤膜过滤后用于HPLC分离和分析。
紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭Ⅲ标准样品的配制的标准曲线的制作：紫杉醇标准品购自中国食品药品检定研究院，纯度为99.6%，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ标准样品购自上海同田生物技术股份有限公司，两者纯度均为98.0%。先将紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ配制成10 μg/ mL的母液，然后将母液分别稀释成1 μg/ mL，2 μg/ mL，3 μg/ mL，4 μg/ mL和6 μg/ mL用于HPLC分析和检测。将3个标样混合后通过HPLC进行分离和分析，探索3个标样分离的适宜条件，包括检测波长、柱温、流速、进样量、洗脱剂配比和梯度洗脱条件。探索得到3个标样的适宜条件后，在该条件下对经高分辨质谱检测证实具有紫杉醇和（或）巴卡亭Ⅲ和（或）10-去乙酰巴卡亭Ⅲ真菌提取物进行HPLC分析。由于真菌样品提取物中组分多且复杂，因此，还需调整HPLC的分析条件。获得最佳3个标样和真菌样品中紫杉醇、巴卡亭和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的最佳分离分析条件。在该最佳分离分析条件下，获得到3个标样的保留时间，同时，结合高分辨质谱数据，作为判断样品提取物中是否有紫杉醇或巴卡亭Ⅲ或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的依据。根据3个标样的保留时间和3个标样浓度所对应的峰面积获得回归曲线和回归方程，根据回归方程，同时参照标样的浓度，计算样品提取物中的紫杉醇、巴卡亭Ⅲ或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量和浓度。
HPLC分析采用Agilent1220高效液相色谱仪，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm× 250 mm, 5μm)。检测条件为流动相为不同配比和不同梯度的甲醇∶水，流速1mL/ min，检测波长227 nm，柱温为45℃，进样量为10 µL。设置甲醇∶水梯度洗脱以分离紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ。经过大量实验，得到了最佳的梯度洗脱时间和洗脱剂分别为：：0~2 min，35∶65; 2~5 min, 55∶45；6~23 min，65∶35；24~35 min，100∶0；35~37min，100∶35~35∶65；37~40 min，35∶65。
二、试验结果
图1~3为几个菌株的提取物经高分辨质谱仪检测所检测到的紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的质谱图。
图1 内生真菌SJ17提取物中经高分辩质谱分析证明存在紫杉醇。上：样品的离子特征峰为[M+Na]+= 876.3204。下：在质谱数据库中分子式为C47H51NO14的分子离子特征峰为[M +Na]+=876.3202，两者质量仅相差0.0002。因此，可判断样品中存在分子式为C47H51NO14的分子，即紫杉醇分子。
图2 内生真菌JA13提取物中经高分辩质谱分析证明存在巴卡亭Ⅲ。上：样品的离子特征峰为[M+Na]+= 609.2306。下：在质谱数据库中分子式为C31H38O11的分子离子特征峰为[M +Na]+=，两者无差异[赵瑾1] 。因此，可判断样品中存在分子式为C31H38O11的分子，即巴卡亭Ⅲ。
图3 内生真菌JA5菌株提取物中经高分辩质谱分析证明存在10-去乙酰巴卡亭Ⅲ。上：标品的离子特征峰为[M+Na]+= 567.2197。下：在质谱数据库中分子式为C29H36O10的分子离子特征峰为[M +Na]+=567.2201，两者质量仅有0.0004的微小无差异。因此，可判断样品中存在分子式为C29H36O10的分子，即10-去乙酰巴卡亭Ⅲ分子。
因此，高分辨质谱检测可用于内生真菌中紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的检测，即可用于产紫杉醇的内生真菌，产巴卡亭Ⅲ的内生真菌和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的的内生真菌的筛选。其灵敏度高，可靠性比HPLC用保留时时判断的可靠性好。
经过高分高分辨质谱筛选的菌株，可以通过HPLC分析测定内生真菌提取物中的紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。通过反复探索，建立了HPLC梯度洗脱分离紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的梯度洗条件，即流速1 mL/ min，检测波长227 nm，柱温为45℃，进样量为10 µL的条件下，甲醇∶水的梯度洗脱条件为：0~2 min，35∶65; 2~5min, 55∶45；6~23 min，65∶35；24~35 min，100∶0；35~37 min，100∶35~35∶65；37~40 min，35∶65。在该条件下能较好分离10-去乙酰巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ和紫杉醇，其保留时间（retention time）分别为8.165 min， 9.582 min和21.946 min。
参见图4~6，这种梯度洗脱条件能够对经高分辨质谱获得的产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和（或）10-去乙酰巴卡亭Ⅲ菌株进行HPLC分析，以测定菌株中的紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。按照上述试验方法所述，得到了3个标样回归曲线和回归方程，如图7，图8，图9所示。
根据以上3个标样的回归方程以及标样的纯度，计算得到MA4菌株中的紫杉醇和巴卡亭Ⅲ的含量分别为0.83 μg/L和1.04μg/L，JA4菌株中的紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量分别为2.00 μg/L，3.42 μg/L，1.00 μg/L， 和609.2306差异较大吧。
Claims (3)
1.一种快速分析和检测内生真菌中紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量的方法，其特征在于，步骤为：
（1）首先制备内生真菌提取液；
（2）经高分辨质谱分析，证实提取液中是否含有紫杉醇和/或巴卡亭Ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ；
（3）含有紫杉醇和/或巴卡亭Ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的提取液用HPLC分离和分析，得到提取液中紫杉醇和/或巴卡亭Ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。
2.根据权利要求1所述的快速分析和检测内生真菌中紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量的方法，其特征在于，所述内生真菌提取液的提取方法为：将纯化的内生真菌接种于PDA平板培养基上培养以活化菌株；活化后接种于装有250 mL的YES液体培养基的500 mL三角瓶中，置于AW-211C大容量恒温培养震荡器中，于28℃、150 r /min下培养7 d；过滤收集菌丝体，置于-18℃冰箱中冷冻；将解冻后的菌丝体置于研钵中研磨成匀浆，加入适量水和等体积的乙酸乙酯，萃取3次，合并3次上清液，置于旋转蒸发仪中，经80℃减压蒸发浓缩得提取液。
3.根据权利要求1所述的快速分析和检测内生真菌中紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量的方法，其特征在于：HPLC梯度洗脱分离紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的梯度洗脱条件是，在流速1 mL/ min，检测波长227 nm，柱温为45℃，进样量为10 µL的条件下，甲醇∶水的梯度洗脱条件为：0~2 min，35∶65; 2~5 min, 55∶45；6~23 min，65∶35；24~35 min，100∶0；35~37 min，100∶35~35∶65；37~40 min，35∶65。
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