CN115326970B - 一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法 - Google Patents
一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种7‑Troc‑巴卡亭Ⅲ‑13‑O‑恶唑啉羧酸酯的检测方法；采用反相高效液相色法，检测波长为220‑230nm；采用紫外线或二极管阵列检测器；C18色谱柱，柱温为30℃±5℃；稀释剂为乙腈；流动相组成为乙腈‑水，洗脱程序如下：0到20min，乙腈从60％变化到72％，水从40％变化到28％；20到40min，乙腈从72％变化到76％，水从28％变化到24％；40到50min，乙腈从76％变化到88％，水从24％变化到12％；50到60min，乙腈从88％变化到95％，水从12％变化到5％；60到61min，恢复初始运行梯度，以初始洗脱梯度运行到70min；本发明具有很高的灵敏度及专属性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体是一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法。
背景技术
7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯是10-DAB半合成紫杉醇产生的中间产物，可直接对其进行化学修饰进而合成原料药紫杉醇。紫杉醇是一种抗癌药物，在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，其新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然资源使其受到了植物学家、化学家、药理学家、分子生物学家的极大青睐。临床和科研所需的紫杉醇主要是从红豆杉中直接提取，由于紫杉醇在植物体中的含量相当低，导致了对红豆杉的大量砍伐。而且红豆杉属植物生长缓慢，这对紫杉醇的进一步开发利用造成了很大的困难。因此化学合成紫杉醇成了主流市场，其中以半合成紫杉醇为主，且供不应求，但化学合成的药物有一定的安全隐患，故而对化学合成的药物而言，质量控制必须严格，即使是药物中间体，也应该得到有效控制。该检测方法正是以此为出发点发明出来，目前没有关于7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯HPLC检测方法的相关报道。
7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的化学名为:
5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基-7β-(2，2，2-三氯乙氧基甲酰)紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-O-[(4S，5R)-3-苯甲酰基-2-(4-甲氧基苯基)-4-苯基-5-恶唑啉羧酸酯]
7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的化学结构式为:
7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯在生产半合成紫杉醇的工艺中作为第三个中间体，命名为HⅢ，在HⅢ的生产中，有四个主要杂质，命名为HⅢ-A，HⅢ-B，HⅢ-C，HⅢ-D，化学结构式如下：
(1)Ⅲ-A(7-Troc-紫杉醇)
(2)Ⅲ-B(巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯)
(3)Ⅲ-C(7，10-Troc紫杉醇缩合物)
(4)Ⅲ-B(10去乙酰基-巴卡亭Ⅲ-13-O恶唑酸酯)
杂质在药学中是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效，甚至对人体的健康有害的物质。在药物的研究、生产、贮存和临床应用等方面，必须保持药物的纯度，降低药物的杂质，这样才能保证药物的有效性和安全性。通常可以将药物的结构、外观性状、理化常数、杂质检查和含量测定等方面作为一个相互关联的整体来评价药物的纯度。药物中含有的杂质是影响药物纯度的主要因素，如药物中含有超过限量的杂质，就有可能使理化常数变动，外观性状产生变异，并影响药物的稳定性；杂质增多也必然使药物的含量偏低或活性降低，毒副作用显著增加。目前，国内外许多官方注册程序中，都要求提供关键物料的杂质研究资料，并要求将杂质限度列入关键物料质量标准中。因此杂质的研究是药物研究中一项极其重要的环节，其中建立一种合理的检测方法，准确高效地分辨与测定出杂质的含量与限度是杂质研究的前提条件。7-Troc-巴卡亭
Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯作为10-DAB半合成紫杉醇的中间体，对其杂质的研究是非常必要的。现有公开的文献资料中对于7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯含量及其杂质情况的检测方法没有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
步骤一、将含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质用色谱纯乙腈溶解；
步骤二、对步骤一制备的乙腈溶液采用高效液相色谱进行检测，高效液相色谱中流动相为乙腈-水系统，流动的水相为酸性；柱温为30℃±5℃；流动相流速为1-1.5ml/min；检测器为紫外线检测器或者二极管阵列检测器，检测光的波长为220-230nm；洗脱程序如下：0到20min，乙腈从60％变化到72％，水从40％变化到28％；20到40min，乙腈从72％变化到76％，水从28％变化到24％；40到50min，乙腈从76％变化到88％，水从24％变化到12％；50到60min，乙腈从88％变化到95％，水从12％变化到5％；60到61min，恢复初始运行梯度，以初始洗脱梯度运行到70min。
作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤一中如果含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质是水溶液，则将该水溶液干燥结晶后再用乙腈溶解；如果含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质有不溶解的物质则充分溶解后，取上层过滤清液。
作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤二中流动的水相中含有质量分数为0.5％的磷酸。
作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤二中检测波长为227nm。
作为本发明的一种优选技术方案，上述流动相流速为1-1.5ml/min。
作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤二中流动相流速为1.2ml/min。
作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤二中高效液相色谱的柱温为35℃。
作为本发明的一种优选技术方案，上述单针进样量为5-20ul。
作为本发明的一种优选技术方案，上述单针进样量为10ul。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明实现了7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯与其相邻杂质及特征工艺杂质峰分离，具有很高的灵敏度及专属性，操作简便，普通具备两相流动相的单泵高效液相色谱仪即可重现该条件进行检测；主峰前后分离度均大于1.5，符合药典规定，可用于10-DAB半合成紫杉醇中间体7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的质量控制，具有很好的工业实用性。
附图说明
图1是7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法中实施例2中按照表1的洗脱程序检测结果色谱图；
图2是7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法中实施例2中按照表2的洗脱程序检测结果色谱图；
图3是7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法中实施例2中按照表3的洗脱程序检测结果色谱图；
图4是7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法中实施例2中按照表4的洗脱程序检测结果色谱图；
图5是7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法中实施例2中按照表5的洗脱程序检测结果色谱图；
图6是7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法实施例5中色谱图；
图7是7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法实施例8中色谱图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动成果前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，下面将结合附图1-7来详细说明本申请。
实施例1
实施例1提供了一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，检测方法包括以下步骤：
步骤一、将含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质用色谱纯乙腈溶解；如果含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质是水溶液，则将该水溶液干燥结晶后再用乙腈溶解；如果含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质有不溶解的物质则充分溶解后，取上层过滤清液；
步骤二、对步骤一制备的乙腈溶液采用高效液相色谱进行检测，高效液相色谱中流动相为乙腈-水系统，流动的水相为酸性；柱温为35℃；检测器为紫外线检测器或者二极管阵列检测器，检测光的波长为220-230nm；流动相流速为1-1.5ml/min；流动的水相中含有质量分数为0.5％的磷酸；单针进样量为5-20ul。
实施例2
样品配置：分别取7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯样品50mg及其相关工艺杂质HⅢ-A，HⅢ-B，HⅢ-C，HⅢ-D各5mg置于同一50ml的容量瓶中，适量乙腈溶解，超声，静置后定容摇匀，移取到进样瓶中作为供试品溶液按上述条件进行测定，记录色谱图；
实验仪器与条件：采用HP1100高效液相色谱仪配自动进样器；色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18，填料粒径为5um，4.6*250mm色谱柱；柱温35℃；检测波长227nm；流速1.2ml/min；进样量为10ul；洗脱程序分别如表1、表2、表3、表4和表5进行：
表1
| 时间min | 乙腈％ | 水％ |
| 0 | 50 | 50 |
| 10 | 50 | 50 |
| 35 | 20 | 80 |
| 60 | 10 | 90 |
| 61 | 50 | 50 |
| 70 | 50 | 50 |
表2
| 时间min | 乙腈％ | 水％ |
| 0 | 40 | 60 |
| 15 | 50 | 50 |
| 32 | 90 | 10 |
| 60 | 94 | 6 |
| 70 | 94 | 6 |
表3
| 时间min | 乙腈％ | 水％ |
| 0 | 50 | 50 |
| 15 | 60 | 40 |
| 25 | 70 | 30 |
| 60 | 94 | 6 |
| 70 | 94 | 6 |
表4
| 时间min | 乙腈％ | 水％ |
| 0 | 65 | 35 |
| 20 | 80 | 20 |
| 46 | 80 | 20 |
| 60 | 94 | 6 |
| 61 | 65 | 35 |
| 70 | 65 | 35 |
表5
| 时间min | 乙腈％ | 水％ |
| 0 | 60 | 40 |
| 20 | 72 | 28 |
| 40 | 76 | 24 |
| 50 | 88 | 12 |
| 60 | 95 | 5 |
| 61 | 60 | 40 |
| 70 | 60 | 40 |
按照表1、表2、表3、表4和表5进行分离，分别得到结果如图1-图5所示：
根据图1所示结果：该方法杂质出峰较早且杂质分离度不够，在方法运行结束时仍有杂质峰出现，怀疑该方法有未出完的峰；根据图2所示结果：该方法出峰集中在25-45分钟，峰全部挤在一起，分离度达不到药典要求；根据图3所示结果：由于7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯及其相关杂质之间极性相差较大，该方法杂质出峰较不均匀，大极性和小极性的峰呈现在图谱的两端，10-30min之间没有明显的大峰，且杂质分离度不够；根据图4所示结果：该条件下，图谱上所示35-58min之间没有出现任何峰型，但在58min左右，梯度洗脱即将结束时，还有杂质峰出现，怀疑该方法有未出完的峰；根据图5所示结果：该方法能将7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯及其相关杂质分离开，分离度均大于1.5，符合药典要求，将该方法延长至100min，在60min后没有其他杂质峰出现。
因此按照表5的分离程序进行分离，能够有效检测出7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯。
实施例3
系统适用性实验
仪器与条件
HP1100高效液相色谱仪，自动进样器；Agilent ZORBAX SB-C18,5um,4.6*250mm色谱柱；柱温35℃；检测波长227nm；流速1.2ml/min；进样量10ul；洗脱程序如下
系统适用性溶液的配制：配制成浓度为0.1mg/ml的7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯(用编号HⅢ)标准溶液HⅢ(0.1)。
试验方法：将配制好的系统适用性溶液连续进样5次，记录色谱图，结果见表1。
表1：系统适用性试验结果
实施例4
仪器与条件
HP1100高效液相色谱仪，自动进样器；Agilent ZORBAX SB-C18,5um,4.6*250mm色谱柱；柱温35℃；检测波长227nm；流速1.2ml/min；进样量10ul；洗脱程序如下
溶液配制：
空白溶液BLANK：即色谱纯乙腈稀释剂。
HⅢ(0.1):配制成浓度为0.1mg/ml的7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯供试品溶液HⅢ(0.1)，配制1份。
各杂质标准溶液Sim：按照下表中的要求配制各杂质标准溶液。
混合溶液：按照上述表格分别移取加“*”体积同置装有10mg供试品的10ml容量瓶，用稀释剂溶解定容至刻度，摇匀，作为混合溶液。
进样顺序
| 进样顺序 | 供试品名称 | 进样针数 |
| 1 | BLANK | 1针 |
| 2 | HⅢ(0.1) | 1针 |
| 5 | 各杂质标准溶液Sim | 各1针 |
| 6 | 混合溶液 | 1针 |
按照上述顺序进样分析，记录色谱图。试验结果显示，各杂质与主峰，各杂质之间，分离度均大于1.5，均具有较好的分离度，也无其他杂质干扰，证明该发明有较好的专属性。
实施例5
线性与范围
仪器与条件
HP1100高效液相色谱仪，自动进样器；Agilent ZORBAX SB-C18,5um,4.6*250mm色谱柱；柱温35℃；检测波长227nm；流速1.2ml/min；进样量10ul；洗脱程序如下
溶液配制
线性储备液：取中间体7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯标准品25mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1mg/ml的标准溶液；
取1mg/ml的线性储备液分别稀释成浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的线性溶液。
进完空白溶液后，线性溶液进样顺序按照低浓度至高浓度开始进行分析，记录色谱图。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度(mg/ml)的函数作图，用最小二乘法进行线性回归。线性回归方程：y＝17756.69543x-38.02785，结果见图6，由图6可知，趋势线R2＝0.99996，可见在该色谱条件下，7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯在0.05-1mg/ml的浓度范围线性关系良好。
实施例6
定量限和检测限
根据实施例5检测条件进行线性与范围试验
①定量限溶液：称取5mg中间体Ⅲ标准品进行稀释，直至信噪比S/N≥10:1。
②检测限溶液：将定量限溶液稀释至信噪比S/N≥3:1即为检测限溶液。
③进样顺序
| 进样顺序 | 溶液名称 | 进样针数 |
| 1 | HⅢ(0.1) | 5针 |
| 2 | BLANK | 1针 |
| 3 | 各浓度测试溶液 | 各1针 |
| 4 | 定量限溶液 | 6针 |
| 5 | 检测限溶液 | 6针 |
根据检测结果计算后，定量限为1.13ng，检测限为0.06ng。
实施例7
准确度(回收率)试验
①溶液配制：
标准溶液及系统适用性溶液：配制成浓度为0.1mg/ml的7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯(用编号HⅢ)标准溶液HⅢ(0.1)。
80％准确度溶液：取HⅢ供试品约4mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，平行配制3份。
100％准确度溶液：取HⅢ供试品约5mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，平行配制3份。
120％准确度溶液：取HⅢ供试品约6mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，平行配制3份。
②进样顺序
| 进样顺序 | 溶液名称 | 进样针数 |
| 1 | HⅢ(0.1) | 5针 |
| 2 | BLANK | 1针 |
| 3 | HⅢ(0.02) | 1针 |
| 4 | HⅢ(0.1) | 1针 |
| 5 | HⅢ(0.2) | 1针 |
| 6 | 80％准确度溶液 | 每份各1针 |
| 7 | 100％准确度溶液 | 每份各1针 |
| 8 | 120％准确度溶液 | 每份各1针 |
③按照上述顺序进样分析，记录色谱图。按下式计算回收率：
式中：C1-为对应供试品实测浓度，mg/ml，依据标准曲线方程计算得出；
C-为对应供试品理论浓度(配制浓度)，mg/ml；
Assay-为供试品的重量百分含量，采用重复性项下的供试品平均含量。
经计算，80％准确度溶液，100％准确度溶液，120％准确度溶液回收率均在98.0％～102.0％之间；回收率RSD％≤2.0％。其中80％准确度溶液平均回收率为100.1％，回收率RSD％≤1.42％；100％准确度溶液平均回收率为99.8％，回收率RSD％≤1.7％；
120％准确度溶液平均回收率为100.06％，回收率RSD％≤1.55％。说明本发明准确度较好。
实施例8
耐用性试验
根据实施例6条件进行线性与范围试验
3溶液稳定性试验
配制成浓度为0.1mg/ml的7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯标准溶液HⅢ(0.1)，在室温条件下，持续进样，结果显示6h，12h、24h、48h进样通过峰面积与0h比较的变化值，主峰面积变化值较小，变化值绝对值≤2.0％，说明48h之内7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯标准溶液HⅢ(0.1)溶液稳定性良好。
经过不同色谱柱，不同仪器检测，同一样品检测结果差异较小，结果见图7。
以上的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
步骤一、将含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质用色谱纯乙腈溶解；
步骤二、对步骤一制备的乙腈溶液采用高效液相色谱进行检测，高效液相色谱中流动相为乙腈-水系统，流动相的水相中含有质量分数为0.5%的磷酸；检测所用色谱柱为C18色谱柱，柱温为30℃±5℃；流动相流速为1-1.5ml/min；检测器为紫外线检测器或者二极管阵列检测器，检测光的波长为220-230nm；洗脱程序如下：0到20min，乙腈从60%变化到72%，水从40%变化到28%；20到40min，乙腈从72%变化到76%，水从28%变化到24%；40到50min，乙腈从76%变化到88%，水从24%变化到12%；50到60min，乙腈从88%变化到95%，水从12%变化到5%；60到61min，恢复初始运行梯度，以初始洗脱梯度运行到70min。
2.根据权利要求1所述的一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，其特征在于，所述步骤一中如果含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质是水溶液，则将该水溶液干燥结晶后再用乙腈溶解；如果含有7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯物质有不溶解的物质，则充分溶解后，取上层过滤清液。
3.根据权利要求1所述的一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，其特征在于，所述步骤二中检测波长为227nm。
4.根据权利要求1所述的一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，其特征在于，所述步骤二中流动相流速为1.2ml/min。
5.根据权利要求1所述的一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，其特征在于，所述步骤二中高效液相色谱的柱温为35℃。
6.根据权利要求1所述的一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，其特征在于，单针进样量为5-20μl。
7.根据权利要求6所述的一种7-Troc-巴卡亭Ⅲ-13-O-恶唑啉羧酸酯的检测方法，其特征在于，所述单针进样量为10μl。
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