CN109856255B - 一种控制替格瑞洛中间体的异构体杂质含量的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制式I所示化合物中异构体杂质含量的分析方法，采用直链淀粉类为填充剂的手性色谱柱，以正己烷‑乙醇为流动相，式I所示化合物色谱峰与异构体色谱峰之间分离度高，且该方法操作简便、易行，能够快速分离分析式I化合物中异构体，为式I化合物质量控制提供有效的快速分析检测方法，为替格瑞洛的产品质量提供安全、可靠的保证。

Description

一种控制替格瑞洛中间体的异构体杂质含量的分析方法

技术领域

本发明属于化学中的分析检测领域，具体涉及一种替格瑞洛中间体的异构体杂质含量的检 测方法。

背景技术

2-[[(3aR,4S,6R,6aS)-6-[[5-氨基-6-溴-2-(丙硫基)-4-嘧啶基]氨基]四氢-2,2-二甲基-4H-环戊 二烯并-1,3-二氧杂环戊烯-4-基]氧基]-乙醇：是制备替格瑞洛的关键中间体，其结构如式I所示：

2-[[(3aR,4S,6R,6aS)-6-氨基四氢-2,2-二甲基-4H-环戊二烯并-1,3-二氧杂环戊烯-4-基]氧基]- 乙醇(2R,3R)-2,3-二羟基丁二酸盐，如式(Ⅱ)所示，是合成替格瑞洛的起始物料，其游离碱 结构中存在两个手性中心，如式(Ⅲ)所示含有一个对映异构体杂质。

在进行替格瑞洛的化学合成中，由化合物Ⅱ在化合物I中引入一个光学异构体，如式(Ⅳ) 所示，化学名称为2-[[(3aS,4R,6S,6aR)-6-[[5-氨基-6-溴-2-(丙硫基)-4-嘧啶基]氨基]四氢-2,2-二甲 基-4H-环戊二烯并-1,3-二氧杂-4-基]氧基]-乙醇。

替格瑞洛化学结构具有6个手性中心，理论上可能有64个光学异构体，控制难度较大， 现有方法专属性、灵敏度等均很难达到质控要求。经分析，其手性中心均由起始原料引入，起 始原料(Ⅱ)中虽然有4个手性中心，但根据制备工艺和反应机理分析可知，其只可能存在一 种光学异构体杂质，即对映异构体杂质Ⅲ；通过控制化合物I中的化合物Ⅳ，可有效降低替格 瑞洛中异构体控制的难度。

然而，目前未见化合物I中异构体杂质含量的相关报道，自然也就无法控制中间体中异构 体的引入。

为了进一步保证替格瑞洛的产品质量和患者的用药安全，有必要对替格瑞洛中间体的质量 进行监控，特别是，需要发明一种新方法，对化合物I中的异构体含量进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制替格瑞洛中间体的异构体杂质含量的分析方法，从而实现 式I所示化合物中异构体杂质含量的检测方法。

本发明的提供一种式I所示化合物中异构体杂质含量的检测方法，它包括以下步骤：

a、取式I所示化合物及其异构体，制备系统适用性溶液；

b、取待测的式I所示化合物，制备供试品溶液；稀释100倍，作为对照溶液。

c、采用高效液相色谱法分别对系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液进行检测，所述 高效液相色谱方法的检测条件为：

色谱柱：固定相为直链淀粉-三[3，5-二甲基氨基甲酸酯]；

流动相：正己烷-乙醇，正己烷-乙醇的体积比为95：5；

检测波长：200nm～350nm；

d、按外标法以峰面积计算，或者按面积归一化法计算，或者采用自身对照法计算，得到 式I所示化合物中的异构体杂质含量。

进一步的，所述的异构体杂质至少包括2-[[(3aS,4R,6S,6aR)-6-[[5-氨基-6-溴-2-(丙硫基)-4- 嘧啶基]氨基]四氢-2,2-二甲基-4H-环戊二烯并-1,3-二氧杂-4-基]氧基]-乙醇。

进一步的，步骤a、b中，制备系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液的溶剂为加甲醇 适量使溶解，再加流动相进行稀释。

进一步的，步骤b中，供试品溶液浓度为0.5mg/ml～2.0mg/ml；优选的，浓度为1.0mg/ml。

进一步的，步骤c中，所述的色谱柱为

AD-H。

进一步的，步骤c中，所述色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。

进一步的，步骤c中，所述色谱柱的柱温为20～40℃；优选的，色谱柱的柱温为25℃。

进一步的，步骤c中，所述色谱柱的柱温为20～40℃；优选的，色谱柱的柱温为25℃。

进一步的，步骤c中，所述的流动相流速为0.8～1.5ml/min；优选的，所述流动相的流速 为1.2ml/min。

进一步的，步骤c中，所述的检测波长为200nm～350nm；优选的，所述的检测波长230nnm。

进一步的，步骤c中，进样体积为5μl～50μl；优选的，所述的进样体积为10μl。

进一步的，步骤c中，流动相正己烷-乙醇的体积比为93/7～97/3，优选95：5。

进一步的，通过控制式I所示化合物的异构体，达到控制替格瑞洛的手性异构体为如下结 构所示物质中的一种或多种的目的；

本发明提供了一种控制式I所示化合物中异构体杂质含量的分析方法，式I所示化合物色 谱峰与异构体色谱峰之间分离度高，且该方法操作简便、容易控制，检测成本低，并且具有良 好的专属性、线性关系、精密度、灵敏度和稳定性，加样回收率高，检测结果准确可靠，为监 控式I所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了替格瑞洛的产 品质量和患者的用药安全。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和管用手段，在不脱离本发明 上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不 应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术 均属于本发明的范围。

附图说明

图1为空白溶液的检测结果HPLC图；

图2为式I所示化合物的供试品溶液HPLC图，式I所示化合物保留时间为13.490min。

图3为式I和式Ⅳ所示化合物的系统适用性溶液HPLC图，式I所示化合物保留时间为 13.659min，式Ⅳ所示化合物保留时间为11.839min，两之间的分离度为3.018。

具体实施方式

本发明具体实施方式中所使用的仪器设备及原料均为已知产品，通过自制获得：

例如，化合物I的批号为BAP-160419，纯度为99.83％；式I所示化合物的异构体化合物 Ⅳ的批号为BAP-e-160508，纯度为97.58％；均来源于四川海思科制药有限公司。

化合物Ⅳ为化合物I的异构体，其名称为2-[[(3aS,4R,6S,6aR)-6-[[5-氨基-6-溴-2-(丙硫基)-4- 嘧啶基]氨基]四氢-2,2-二甲基-4H-环戊二烯并-1,3-二氧杂环戊烯-4-基]氧基]-乙醇。

CPA225D型精密电子天平购自赛多利斯科学仪器有限公司；LC-2010CHT型和 LC-20AT(PDA)型高效液相色谱仪购自岛津公司；

AD-H(4.6×250mm，5μm)色 谱柱购自大赛璐公司。

实施例1：

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津：LC-2010CHT

色谱柱:

AD-H，4.6×250mm，5μm；

流动相：正己烷-乙醇＝95：5；

流速：1.2ml/min；

柱温：25℃；

进样体积：10μl；

检测波长：230nm(PDA检测器)；

检测步骤：

取式I所示化合物10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇1ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

另取式I和式Ⅳ所示化合物各适量，加甲醇适量使溶解，加流动相稀释制成每1ml中均约 含0.01mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

测定法：取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1～图3。

附图1为空白溶液的检测结果。

附图2为式I所示化合物的供试品溶液HPLC图，式I所示化合物保留时间为13.490min。

附图3为式I和式Ⅳ所示化合物的系统适用性溶液HPLC图，式I所示化合物保留时间为 13.659min，式Ⅳ所示化合物保留时间为11.839min，两峰之间的分离度为3.018。

结果表明，本发明的色谱条件，式I和式Ⅳ所示化合物之间分离度高，供试品中其它杂质 对检测无干扰，可以采用面积归一化法、外标法或不加校正因子的主成分自身对照法计算异构 体杂质的含量。

实施例2：

高效液相色谱仪：岛津：LC-2010CHT

色谱柱:

AD-H，4.6×250mm，5μm；

流动相：正己烷-乙醇＝93：7；

流速：1.2ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：230nm；

进样体积：10μl；

检测步骤：

取式I所示化合物10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇1ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

另取式I和式Ⅳ所示化合物各适量，加甲醇适量使溶解，加流动相稀释制成每1ml中均约 含0.01mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

测定法：取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果式I所示化合物保 留时间为8.489min，式Ⅳ所示化合物保留时间为7.406min，两峰之间的分离度为2.926。

结果表明，本发明的色谱条件，改变流动相正己烷-乙醇(93：7)后，式I和式Ⅳ所示化 合物之间分离度高，供试品中其它杂质对检测无干扰。可以采用面积归一化法、外标法或不加 校正因子的主成分自身对照法计算异构体杂质的含量。

实施例3：

高效液相色谱仪：岛津：LC-2010CHT

色谱柱:

AD-H，4.6×250mm，5μm；

流动相：正己烷-乙醇＝97：3；

流速：1.2ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：230nm；

进样体积：10μl；

检测步骤：

取式I所示化合物10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇1ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

另取式I和式Ⅳ所示化合物各适量，加甲醇适量使溶解，加流动相稀释制成每1ml中均约 含0.01mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

测定法：取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果式I所示化合物保 留时间为27.400min，式Ⅳ所示化合物保留时间为22.571min，两峰之间的分离度为3.903。

结果表明，本发明的色谱条件，改变流动相正己烷-乙醇(97：3)后，式I和式Ⅳ所示化 合物之间分离度高，供试品中其它杂质对检测无干扰。可以采用面积归一化法、外标法或不加 校正因子的主成分自身对照法计算异构体杂质的含量。

对比例1：

色谱柱:

AD-H，4.6×250mm，5μm；

流动相：正己烷-异丙醇＝90：10；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：230nm；

进样体积：10μl；

检测步骤：

取式I和式Ⅳ所示化合物各适量，加甲醇适量使溶解，加流动相稀释制成每1ml中均约含 0.01mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

测定法：取上述溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果两峰之间的分离度只有 1.570。

为了进一步说明本发明的专属、可靠性和有益的效果，本发明提供以下的试验例。

实施例1、本发明分析方法的方法学验证

本试验中各种试验均采用以下色谱条件：

照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)试验，用直链淀粉-三(3,5-二甲基 苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂(Chirapak AD-H，4.6mm×250mm,5μm或效能相当的色谱柱)； 以正己烷-乙醇(95:5)为流动相；流速为每分钟1.2ml；柱温为25℃；检测波长为230nm。

1.1检测波长

取式I和式Ⅳ所示化合物各10mg，精密称定，分别置10ml量瓶中，加甲醇1ml使溶解， 用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。在上述色谱条件下进样，采用PDA检测器在 200～400nm范围内进行光谱扫描。式I和式Ⅳ所示化合物在200～350nm范围内均较大有吸 收，而最大吸收波长均在230nm左右，因此最终选择的检测波长为230nm。

1.2专属性试验

取式I和式Ⅳ所示化合物各适量，加甲醇适量使溶解，加流动相稀释制成每1ml中均约含 0.01mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。在上述色谱条件下进样，记录色谱图。如附图2 所示，式Ⅳ与式I所示化合物峰依次出峰，分离度为3.018，结果表明分离度良好。

1.3定量限与检测限

调节仪器灵敏度，取式I和式Ⅳ所示化合物，加甲醇适量(约1ml)溶解后，用流动相逐 步稀释后进样，使主峰峰高为基线噪音的3倍左右时，得式I与式Ⅳ所示化合物的检测限分别 为0.47ng与0.36ng；使主峰峰高为基线噪音的10倍左右时，得式I与式Ⅳ所示化合物的定量 限分别为2.37ng与1.81ng；

1.4线性与范围

取式I和式Ⅳ所示化合物各适量，精密称定，加甲醇适量使溶解，加流动相稀释制成不同 浓度的溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回 归，并计算相关系数r。结果见表1。

表1线性与范围试验结果

结果表明，式I所示化合物在0.2368μg/ml～1184μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系， 线性方程为y＝16284.8554x-36892.2175，r＝0.9999；

式Ⅳ所示化合物在0.181μg/ml～905μg/ml范围内与峰面积成良好的线性关系，线性方程为 y＝15154.7300x-26710.4054，r＝0.9999。

采用标准曲线法，算得式Ⅳ所示化合物的校正因子为1.07，在0.9～1.1之间，可以采用面 积归一化法、外标法或不加校正因子的主成分自身对照法计算异构体杂质的含量。

1.5精密度试验

1.5.1重复性试验

取式I所示化合物10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇1ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，共配制6份供试品溶液；另取式I和式Ⅳ所示化合物各适量，加甲醇适量使溶解，加流动相稀释制成每1ml中均约含0.01mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。分别精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色 谱图。供试品溶液的色谱图中如有与式Ⅳ所示化合物保留时间一致的色谱峰，按面积归一化法 计算，结果见表2。

表2重复性试验结果

重复性

1#

2#

3#

4#

5#

6#

式Ⅳ(％)

未检出

未检出

未检出

未检出

未检出

未检出

结果表明6份样品中式Ⅳ所示化合物均未检出，重复性较好。

1.5.2进样精密度试验

取式I和式Ⅳ所示化合物各适量，加甲醇适量使溶解，加流动相稀释制成每1ml中均约含 0.01mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。依法测定，连续进样6次，每次10μl，记录色谱 图，并对结果进行评价。结果见表3。

表3进样精密度试验结果

结果表明本试验进样精密度良好，RSD分别为0.63％与0.25％。

1.6溶液稳定性试验

取式I所示化合物10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇1ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，分别于0、1、2、5、8h的时间点进样，进样量为10μl， 注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表4。

表4溶液稳定性试验结果

时间(h)	0	1	2	5	8
						式Ⅳ(％)	未检出	未检出	未检出	未检出	未检出

供试品溶液室温放置8h稳定性良好。

1.7耐用性试验

通过将色谱条件的柱温、有机相比例、流速等进行微小变动，测定结果不收影响的承受程 度。异构体检查耐用性结果见表5。

表5耐用性试验结果

结果表明本方法耐用性良好。

Claims (10)

1.一种式I所示化合物中异构体杂质含量的检测方法，其特征在于：它包含以下步骤：

a、取式I所示化合物及其异构体，制备系统适用性溶液；

b、取待测的式I所示化合物，制备供试品溶液；稀释100倍，作为对照溶液；

c、采用高效液相色谱法分别对系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液进行检测，所述高效液相色谱方法的检测条件为：

色谱柱：固定相为直链淀粉-三[3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯]；

流动相：正己烷-乙醇，正己烷-乙醇的体积比为95:5；

检测波长：200nm～350nm；

d、按外标法以峰面积计算，或者按面积归一化法计算，或者采用自身对照法计算，得到式I所示化合物中的异构体杂质含量；

所述异构体杂质为2-[[(3aS,4R,6S,6aR)-6-[[5-氨基-6-溴-2-(丙硫基)-4-嘧啶基]氨基]四氢-2,2-二甲基-4H-环戊二烯并-1,3-二氧杂-4-基]氧基]-乙醇。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a、b中，制备系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液的溶剂为加甲醇适量使溶解，再加流动相进行稀释。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，供试品溶液浓度为1.0mg/ml。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述的色谱柱为

AD-H。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述色谱柱的柱温为25℃。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述的流动相流速为1.2ml/min。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述的检测波长为230nm。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，进样体积为10μl。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：通过控制式I所示化合物的异构体，达到控制替格瑞洛的手性异构体为如下结构所示物质中的一种或多种的目的；

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