CN113504320A - 一种高效液相色谱梯度法同时测定盐酸丙卡特罗及其有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时测定盐酸丙卡特罗、杂质I、杂质II及其他有关物质的高效液相色谱分析法，色谱条件为色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L，pH值为2.5～3.5，柱温为35～45℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为259nm，进样器温度为2～20℃，进样量为95μl。本发明所述测定方法可快速准确的检测出盐酸丙卡特罗、杂质I、杂质II及其他有关物质，操作简单，重现性好，灵敏度高，可较好地控制盐酸丙卡特罗口服溶液产品质量，为合成和制剂工艺优化提供了保证。
Description
技术领域
本发明涉及盐酸丙卡特罗原料及其相关制剂的分析方法，具体涉及一种用高效液相色谱梯度法进行测定的方法，属于药物分析检测领域。
背景技术
盐酸丙卡特罗是一种5-(1-羟基-2-异丙胺基丁基)-8-羟基喹诺酮盐酸盐半水合物，分子式为C16H22N2O3·1/2H2O，其化学结构式如下：
盐酸丙卡特罗主要用于支气管哮喘、喘息性支气管炎、伴有支气管反应性增高的急性支气管炎、慢性阻塞性肺部疾病。盐酸丙卡特罗作为β2受体激动剂，对支气管平滑肌的β2，肾上腺素受体有较高的选择性，从而起到舒张支气管平滑肌的作用，同时用于抗过敏作用和促进呼吸道纤毛运动。
盐酸丙卡特罗口服溶液是此类药物的一种制剂类型。目前在世界各国的药典中未收录该剂型的相关标准，且其他剂型标准中未对其有关物质进行控制。在《中国药典》2020年版及2017年版日本药典中收录了HPLC法对盐酸丙卡特罗原料的有关物质检测方法，但是均无法有效分离杂质I、杂质II及含有防腐剂等复杂成分的口服溶液的有关物质。
杂质I为盐酸丙卡特罗光学异构体，其分子式为C16H22N2O3；杂质II为丙卡特罗在人体内的代谢产物，其分子式为C10H7NO3，结构式如下：
采用一般的分析方法难以分离盐酸丙卡特罗、杂质I与杂质II，本文通过考察不同的流动相组成、比例、不同的洗脱方式，不同色谱柱及不同的无机盐浓度首次实现了同时测定盐酸丙卡特罗、杂质I、杂质II及其他相关有关物质的目的，很好地保证了盐酸丙卡特罗原料及其口服溶液的质量可控。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效液相色谱梯度法同时测定盐酸丙卡特罗、杂质I、杂质II及其他有关物质的方法，可用于盐酸丙卡特罗口服溶液制备过程及最终产品的质量控制。
本发明的技术方案为：
一种高效液相色谱梯度法同时测定盐酸丙卡特罗杂质I、杂质II及其他有关物质的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
(1)制备系统适用性和灵敏度溶液
以所述系统适用性和灵敏度溶液在下述色谱条件下进行系统适用性试验，评价分离效果：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L，pH值为2.5～3.5，柱温为35～45℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为259nm(光路60mm流通池)，进样器温度为2～20℃；
系统适用性溶液制备：取盐酸丙卡特罗口服溶液适量，于90℃水浴加热约90分钟，放冷。
灵敏度溶液：取盐酸丙卡特罗对照品，精密称定，用溶剂定量稀释制成每1ml中含盐酸丙卡特罗2.5ng的溶液，其中，溶剂的制备方法为：取二水合磷酸二氢钠约7.8g，加水1000ml使溶解，用磷酸调pH值至3.1，然后与甲醇混合形成体积比为85:12的甲醇-磷酸盐缓冲液。
分别精密量取95μl所述系统适用性溶液及灵敏度溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，系统适用性溶液色谱图中盐酸丙卡特罗峰与杂质I之间的分离度应大于4.0，灵敏度溶液色谱图中盐酸丙卡特罗峰的信噪比应不小于10；
(2)制备供试品溶液和对照品溶液；
取盐酸丙卡特罗原料适量，加所述溶剂制成浓度为5μg/ml的供试品溶液，或者取盐酸丙卡特罗口服溶液及其中间产品，作为供试品溶液
(3)通过高效液相色谱测定待测样品中杂质I、杂质II及相关有关物质的含量；
以对照品溶液注入经上述步骤(1)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将供试品溶液注入液相色谱仪，在步骤(1)所述的色谱条件下进行高效液相色谱测定，记录色谱图；
(4)计算待测样品中各杂质的含量；
按加校正因子的外标法以峰面积计算杂质I及杂质II的含量，按自身对照法计算其他单个杂质的含量。杂质I不得大于2.5％，杂质II不得大于2.0％，其他单个杂质的峰面积不得大于对照品溶液主峰面积(1.0％)，各杂质总和不得大于4.0％。
其中所述的梯度洗脱中，流动相A比例的变化范围为：于0～15分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90％变化为85％，流动相B的比例从10％变化为15％；于15～30分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持85％不变，流动相B的比例保持15％不变；于30～40分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从85％变化为30％，流动相B的比例从15％变化为70％；于40～50分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持30％不变，流动相B的比例保持70％不变，于50～50.1分钟，流动相A和B回到初始比例；于50.1～60分钟，色谱柱重新平衡。
更优选地，上述磷酸盐选自磷酸二氢钠，浓度为0.05mol/L，pH值为3.1。
优选地，上述色谱柱为规格4.6mm×150mm，填料粒径3.5μm的十八烷基硅烷键合硅胶柱。
更优选地，上述色谱柱为Waters XSelect HSS T3色谱柱。
上述盐酸丙卡特罗待测样品为选自盐酸丙卡特罗原料、盐酸丙卡特罗口服溶液中间产品和盐酸丙卡特罗口服溶液中的任意一种。
本发明通过使用高效液相色谱梯度法同时测定盐酸丙卡特罗杂质I、杂质II及其他有关物质，通过对色谱条件的探索，确定了可以有效分离盐酸丙卡特罗、杂质I与杂质II及有关物质的色谱条件。本发明方法首次实现了同时测定盐酸丙卡特罗杂质I、杂质II及其他有关物质的含量，且专属性好、分离度佳、灵敏度高、重现性好，对评价合成和制剂工艺的优劣、终产品质量控制及稳定性样品检测具有重要的意义。
本发明中，所述"有关物质"是指在药物制备和贮存过程中，可能生成和降解产生的杂质(包括中间体、副产物等有机杂质)。其中，盐酸丙卡特罗的有关物质包括：杂质I、杂质II。
本发明方法适用于盐酸丙卡特罗原料、盐酸丙卡特罗口服溶液中间产品和盐酸丙卡特罗口服溶液的检测。本发明检测方法准确，操作简单，时间迅速，可以充分满足有关物质检查与分解产物测定的要求，较好地控制样品中的特定杂质与非特定杂质，保证产品质量，在实际质量控制工作中实用性强。
附图说明
图1为实施例1中梯度洗脱条件优化第一组的色谱图；
图2为实施例1中梯度洗脱条件优化第二组的色谱图；
图3为实施例1中梯度洗脱条件优化第三组的色谱图；
图4为实施例1中梯度洗脱条件优化第四组的色谱图；
图5为实施例1中缓冲盐浓度选择中缓冲盐浓度为0.05M时的色谱图；
图6为实施例1中缓冲盐浓度选择中缓冲盐浓度为0.02M时的色谱图；
图7为实施例2中未被破坏的供试品溶液的色谱图；
图8为实施例2中被高温破坏的供试品溶液的色谱图；
图9为实施例2中被光照破坏的供试品溶液的色谱图；
图10为实施例2中被碱破坏的供试品溶液的色谱图；
图11为实施例2中被酸破坏的供试品溶液的色谱图；
图12为实施例2中被氧化破坏的供试品溶液的色谱图；
图13为实施例3系统适用性试验色谱图；
图14为实施例4辅料干扰试验空白辅料色谱图；
图15为实施例4辅料干扰试验盐酸丙卡特罗口服溶液色谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
以下具体实施方式中，所使用的对照品、样品、试剂及仪器如：
仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪；
试剂：磷酸二氢钠(分析纯)，磷酸(分析纯)，甲醇(色谱纯，Merck公司)；
色谱柱：Waters XSelect HSS T3色谱柱(4.6mm×150mm，3.5μm)；
表1样品
其中，制剂室的盐酸丙卡特罗口服溶液与盐酸丙卡特罗口服溶液空白辅料的组成如表2所示。
表2盐酸丙卡特罗口服溶液与空白辅料组成
制剂室盐酸丙卡特罗口服溶液的制备方法：称处方量三氯蔗糖、枸橼酸、苯甲酸钠置于烧杯，加入450ml纯化水，磁力搅拌溶解；称处方量羟苯甲酯、羟苯丁酯置于另一烧杯，加入15ml无水乙醇，搅拌溶解，全部加入上述步骤1的溶液中，搅拌均匀；取桔子香精0.25ml、1mg/ml丙卡特罗溶液2.5ml加入上述溶液，搅拌均匀，转入量筒加适量纯化水，定容至目标体积；缓慢加入1mol/L的枸橼酸钠溶液至pH4.0，获得盐酸丙卡特罗口服溶液。
标准品的化学名、结构式及来源：
杂质I：
来源：天津泰普制药有限公司，含量：98.7％，批号：20200427；
化学名：8-羟基-5-[(1R,2R)-1-羟基-2-异丙氨基丁基]喹啉-2(1H)-酮
结构式：
杂质II：
来源：自制，含量：98.4％，批号：20200527；
化学名：5-醛基-8羟基喹诺酮
结构式：
【实施例1】高效液相色谱梯度法的条件筛选
1进样体积选择
1.1供试品溶液制备
精密称取盐酸丙卡特罗原料约5mg，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
1.2测定
取供试品溶液根据以下的色谱条件进行采集测定。
色谱条件为：色谱柱Waters XBridge C18(150mm×4.6mm，3.5μm)，流动相为流动相A：磷酸盐缓冲盐(取二水合磷酸二氢钠约12.48g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至3.1)，流动相B，甲醇；流速1.0ml/min，柱温25℃，检测波长259nm，梯度洗脱如表3梯度洗脱所示：
表3梯度洗脱
结果显示5μg/ml盐酸丙卡特罗原料溶液主峰响应较低，未检出杂质，为此，通过增加进样体积获得更高的响应，结果见表4。
表4进样体积选择
根据试验结果，随着进样体积的增加，丙卡特罗的响应随之增加，在进样体积为95μl和100μl时，丙卡特罗的响应基本无差异，且100μl是高效液相的最大进样体积，为保证进样的准确性，不选取最大注射量程，选择95μl进样体积。
2流通池长度选择
2.1制备供试品溶液
取盐酸丙卡特罗原料适量，精密称定，定量稀释制成每1ml中含5ng盐酸丙卡特罗的溶液。
2.2测定
根据上述1的色谱条件，取供试品溶液95μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。尝试通过仪器响应上进行调整，改变检测器类型、检测器参数，仪器品牌，和流通池长度进行测定，结果见表5。
表5流通池长度选择
结果显示，改变检测器类型、检测器参数，仪器品牌均无法明显提高丙卡特罗的响应，而改变流通池的长度，由10mm流通池改变为60mm流通池，丙卡特罗的响应显著提高，5ng/ml盐酸丙卡特罗溶液的灵敏度要求得到满足，信噪比为62.7。因此，选择60mm流通池。
3梯度洗脱程序初步摸索
按照上述2的色谱条件，丙卡特罗主峰保留时间约为5～6min，可能会导致部分杂质与主峰无法完全分离，因此，需通过调整梯度洗脱程序，使主峰在10min之后出峰。
色谱条件为：色谱柱Waters XBridge C18(150mm×4.6mm，3.5μm)，流动相为流动相A：磷酸盐缓冲盐(取二水合磷酸二氢钠约12.48g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至3.1)，流动相B，甲醇；流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长259nm(60mm流通池)，进样体积为95μl，梯度洗脱如表6所示。
表6初步梯度洗脱程序
盐酸丙卡特罗在9.6min分钟出峰，主峰与相邻杂质之间的分离度为1.3，色谱条件还需继续优化，达到分离要求。但由于考虑到盐酸丙卡特罗口服溶液中含有各种辅料，可能存在辅料峰，因此，拟采用盐酸丙卡特罗口服溶液进行本品有关物质检测方法优化。
4色谱柱选择
4.1制备加标供试品溶液
制备加标供试品溶液的原料如表7所示。分别量取杂质I贮备液(5μg/ml)、杂质II贮备液(6.4μg/ml)各100μl，置10ml量瓶中，再加入盐酸丙卡特罗口服溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
表7
4.2测定
按照上述3的色谱条件，分别采用Waters XBridge C18(150mm×4.6mm，3.5μm)及Waters Xselect HSS T3(4.6mm×150mm，3.5μm)，取加标供试品溶液95μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，结果见表8。
表8色谱柱选择
结果显示，采用Waters Xselect HSS T3(4.6mm×150mm，3.5μm)色谱柱，主峰保留时间约为16min，主峰与相邻杂质峰能完全分离，理论板数及拖尾因子均较XBridge C18色谱柱好，但有部分杂质峰之间分离度无法达到要求，防腐剂出峰过早，会影响本品有关物质测定。因此，选择Waters Xselect HSS T3(4.6mm×150mm，3.5μm)色谱柱，通过调整梯度洗脱程序改善分离度及防腐剂出峰时间。
5梯度洗脱条件优化
5.1供试品溶液的制备
制备供试品溶液的原料如表9所示。分别量取杂质I贮备液、杂质II贮备液、5-甲酰基-8-羟基喹啉贮备液及8-羟基喹啉贮备液各100μl，置10ml量瓶中，再加入盐酸丙卡特罗口服溶液参比制剂稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
表9
5.2测定
取供试品溶液根据以下的色谱条件进行采集测定。
色谱条件为：色谱柱Waters Xselect HSS T3(4.6mm×150mm，3.5μm)，流动相为流动相A：磷酸盐缓冲盐(取二水合磷酸二氢钠约12.48g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至3.1)，流动相B，甲醇；流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长259nm(60mm流通池)，进样量95μl。梯度洗脱如表～表所示：
第一组按照表10梯度洗脱：
表10第一组梯度洗脱程序
试验结果见表及图1，盐酸丙卡特罗主峰与杂质峰、杂质峰之间的分离度能达到要求，但是防腐剂峰出峰较早。
表11第一组梯度洗脱结果
第二组按照表12梯度洗脱：
表12第二组梯度洗脱程序
试验结果见表13及图2，盐酸丙卡特罗主峰出峰时间提前至10min左右，杂质与辅料峰也主要集中在前15min出峰，杂质I与相邻杂质峰不能完全分离，但防腐剂色谱峰出峰时间得到改善。
表13第二组梯度洗脱结果
第三组按照表14梯度洗脱：
表14第三组梯度洗脱程序
试验结果见表14及图3，各峰分离度均达到要求，拖尾因子也较理想，防腐剂的三个色谱峰均在35min之后出峰。但由于梯度洗脱程序在45min时，甲醇比例较高，在50～50.1min流动相梯度变化时，缓冲盐析出风险较大，会致使色谱柱堵塞，因此，需降低这段梯度洗脱时，甲醇的比例。
表15第三组梯度洗脱结果
第四组按照表16梯度洗脱：
表16第四组梯度洗脱程序
试验结果见表17及图4，各峰之间的分离度达到要求，且3种防腐剂的色谱峰均在35min之后出峰。
表17第四组梯度洗脱结果
因此，选择第四组的梯度洗脱条件作为盐酸丙卡特罗有关物质测定的梯度洗脱条件。
6缓冲盐浓度选择
由于上述流动相所用磷酸二氢钠缓冲盐浓度大约为0.08mol/L，为了降低色谱柱堵塞风险，拟考察0.05M及0.02M缓冲盐浓度是否适用于本品有关物质检测。取按照4.1的方法制备的加标供试品溶液95μl，注入高效液相色谱仪中，按照上述5第四组的色谱条件进行检测，记录色谱图。色谱检测结果见图4～图6，具体参数如表18所示。
表18缓冲盐浓度选择结果
结果表明，缓冲盐的浓度为0.08M和0.05M时，理论板数、拖尾因子、分离度无明显差别，当浓度为0.02M时，主峰保留时间前移，理论板数、拖尾因子及分离度均没有浓度为0.08M和0.05M时理想，因此，综合上述结果，将缓冲盐浓度调整为0.05M。
7总结
综上，本发明采用以下色谱条件来检测盐酸丙卡特罗及其有关物质：色谱柱为Waters Xselect HSS T3(4.6mm×150mm，3.5μm)，流动相为流动相A：磷酸盐缓冲盐(取二水合磷酸二氢钠约7.8g，加水1000ml使溶解，用磷酸调pH值至3.1)，流动相B，甲醇；流速1.0ml/min，柱温25℃，检测波长259nm，流通池60mm，梯度洗脱：于0～15分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90％变化为85％，流动相B的比例从10％变化为15％；于15～30分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持85％不变，流动相B的比例保持15％不变；于30～40分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从85％变化为30％，流动相B的比例从15％变化为70％；于40～50分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持30％不变，流动相B的比例保持70％不变，于50～50.1分钟，流动相A和B回到初始比例；于50.1～60分钟，色谱柱重新平衡。由本发明的色谱方法可以有效地分离检测盐酸丙卡特罗、杂质I和杂质II，可以充分满足有关物质检查与分解产物测定的要求，较好地控制样品中的特定杂质与非特定杂质，保证产品质量，在实际质量控制工作中实用性强。
【实施例2】强制降解试验
分别用高温、酸、碱、氧化、光照等剧烈条件对本品破坏后，进行有关物质测定，以考察所选择的色谱条件能否检测出本品可能产生的降解产物，具体如下：
(1)未破坏供试品溶液：取盐酸丙卡特罗口服溶液，用微孔滤膜过滤，即得。
(2)高温破坏供试品溶液配制：取盐酸丙卡特罗口服溶液，于60℃放置7天，用微孔滤膜过滤，即得。
(3)光照破坏供试品溶液：取盐酸丙卡特罗口服溶液，于光照箱中放置7天，用微孔滤膜过滤，即得。
(4)酸破坏供试品溶液：取盐酸丙卡特罗口服溶液10ml，加入5M HCl溶液0.1ml，于40℃水浴中放置45h，再加入5M NaOH溶液0.1ml中和，用微孔滤膜过滤，即得。
(5)碱破坏供试品溶液：取盐酸丙卡特罗口服溶液10ml，加入5M NaOH溶液0.1ml，于室温下放置30min，再加入5M HCl溶液0.1ml中和，用微孔滤膜过滤，即得。
(6)氧化破坏供试品溶液：取盐酸丙卡特罗口服溶液10ml，加入10％H2O2溶液0.1ml，于40℃水浴中放置45h，用微孔滤膜过滤，即得。
采用实施例1总结的色谱条件分别对(1)～(6)的溶液进行检测，记录色谱图，分别为图7～图12，试验结果如表19所示。根据图7～图12及表，主峰与相邻杂质峰之间的分离度均在1.5以上，杂质与杂质之间的分离度基本能在1.2以上，且主峰纯度均在990以上，因此本方法可用于对盐酸丙卡特罗有关物质进行检测。
表19强制降解试验结果
【实施例3】系统适用性试验
取盐酸丙卡特罗口服溶液适量，置90℃水浴加热约1.5小时，作为系统适用性溶液。取系统适用性溶液95μl，注入高效液相色谱仪中，按照实施例1总结的色谱条件进行检测，记录色谱图。色谱检测结果见表20及图13。系统适用性溶液中盐酸丙卡特罗峰与杂质I(相对保留时间约为1.16)之间的分离度大于4.0。
表20系统适用性试验结果
【实施例4】空白辅料干扰试验
取空白辅料溶液(批号：20191114)及盐酸丙卡特罗口服溶液(批号：20200416)各95μl，注入液相色谱仪，按照实施例1总结的色谱条件进行检测，记录色谱图。色谱检测结果见图14、15。结果显示空白辅料在主峰、杂质I及杂质II未检出色谱峰，未干扰本品有关物质测定。
【实施例5】定量限及检测限测定
分别取适量盐酸丙卡特罗(来源：中检院；含量：100％)、杂质I及杂质II，用稀释剂即流动相A-甲醇(85:15)，分别配制成每1ml含5μg的溶液，再分别用流动相A稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样95μl，按照实施例1总结的色谱条件进行检测。以信噪比为3:1或2:1时相应浓度确定检测限，盐酸丙卡特罗检测限浓度为0.2ng/ml，相当于供试品浓度(实施例1中的1.1)的0.004％；杂质I检测限浓度为0.3ng/ml，相当于供试品浓度的0.006％；杂质II检测限浓度为0.3ng/ml，相当于供试品浓度的0.006％；以信噪比10:1时相应浓度确定定量限，并重复进样5针，计算RSD值，盐酸丙卡特罗定量限浓度为0.6052ng/ml，相当于供试品浓度的0.012％；杂质I定量限浓度为0.6060ng/ml，相当于供试品浓度的0.012％；杂质II定量限浓度为0.6145ng/ml，相当于供试品浓度的0.012％。结果显示，连续进样峰面积RSD值均小于10％，满足定量限可接受标准。结果见表21。
表21定量限及检测限测定结果
【实施例6】线性及范围
精密称取盐酸丙卡特罗(来源：中检院；含量：100％)、杂质I及杂质II适量，分别加稀释剂即流动相A-甲醇(85:15)溶解并稀释制成每1ml中各含5μg盐酸丙卡特罗、杂质I及杂质II的贮备液。用该贮备液再加上述稀释剂配制成7份不同浓度的溶液，分别进样，按照实施例1总结的色谱条件进行检测。以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得到盐酸丙卡特罗、杂质I及杂质II的线性回归方程，结果见表22。
表22线性及范围测定结果
结果显示，在本方法下，盐酸丙卡特罗、杂质I及杂质II在一定浓度范围内，均能呈良好的线性关系。
【实施例7】精密度
重复性试验：取杂质I及杂质II各适量，加入盐酸丙卡特罗口服溶液(批号：20200416)中，制成6份杂质I及杂质II浓度分别为盐酸丙卡特罗标示量2.5％及2.0％的加标供试品溶液，分别进样，按照实施例1总结的色谱条件进行检测。计算各杂质含量，试验结果表23。
表23精密度试验结果
结果显示，各杂质含量RSD值均5.0％，说明本方法对杂质I及杂质II含量的测定结果重复性良好。
【实施例8】准确度
制备对照品贮备液：取杂质I及杂质II各适量，精密称定，加稀释剂，即流动相A-甲醇(85:15)，溶解并稀释制成每1ml中约含杂质I1.25μg及含杂质II1.0μg的贮备液。
制备供试品溶液：分别量取对照品贮备液1ml、2ml、3ml置20ml量瓶中，加盐酸丙卡特罗口服溶液(批号：20200416批)稀释至刻度，摇匀，得不同浓度的加标供试品溶液，每个浓度的加标供试品溶液各制备3份。按照实施例1总结的色谱条件进行检测，计算各杂质的回收率，结果见表24。
表24准确度试验结果
结果显示：各杂质的平均回收率均在90％～110％之间，回收率RSD均小于5.0％，表明有关物质测定方法的准确度良好。
【实施例9】耐用性试验
分别考察柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％、磷酸盐缓冲液pH值变化±0.2、流动相比例变化±5％及色谱柱，进行耐用性试验。按照实施例103的制备方法制备系统适用性溶液，精密量取95μl系统适用性溶液注入液相色谱仪。按照实施例1总结的色谱条件进行检测，试验结果见表25。
表25耐用性试验结果
结果显示：在所有参数发生微小变化时，盐酸丙卡特罗主峰理论板数，盐酸丙卡特罗与杂质I之间的分离度满足系统适用性要求，但更换色谱柱后，理论板数及分离度较Waters XSelect HSS T3色谱柱差。
Claims (8)
1.一种高效液相色谱梯度法同时测定盐酸丙卡特罗、杂质I和杂质II的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
(1)制备系统适用性溶液和灵敏度测试溶液，分别以所述系统适用性溶液和灵敏度测试溶液在下述色谱条件下进行系统适用性试验和灵敏度测试，校定检测系统；
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L，pH值为2.5～3.5，柱温为35～45℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为259nm，进样器温度为2～20℃；
制备系统适用性溶液：取盐酸丙卡特罗口服溶液适量，于90℃水浴加热约90分钟，放冷；
制备灵敏度测试溶液：取盐酸丙卡特罗对照品，用溶剂定量稀释制成浓度为2.5ng/ml的盐酸丙卡特罗溶液；其中，所述溶剂的制备方法为：取二水合磷酸二氢钠约7.8g，加水1000ml使溶解，用磷酸调pH值至3.1，然后与甲醇混合形成体积比为85:12的甲醇-磷酸盐缓冲液；
分别精密量取95μl所述系统适用性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，校定检测系统至盐酸丙卡特罗峰与杂质I之间的分离度大于4.0，灵敏度测试溶液色谱图中盐酸丙卡特罗峰的信噪比不小于10；
(2)制备供试品溶液和对照品溶液
制备供试品溶液：取盐酸丙卡特罗原料适量，加所述溶剂制成浓度为5μg/ml的供试品溶液，或者取盐酸丙卡特罗口服溶液及其中间产品，作为供试品溶液；
制备对照品溶液：取盐酸丙卡特罗对照品，加所述溶剂制成浓度为50ng/ml的溶液，作为对照品溶液；
(3)通过高效液相色谱测定待测样品中杂质I、杂质II的含量
以对照品溶液注入上述步骤(1)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将供试品溶液注入液相色谱仪，在步骤(1)所述的色谱条件下进行高效液相色谱测定，记录色谱图；
(4)计算待测样品中各杂质的含量
按加校正因子的外标法以峰面积计算杂质I及杂质II的含量，杂质I不得大于2.5％，杂质II不得大于2.0％，各杂质总和不得大于4.0％。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的梯度洗脱中，流动相A比例的变化范围为：于0～15分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90％变化为85％，流动相B的比例从10％变化为15％；于15～30分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持85％不变，流动相B的比例保持15％不变；于30～40分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从85％变化为30％，流动相B的比例从15％变化为70％；于40～50分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持30％不变，流动相B的比例保持70％不变，于50～50.1分钟，流动相A和B回到初始比例；于50.1～60分钟，色谱柱重新平衡。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐选自磷酸二氢钠。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/L，pH值为3.1。
5.如权利要求1所述的方法，其色谱条件为：流速为1.0ml/min；柱温为40℃；进样器温度为4℃，所述磷酸盐缓冲液由二水合磷酸二氢钠约7.8g，加水1000ml溶解，用磷酸调pH值至3.1制成。
6.如权利要求1所述的方法，所述的检测系统的流通池为光路60mm流通池。
7.如权利要求1所述的方法，所述的色谱柱为Waters XSelect HSS T3色谱柱。
8.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述盐酸丙卡特罗待测样品为选自盐酸丙卡特罗原料、盐酸丙卡特罗口服溶液中间产品和盐酸丙卡特罗口服溶液中的任意一种。
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