CN114636771B - 一种检测血液中丙卡特罗含量的方法及应用 - Google Patents

一种检测血液中丙卡特罗含量的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药检测技术领域，具体讲，涉及一种检测血液中丙卡特罗含量的方法及应用。检测血液中丙卡特罗含量的方法至少包括以下步骤：制备标准曲线方程，处理得到待测样品，检测待测样品，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中丙卡特罗的浓度。本发明还提出该方法在监测丙卡特罗血药浓度中的应用。本发明提出的检测血液中丙卡特罗含量的方法，不仅前处理操作较简单，并且样品需求量小，分析时间较短，适于大通量的样本检测。

Description

一种检测血液中丙卡特罗含量的方法及应用
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域，具体讲，涉及一种检测血液中丙卡特罗含量的方法及应用。
背景技术
盐酸丙卡特罗是一种拟交感神经药物，其化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
盐酸丙卡特罗为新一代长效β2-受体激动剂，有舒张气管平滑肌作用，使中央气道狭窄得到改善，有效地减轻咳嗽症状，对气道痉挛明显出现咳嗽时哮鸣音的患者作用较好。尚具有较强抗过敏作用，不仅可抑制速发型的气道阻力增加，而且可抑制迟发型的气道反应增高。同时还有祛痰和镇咳作用。临床上常用于治疗支气管哮喘喘息性支气管炎、肺气肿等，较为广泛用于咳嗽变异性哮喘效果显著。
盐酸丙卡特罗在体内的代谢的过程中，血液内的含量通常为匹克级别，因此已公开技术中对于血液中盐酸丙卡特罗的检测方法无法满足血药浓度监测的需要。同时，由于在血药浓度监测过程中，需要对大量样本进行检测，因此，亟待提出一种前处理简单、样本需求量小，分析时间短的适用于大通量样本检测的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测血液中丙卡特罗含量的方法及应用。
本发明提供了一种检测血液中丙卡特罗含量的方法，至少包括以下步骤：
S1、制备标准曲线方程，包括：采用标准工作液、内标工作液和空白血浆配制得到含有不同丙卡特罗浓度的标准溶液，经前处理后采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；
S2、处理得到待测样品，包括：取待测血清或血浆加入内标工作液，经前处理后得到待测样本；
S3、检测待测样品，包括：采用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中丙卡特罗的浓度；
其中，在S1和S2中，前处理包括：将待处理溶液加入1 ~ 3 mol/L的磷酸氢二钾溶液和萃取剂，混匀、离心后取上清液干燥，加入复溶液混匀；萃取剂选自乙酸乙酯和甲基叔丁基醚中的至少一种；复溶液选自0 ~ 30 v/v%甲醇水溶液。
可选的，在S1中，标准工作液、内标工作液和空白血浆的体积比为5 ~ 20：5 ~ 20：195~180，混匀后进行前处理；混匀的条件为转速1000 ~ 2000rpm涡旋0.5 ~ 1分钟；在S2中，血清或血浆与内标工作液的体积比为200：5 ~ 20，混匀后进行前处理；混匀的条件为转速1000 ~ 2000rpm涡旋0.5 ~ 1分钟。
可选的，在前处理步骤中：待处理溶液与磷酸氢二钾溶液的体积比为210：50 ~300；待处理溶液与萃取剂的体积比为210：800 ~ 1200；混匀为转速1500 ~ 2500rpm涡旋5~ 15分钟；离心为转速12000 ~ 14000rpm离心5 ~ 15分钟。
可选的，在前处理步骤中：所取上清液的体积与萃取剂的体积之比为800 ~ 900：1000；复溶液与待测血清或血浆的体积比为1：2。
可选的，标准工作液的配制包括：
采用60 ~ 80v/v%甲醇水溶液将盐酸丙卡特罗标准品配制得到标准储备液A；
取适量标准储备液A，用40 ~ 60v/v%甲醇水溶液进行稀释，得到丙卡特罗浓度为20ng/mL的标准工作液；
用40 ~ 60v/v%甲醇水溶液继续稀释，配制得到丙卡特罗的浓度分别为0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.6 ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16 ng/mL、20 ng/mL的标准工作液。
可选的，内标工作液的配制方法包括：
采用5 ~ 15v/v%甲醇水溶液将茶碱-D6标准品配制得到标准储备液B；
取适量标准储备液B，用40 ~ 60 v/v%甲醇水溶液稀释，得到茶碱-D6浓度为50ng/mL的内标工作液。
可选的，色谱分析所使用的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；
流动相：A相：含1 ~ 10 mmol/L甲酸铵、0.02 ~ 1v/v%甲酸的水；B相：甲醇；流速：0.2 ~ 0.4 mL/min；柱温：40 ~ 45℃；进样量：10 ~ 20 µL；分析时间：7min。
可选的，在S1和S3中，采用高效液相色谱质谱联用仪检测时的色谱分析的洗脱条件为：
0 ~ 0.01分钟： A相：80 ~ 100%；B相：20 ~ 0%；
0.02 ~ 1.5分钟：A相：60 ~ 80%；B相：40 ~ 20%；
1.51 ~ 4.0分钟：A相：0%；B相：100%；
4.01 ~ 7分钟：A相：80 ~ 100%；B相：20 ~ 0%。
可选的，在S1和S3中，采用高效液相色谱质谱联用仪检测时的质谱检测的条件为：电喷雾电压：2500V；离子源温度：550℃；雾化气：65psi；辅助气：60psi。
本发明还提出上述方法在监测丙卡特罗血药浓度中的应用。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明实施例提出的检测血液中丙卡特罗含量的方法，不仅前处理操作较简单，并且样品量需求小，仅需要200 µL血样就能完成检测，并且分析时间较短，仅需要7分钟，适于大通量的样本检测。
附图说明
图1为采用本发明实施例的检测方法所获得的血药浓度曲线；
图2为本发明实施例1中标准溶液的丙卡特罗色谱图；
图3为本发明实施例1中加标1000 pg/mL血浆样本的色谱图；
图4为本发明实施例1中加标5 pg/mL血浆样本的色谱图；
图5为本发明实施例3中初始梯度条件为0% B相的标准溶液的色谱图；
图6为本发明实施例3中初始梯度条件为20% B相的标准溶液的色谱图；
图7为本发明对比例1中前处理过程中不加磷酸氢二钾溶液的加标5 pg/mL血浆样本的色谱图；
图8为本发明对比例2中萃取剂采用甲基叔丁基醚加标5 pg/mL血浆样本的色谱图；
图9为本发明对比例2中萃取剂采用正己烷加标5 pg/mL血浆样本的色谱图；
图10为本发明对比例3中复溶液采用纯水加标1000 pg/mL血浆样本的色谱图；
图11为本发明对比例3中复溶液采用30 v/v%甲醇加标1000 pg/mL血浆样本的色谱图；
图12为本发明对比例3中复溶液采用40 v/v%甲醇加标1000 pg/mL血浆样本的色谱图；
图13为本发明对比例4中流动相B相为乙腈的标准溶液的色谱图；
图14为本发明对比例5中流动相A相为纯水的标准溶液的色谱图；
图15为本发明对比例6中流动相A相为0.05 v/v%甲酸水的标准溶液的色谱图；
图16为本发明对比例7中流动相A相为5mmol/L甲酸铵水的标准溶液的色谱图；
图17为本发明对比例8中不采用梯度洗脱时标准溶液的色谱图；
图18为本发明对比例9中初始梯度条件为28% B相的标准溶液的色谱图；
其中，图2~图18中，左图为丙卡特罗的色谱图，右图为内标的色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
盐酸丙卡特罗口服溶液在临床上应用广泛，但由于其在体内代谢过程中，血液中的含量极低，为测定血药浓度带来一定困难，鉴于此，本发明实施例提出了一种检测血液中丙卡特罗含量的方法，其检出限可达0.8 pg/mL，线性范围为5pg/mL ~ 1000pg/mL，从而可用于血药浓度的监测。具体的，至少包括以下步骤：
S1、制备标准曲线方程，包括：采用标准工作液、内标工作液和空白血浆配制得到含有不同丙卡特罗浓度的标准溶液，经前处理后，采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；其中，空白血浆为不含有丙卡特罗的健康人血浆；
S2、处理得到待测样品，包括：取待测血清或血浆加入内标工作液，经前处理后得到待测样本；
S3、检测待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中丙卡特罗的浓度。
作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在S1和S2中，均包括对样本的前处理步骤，本发明实施例对前处理步骤进行了深入的研究，并发现前处理的具体条件可以提高提取效率，从而达到样本需求量小的技术效果，采用本发明实施例的前处理步骤，最小血样为200μL血清或血浆即可完成检测。并且，前处理的步骤简单，处理时间短，1.5小时内即可完成处理。
前处理步骤具体包括：
（1）将待处理溶液加入1 ~ 3 mol/L的磷酸氢二钾溶液和萃取剂，其中，在S1中，待处理溶液为采用标准工作液、内标工作液和空白血浆配制得到含有不同丙卡特罗浓度的标准溶液；在S2中，待处理溶液为待测血清或血浆加入内标工作液后的混合溶液；
丙卡特罗血液内的含量通常为匹克级别，浓度极低，蛋白沉淀后直接进样，信号不满足检测需求，需对其进行提取后浓缩，固相萃取成本较高，液液萃取成本较低，但丙卡特罗极性较大，液液萃取为两相分配，有机溶剂极性较小，提取率较低，所以本发明实施例对提取过程进行了优化，在提取过程中加入了磷酸氢二钾溶液并采用极性较大的萃取剂进行萃取，萃取剂选自乙酸乙酯和甲基叔丁基醚中的至少一种，从而显著提高了提取率。
在前处理步骤中，为了显著提高提取率，加入1 ~ 3 mol/L的磷酸氢二钾溶液，并进一步优选1.5 ~ 2.5mol/L的磷酸氢二钾溶液、最优选2 mol/L的磷酸氢二钾溶液。待处理溶液与磷酸氢二钾溶液的体积比为210：50~300，优选210：200。研究过程中发现，丙卡特罗极性较大，提取率较低，如果不加入磷酸氢二钾溶液或加入的量不足，提取率降低，信号降低，不能满足检测需求；加入的量过多，体系呈凝胶状，不利于萃取。
本发明实施例中的萃取剂选自乙酸乙酯和甲基叔丁基醚中的至少一种，优选乙酸乙酯。待处理溶液与萃取剂的体积比为210：800~1200，优选为210：1000。如果萃取剂加入的量不足，提取率降低，信号降低，不能满足检测需求；如果萃取剂加入的量过多，取上清液量增加，干燥时间延长，不利于操作。
（2）混匀、离心后取上清液后干燥，
具体的，混匀为转速1500 ~ 2500rpm涡旋5 ~ 15分钟，优选的，转速2000rpm下涡旋10分钟；
具体的，离心为转速12000 ~ 14000rpm离心5 ~ 15分钟，优选的，离心为14000rpm高速离心10分钟；
具体的，干燥的方式优选为氮气吹干；
（3）加入复溶液混匀，即为待测样品；
本发明实施例通过研究发现，复溶液中甲醇比例增加容易出现溶剂效应，选用40v/v%甲醇水溶液时即出现明显溶剂效应。基于无溶剂效应，复溶液选自0~30v/v%甲醇水溶液，为了保持与初始流动相一致，且无溶剂效应，优选5 ~ 10v/v%甲醇水溶液，进一步优选8v/v%甲醇水溶液。
作为本发明实施例的一种改进的技术方案，复溶液与加入待测血清或血浆的体积比为1：2，丙卡特罗血液内的含量通常为匹克级别，浓度极低，因此本发明实施例对样品进行2倍浓缩，以满足检测需求。
作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在S1中，标准工作液、内标工作液和空白血浆的体积比为5 ~ 20：5 ~ 20：195~180，优选为10：10：190，混匀后进行前处理；混匀的条件为1000 ~ 2000 rpm下涡旋0.5 ~ 1分钟。
作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在S2中，血清或血浆与内标工作液的体积比为200：5 ~ 20，优选为200：10，混匀后进行前处理；混匀的条件为1000 ~ 2000 rpm下涡旋0.5 ~ 1分钟。
作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在S1中，为了增加溶解性、减少溶剂挥发，采用60~80 v/v%甲醇水溶液将盐酸丙卡特罗标准品配制得到标准储备液A。具体可采用：称取盐酸丙卡特罗标准品2mg，加入1.684mL的70 v/v%甲醇水溶液溶解，得到标准储备液A。
为了增加溶解性、减少溶剂挥发，采用40 ~ 60v/v%、优选50v/v%甲醇水溶液将标准储备液A配制得到标准工作液。具体可采用：取适量标准储备液A，用50 v/v%甲醇水溶液进行稀释，所得的标准工作液中丙卡特罗浓度为20ng/mL，然后用50 v/v%甲醇水溶液继续稀释，配制得到丙卡特罗的浓度分别为0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.6 ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16 ng/mL、20 ng/mL的标准工作液。
作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在S1中，内标工作液的配制方法包括：为了避免反复冻融，采用5~15v/v%、优选10v/v%甲醇水溶液将茶碱-D6标准品配制得到标准储备液B，具体可称取茶碱-D6标准品2mg，加入2mL的10v/v%甲醇水溶液。为了增加溶解性、减少溶剂挥发，采用40 ~ 60v/v%、优选50v/v%配制内标工作液，具体可采用：取适量标准储备液B，用50v/v%甲醇水溶液稀释，得到茶碱-D6浓度为50ng/mL的上述内标工作液。作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在S1和S3中，采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测时，高效液相色谱的分析条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱，购自Waters公司；规格为：2.1 mm×50 mm，1.8μm。研究过程中发现，丙卡特罗极性较大，在大水相条件下在色谱柱上保留较好，因此本发明选用的色谱柱为耐受纯水相的色谱柱。
流动相：A相：含1~10mmol/L甲酸铵、0.02~1v/v%甲酸的水，优选为含5mmol/L甲酸铵、0.05 v/v%甲酸的水；B相：甲醇；
流速：0.2~0.4mL/min，优选为0.3 mL/min；
柱温：40 ~ 45℃，优选为45℃；
进样量：10~20 µL，优选为15 µL；
分析时间：7min。
洗脱条件为：
0 ~ 0.01分钟： A相：80 ~ 100%；B相：20~ 0%；
0.02 ~ 1.5分钟：A相：60 ~ 80%；B相：40 ~ 20%；
1.51 ~ 4.0分钟：A相：0%；B相：100%；
4.01 ~ 7分钟：A相：80 ~ 100%；B相：20 ~ 0%。
洗脱条件进一步优选为：
0 ~ 0.01分钟：A相：92 %；B相：8 %；
0.02 ~ 1.5分钟：A相：72 %；B相：28%；
1.51 ~ 4.0分钟：A相：0 %；B相：100 %；
4.01 ~ 7分钟： A相：92 %；B相：8%。
作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在S1和S3中，采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测时，质谱检测的条件为：质谱检测器是SCEIX AB6500检测器，采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM），电喷雾电压（IonSpray Voltage）：2500V；离子源温度（TEM）：550℃；雾化气（Gas1）：65psi；辅助气（Gas2）：60psi。离子对参数：丙卡特罗291.1（母离子）-162.0（子离子）；茶碱-D6 187.1（母离子）-99.0（子离子）。
本发明实施例还涉及上述方法在监测丙卡特罗血药浓度中的应用。可获得如图1所示的血药浓度曲线。监测丙卡特罗血药浓度，对开展与原研药的生物等效性研究具有重要的意义。
下面通过具体实施对本发明实施例的技术方案做进一步的解释和说明，本发明的原料均为市售。所采用的主要原料和仪器如下：
1.仪器设备：
高效液相色谱质谱联用仪，购自SCEIX，型号为AB6500；
离心机，购自湘智，型号为TG20-WS；
氮吹仪，购自杭州奥盛，型号为MD200-1A。
2.试剂与原料：
甲醇购自默克；水购自屈臣氏；甲酸铵、磷酸氢二钾、盐酸丙卡特罗购自Sigma；甲酸购自DIKMA；乙酸乙酯购自Fisher；茶碱-D6购自CATO。
在本发明实施例中，甲醇、甲酸的浓度均为体积百分比浓度。
实施例1
（一）标准溶液的标定
1、标准工作液的配制：精确称取盐酸丙卡特罗标准品2mg，置于2mL冻存管中，加入1.684mL的70 v/v%甲醇水溶液，得到标准储备液A，取适量标准储备液A，用50 v/v %的甲醇水溶液进行稀释，所得的标准工作液中丙卡特罗浓度为20ng/mL，然后继续用上述甲醇水溶液进行稀释，配制成浓度分别为0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.6 ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16 ng/mL、20 ng/mL的丙卡特罗标准工作液，并在-20℃条件下保存。
2、内标工作液的配制：精确称取茶碱-D6标准品2mg，置于2mL冻存管中，加入2mL的10 v/v%甲醇水溶液，得到标准储备液B，取适量标准储备液B，用50 v/v%的甲醇水溶液进行稀释，所得的内标工作液中茶碱-D6浓度为50ng/mL，该内标工作液-20℃条件下保存。
3、前处理：
首先用移液器分别移取10μL标准工作液、10μL内标工作液和190μL空白血浆分别置于2mL离心管中混合制成八种不同浓度的标准溶液，进行前处理：
前处理条件具体为：将上述标准溶液分别在转速为1000 ~ 2000rpm下涡旋混匀30s~1min后，加入200μL 2mol/L磷酸氢二钾溶液，1mL乙酸乙酯，在转速为2000rpm下涡旋混匀10min，14000rpm高速离心10 min，吸取上清液850μL，氮气吹干，加入100μL8v/v%甲醇水溶液涡旋混匀1min溶解。
4、制备标准曲线方程：
利用高效液相色谱质谱联用仪对上述标准溶液进行检测，检测方法同步骤（三）；得到八种不同浓度的丙卡特罗和内标物的标准溶液色谱图，从上述丙卡特罗和内标物的标准溶液色谱图中分别得到丙卡特罗和内标物的峰面积，分别以上述八个不同浓度的丙卡特罗标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述丙卡特罗标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的八种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1=a*x1+ b，并且得出线性方程系数a、b；标准工作液为含有丙卡特罗的溶液，内标工作液为含有茶碱-D6的溶液。
（二）待测样品处理
用移液枪移取200μL血清或血浆待测样品，加入10μL内标工作液，进行前处理，前处理步骤与（一）中的前处理步骤一致，吸取复溶液100μL即为待测样品；
（三）待测样品的检测
使用高效液相色谱质谱联用仪对上述步骤（一）的标准溶液、步骤（二）待测的样品进行检测，得出上述待测样品的丙卡特罗与内标的色谱图，从上述丙卡特罗与内标色谱图中可以得到丙卡特罗与内标峰面积，将丙卡特罗与内标峰面积的比值y1代入上述步骤（一）的标准曲线方程y1=a*x1+ b中，通过计算得到待检测样品中丙卡特罗与内标物的相对浓度x1，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该待检测血液样本中的丙卡特罗的浓度。
色谱分析所使用的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8μm）；流动相为含水（5mmol/L甲酸铵；0.05 v/v%甲酸）和甲醇，梯度洗脱条件如表1所示，流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样量为15µL；分析时间为7min。
表1
Time/min 流速/（mL/min） 水（0.05%FA+5mM甲酸铵）% 甲醇%
0.01 0.3 92 8
0.02 0.3 72 28
1.5 0.3 72 28
1.51 0.3 0 100
4.0 0.3 0 100
4.01 0.3 92 8
7.0 0.3 92 8
质谱检测器是SCEIX AB6500检测器，采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM），电喷雾电压（IonSpray Voltage）：2500V；离子源温度（TEM）：550℃；雾化气（Gas1）：65psi；辅助气（Gas2）：60psi。离子对参数：丙卡特罗291.1（母离子）-162.0（子离子）；茶碱-D6 187.1（母离子）-99.0（子离子）。
获得的实验结果如图2、图3和图4所示，其中，标准溶液中丙卡特罗的色谱图见图2，血浆样本中丙卡特罗的色谱图见图3和图4，丙卡特罗的保留时间为2.7分钟。
实施例2
本实施例中技术方法论证如下：
一、线性范围与定量限
将上述配制的各个浓度的丙卡特罗标准工作液，取10μL，分别加入10μL内标工作液、190μL空白血浆，涡旋混匀30秒 ~ 1分钟后，加入200μL 2mol/L磷酸氢二钾溶液，1mL乙酸乙酯，在转速为2000rpm下涡旋混匀10分钟，14000rpm离心10分钟，吸取上清液850μL，氮气吹干，加入100μL8 v/v%甲醇水溶液涡旋混匀1分钟溶解，进样15μL至LC-MS/MS分析。具体分析条件同实施例1。
丙卡特罗浓度在5pg/mL到1000pg/mL范围内，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以丙卡特罗的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值-丙卡特罗的浓度与内标物的浓度的比值作图，得到标准曲线；结果表明丙卡特罗在5pg/mL到1000pg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.99。
配制系列低浓度标准溶液，将上述配制的10 μL的系列低浓度标准溶液，分别加入10μL内标工作液、190 μL空白血浆，涡旋混匀30秒 ~ 1分钟后，经前处理后进样分析，以3倍信噪比是检出限，10倍信噪比是定量限，结果如下：
（1）检测限（LOD）：丙卡特罗为0.8pg/mL。
（2）定量限（LOQ）：丙卡特罗为3 pg/mL。
二、该方法的回收率和精密度
分别取丙卡特罗标准工作液配制成低低（5pg/mL）、低（15pg/mL）、中（200 pg/mL）、高（800 pg/mL）4种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例1的方法进行测定，重复分析测定5批次，丙卡特罗回收率和精密度分别如表2所示。
表2
加标量 5pg/mL 15pg/mL 200pg/mL 800pg/mL
平均回收率 102.8% 102.7% 98.8% 101.3%
精密度RSD 9.87% 5.58% 7.44% 7.23%
丙卡特罗在4个添加水平范围内的平均回收率为98.8% ~ 102.8%，相对标准偏差为5.58% ~ 9.87%。
综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中丙卡特罗含量，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。血浆经液液萃取吹干复溶后直接进样，使检测过程简便快速，实验成本降低，分析时间短，更利于大通量的样本检测。
实施例3
本实施例用于说明本发明实施例选用梯度的技术效果。
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
1、梯度洗脱条件为：
0 ~ 0.01分钟：A相：100%；B相：0%；
0.02 ~ 1.5分钟：A相：72%；B相：28%；
1.51 ~ 4.0分钟：A相：0%；B相：100%；
4.01 ~ 7分钟：A相：100%；B相：0%。
获得实验结果如图5所示。
2、梯度洗脱条件为
0 ~ 0.01分钟：A相：80%；B相：20%；
0.02 ~ 1.5分钟：A相：72%；B相：28%；
1.51 ~ 4.0分钟：A相：0%；B相：100%；
4.01 ~ 7分钟： A相：80%；B相：20%。
获得实验结果如图6所示。
结果说明：采用梯度洗脱初始条件为100~80 v/v% A相，均能得到预期效果。
实施例4
本实施例用于说明本发明实施例添加磷酸氢二钾的量的技术效果。
采用实施例1中的方法对样本进行检测，区别在于：
1、样品前处理过程中添加磷酸氢二钾的量为50µL、100µL、200µL、300 µL。获得实验结果如表3所示。
表3
添加磷酸氢二钾的量 血浆标准溶液（1000 pg/mL）峰面积
50 µL 690814
100 µL 639565
200 µL 722846
300 µL 754010
结果说明：添加磷酸氢二钾的量为50µL、100µL、200µL、300 µL，均能得到预期效果。
对比例
以下对比例用于说明样品前处理步骤的技术效果。
采用实施例1中的方法对样本进行处理，区别在于：
对比例1：前处理步骤中不加入磷酸氢二钾溶液与加入1~4 mol/L的磷酸氢二钾溶液，获得实验结果如图7和表4所示。
表4
添加磷酸氢二钾的浓度 血浆标准溶液（1000 pg/mL）峰面积 备注
不添加 480425 无
1 mol/L 608957 无
2 mol/L 856219 无
3 mol/L 1049620 无
4 mol/L 1153634 体系呈凝胶状
结果显示：目标物提取率随着磷酸氢二钾溶液浓度升高而增加，但磷酸氢二钾的浓度高于4 mol/L时，体系呈凝胶状，不利于萃取。图7为不加入磷酸氢二钾溶液血浆标准溶液5 pg/mL色谱图，目标物提取率低，信号低，无法满足检测需求。
对比例2：前处理步骤中采用其他萃取剂；其余步骤和条件均与实施例1相同，获得实验结果如图8、图9和表5所示。
表5
萃取剂 血浆标准溶液（1000 pg/mL）峰面积
乙酸乙酯 837886
甲基叔丁基醚 588239
正己烷 233
结果显示：萃取剂采用乙酸乙酯时，提取效果最好，甲基叔丁基醚提取率稍低，图8为甲基叔丁基醚提取血浆标准溶液5 pg/mL色谱图，满足检测需求。萃取剂采用正己烷时，目标物提取率低，图9为正己烷提取血浆标准溶液5 pg/mL色谱图，无法满足检测需求。
对比例3：前处理步骤中复溶液采用0~40v/v%甲醇；其余步骤和条件均与实施例1相同，获得实验结果如图10、图11和图12所示。
结果显示：复溶液采用纯水时，实验结果如图10所示，复溶液采用30v/v%甲醇时，实验结果如图11所示，峰形正常，无溶剂效应，能得到预期效果。复溶液采用40v/v%甲醇时，实验结果如图12所示，溶剂效应明显，峰形变差，无法满足检测需求。
以下对比例用于说明色谱条件的技术效果：
对比例4：
流动相为：A相：含5 mmol/L甲酸铵、0.05 v/v%甲酸的水；B相：乙腈。获得实验结果如图13所示。
结果显示：流动相B相采用乙腈时，信号由甲醇中6.0e5降低到4.0e5，信号降低。
对比例5：
流动相为：A相：水；B相：甲醇。获得实验结果如图14所示。
结果显示：流动相A相采用纯水时，峰形变差，信号降低。
对比例6：
流动相为：A相：0.05 v/v%甲酸的水；B相：甲醇。获得实验结果如图15所示。
结果显示：流动相A相采用0.05 v/v%甲酸的水时，信号由甲醇中6.0e5降低到4.5e5，信号降低。
对比例7：
流动相为：A相：含5 mmol/L甲酸铵的水；B相：甲醇。获得实验结果如图16所示。
结果显示：流动相A相采用5 mmol/L甲酸铵的水时，信号由甲醇中6.0e5降低到3.0e5，信号降低。
对比例8：
流动相为与实施例1相同，不采用梯度洗脱，采用8 v/v% B相等度洗脱。获得实验结果如图17所示。
结果显示：目标物7分钟内未出峰。
对比例9：
流动相为与实施例1相同，初始梯度条件为28 v/v% B相。获得实验结果如图18所示。
结果显示：目标物出峰时间0.9分钟，保留较差，峰形拖尾。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种检测血液中丙卡特罗含量的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1、制备标准曲线方程，包括：采用标准工作液、内标工作液和空白血浆配制得到含有不同丙卡特罗浓度的标准溶液，经前处理后采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；
S2、处理得到待测样品，包括：取待测血清或血浆加入内标工作液，经前处理后得到待测样本；
S3、检测所述待测样品，包括：采用高效液相色谱质谱联用仪对所述待测样本进行检测，将检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中丙卡特罗的浓度；
其中，在S1和S2中，所述前处理包括：将待处理溶液加入1~3 mol/L的磷酸氢二钾溶液和萃取剂，混匀、离心后取上清液干燥，加入复溶液混匀；所述萃取剂选自乙酸乙酯和甲基叔丁基醚中的至少一种；所述复溶液选自0~30 v/v%甲醇水溶液；
高效液相色谱质谱联用仪进行检测时的检测条件为：流动相：A相：含1 ~ 10 mmol/L甲酸铵、0.02 ~ 1v/v%甲酸的水；B相：甲醇；
洗脱条件为：
0 ~ 0.01分钟： A相：80 ~ 100%；B相：20 ~ 0%；
02 ~ 1.5分钟：A相：60 ~ 80%；B相：40 ~ 20%；
51 ~ 4.0分钟：A相：0%；B相：100%；
01 ~ 7分钟：A相：80 ~ 100%；B相：20 ~ 0%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在S1中，标准工作液、内标工作液和空白血浆的体积比为5~20：5~20：195~180，混匀后进行所述前处理；所述混匀的条件为转速1000 ~ 2000rpm涡旋0.5 ~ 1分钟；
在S2中，血清或血浆与内标工作液的体积比为200：5~20，混匀后进行所述前处理；所述混匀的条件为转速1000 ~ 2000rpm涡旋0.5 ~ 1分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述前处理步骤中：
所述待处理溶液与磷酸氢二钾溶液的体积比为210：50~300；
所述待处理溶液与所述萃取剂的体积比为210：800~1200；
所述混匀为转速1500 ~ 2500rpm涡旋5 ~ 15分；
所述离心为转速12000 ~ 14000rpm离心5 ~ 15分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理步骤中：
所取上清液的体积与所述萃取剂的体积之比为800~900：1000；
所述复溶液与所述待测血清或血浆的体积比为1：2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准工作液的配制包括：
采用60~80v/v%甲醇水溶液将盐酸丙卡特罗标准品配制得到标准储备液A；
取适量标准储备液A，用40 ~ 60v/v%甲醇水溶液进行稀释，得到丙卡特罗浓度为20ng/mL的标准工作液；
用40 ~ 60v/v%甲醇水溶液继续稀释，配制得到丙卡特罗的浓度分别为0.1 ng/mL、0.3ng/mL、0.6 ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16 ng/mL、20 ng/mL的标准工作液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标工作液的配制方法包括：
采用5~15v/v%甲醇水溶液将茶碱-D6标准品配制得到标准储备液B；
取适量标准储备液B，用40 ~ 60v/v%甲醇水溶液稀释，得到茶碱-D6浓度为50ng/mL的内标工作液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱分析所使用的色谱柱为WatersACQUITY UPLC HSS T3柱，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；
流速：0.2~0.4mL/min；
柱温：40 ~ 45℃；
进样量：10~20 µL；
分析时间：7min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1和S3中，采用高效液相色谱质谱联用仪检测时的质谱检测的条件为：
电喷雾电压：2500V；
离子源温度：550℃；
雾化气：65psi；
辅助气：60psi。
9.如权利要求1~8任一项所述的方法在监测丙卡特罗血药浓度中的应用。
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