CN110554104B - 一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中咪达那新的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种HPLC‑MS/MS联用检测人血浆中咪达那新的方法，属于生物分析领域。本发明的检测方法包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱‑质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相A为乙腈，流动相B为乙酸铵水溶液；(3)人血浆中咪达那新浓度的测定。本发明以咪达那新‑d10作为内标，采用Waters,ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱进行梯度洗脱，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中咪达那新浓度的重现性、准确度均较好。本发明方法可用于评价咪达那新各剂型的生物等效性。

Description

一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中咪达那新的方法
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及液质联用检测血浆中咪达那新浓度的方法。
背景技术
咪达那新是一种新型的二苯基丁酰胺类毒蕈碱M1/M3受体阻断剂，具有高度膀胱选择性，用于治疗膀胱过度活动症(Overactive Active Bladder,OAB)。它选择性作用于膀胱毒蕈碱M1和M3受体，阻断乙酰胆碱对逼尿肌的收缩作用，令逼尿肌松弛，可显著改善膀胱过度活动症所引起的尿急、尿频、尿禁等症状。膀胱过度活动症(overactive bladdersyndrome,OAB)是常见的泌尿外科疾病，并以排尿障碍为临床特点，以尿频、尿急、急迫性尿失禁等为主的临床症候群。OAB发生率随年龄的增长而升高，因此其越来越受到人们的重视。OAB发生的重要机制是膀胱逼尿肌的异常收缩，主要由胆碱能受体-M3受体调节。因此，胆碱能受体拮抗剂是临床上治疗OAB的一线药物。咪达那新通过拮抗毒蕈碱M1受体抑制乙酰胆碱释放，拮抗毒蕈碱M3受体抑制膀胱平滑肌收缩可有效改善OAB引起的排尿障碍等症状。咪达那新对膀胱的选择性强于唾液腺，对于脑组织中胆碱受体亲和力较低，因此中枢和外周不良反应较少，在保证疗效的基础上，最大限度地减少了不良反应。咪达那新的血药浓度较低，对于其在人体内药物浓度的分析及生物等效性研究国内暂无报道。
目前国内文献仅报道液相色谱法测定咪达那新含量的技术，所用流动相为不挥发性盐而不能用于质谱分析，定量限达不到咪达那新在体内的血药浓度，分析时间长，不适用于大批量生物样本的检测。
鉴于国内尚无咪达那新体内药物分析方法报道，为满足临床大批量样品分析评价药物生物等效性的需求，需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法以及用于检测人血浆中咪达那新浓度的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小，提取回收率较高的检测人血浆中咪达那新浓度的方法。
本发明的技术方案如下：
一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中咪达那新的方法，包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱-质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相A为乙腈，流动相B为乙酸铵水溶液；(3)人血浆中咪达那新浓度的测定；上述提及的梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70；在0.5-0.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至40:60；在0.6-1.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为40:60；在1.8-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至95:5；在2.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在3.0-3.2分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至30:70；在3.2-4.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70。具体的梯度洗脱过程如表1：
表1：咪达那新液相色谱梯度
Figure BDA0002145064480000021
本发明采用HPLC/MS-MS联用检测人血浆中咪达那新时，流动相A采用乙腈，流动相B为1～10mM乙酸铵水溶液，优选的，流动相B可以采用2mM乙酸铵水溶液。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。在一种优选方案中，在流动相B中，以乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.10～0.50％乙酸；在不影响本发明效果的情况下，在流动相B中，以乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.20％乙酸。例如，0.2％乙酸2mM乙酸铵水溶液(以2mM乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.2％乙酸)。
本发明采用HPLC-MS/MS联用检测人血浆中咪达那新时，采用Waters ACQUITYUPLC BEH C8作为色谱柱。进一步优选采用长度为50mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.7μm的Waters ACQUITY UPLC BEH C8作为色谱柱。
进一步的，柱温为30～45℃，优选为35℃。
进一步的，流速为0.2～0.6mL/min，优选为0.4mL/min。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈和乙酸铵水溶液作为流动相，以BEH C8作为色谱柱，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，且重现性好、灵敏度高、分析速度快基质效应影响小。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用HPLC联用检测人血浆中咪达那新时，采用咪达那新-d10作为内标，以氘代咪达那新做内标物，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中咪达那新浓度的重现性、准确度均较好。
在步骤(1)中，本发明对人血浆样品采用液液萃取法进行前处理，采用乙酸乙酯作为萃取剂。采用液液萃取法进行前处理人血浆样品，可以避免血浆中基质杂峰对化合物峰形的影响使检测方法选择性更高，定量下限更低，同时获得令人惊讶的高回收率。本发明对人血浆样品采用液液萃取法进行前处理，以BEH C8作为色谱柱，在其他条件的配合下，咪达那新总体提取回收率为87.35％。
本发明的检测方法还包括配制内标溶液：称取咪达那新-d10对照品，经质量校正系数校正后，以甲醇与水的体积比为50:50的混合溶液分别配制浓度为200μg/ml咪达那新-d10储备液和1.00ng/mL的咪达那新-d10工作液。
在一种优选方案中，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标和萃取剂，涡旋及离心后取上清液，在氮气流下吹干后，与复溶液混合，涡旋，即得待测样品；其中，复溶液为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为30:70。
在一种更优选方案中，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取100μL人血浆样品，加入50μL内标工作液和450μL乙酸乙酯，涡旋及离心后取上清液经氮气流吹干后加入100μL复溶液混合后，即得待测样品。
在一种特别优选方案中，涡旋及离心后取200μL上清液经氮气流吹干后加入100μL复溶液混合后，即得待测样品。
本发明对人血浆样品采用液液萃取法进行前处理，其中涡旋及离心的条件为：涡旋10min，在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min。
本发明在色谱检测时，将待测样品置于自动进样器，进行LC-MS/MS分析，进样量为1～5μL，例如2μL，进样器温度5℃。
本发明的检测方法，步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：
本发明详细的色谱条件为：采用BEH C8作为色谱柱，按照上述提到的洗脱过程进行梯度洗脱，柱温为30～45℃，优选为35℃；流速为0.2～0.6mL/min，优选为0.4mL/min；进样量为1～5μL，例如2μL。
本发明的质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压1500V，离子源温度600℃；咪达那新，[M+H]+，m/z 320.2→238.1，DP值80V，CE值24V，咪达那新-d7，[M+H]+，m/z 330.2→248.2，DP值80V，CE值26V。
本发明的检测方法，步骤(3)人血浆中咪达那新浓度的测定步骤包括：将待测血浆按步骤(1)样品前处理方法制备，按步骤(2)液相色谱-质谱联用检测，记录咪达那新对应的峰面积，将咪达那新和内标的峰面积比值以权重系数w＝1/x2进行线性回归，方程表达式，y＝ax+b，计算得到所述待测血浆中咪达那新的浓度。
本发明的检测方法能够用于临床药代动力学样本监测。临床药物代谢动力学参数的计算的步骤包括：用DAS3.2.8计算药动学参数。用非房室模型(Non-compartmentalanalysis，NCA)分析，计算各受试者的药代动力学参数，包括：Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-t，同时计算各参数的均数和标准差。
采用本发明的技术方案，优势如下:
(1)本发明以氘代咪达那新做内标物，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中咪达那新浓度的重现性、准确度均较好。
(2)本方法使用样本量仅为100μL，所用样本量较少适用于大批量血浆样品检测。本发明的检测方法线性范围为10.0～1000pg/mL，该线性范围较宽，定量下限低，适于分析不同规格给药后的血浆样品，应用范围较广。
(3)本发明的方法进行了包括特异性、准确度、精密度、基质效应、提取回收率、稳定性的全部方法验证，能用于评价咪达那新各剂型在人体内的生物等效性。
附图说明
图1咪达那新子离子扫描图；
图2咪达那新-d10子离子扫描图；
图3LC-MS/MS法测定血浆中咪达那新的特异性色谱图；
(3-1～3-6)6批不同个体空白血浆色谱图；
其中，图3-1～图3-6各图中(a)色谱图为咪达那新，(b)色谱图为咪达那新-d10；
图4是混合空白血浆色谱图；
其中，(a)色谱图为咪达那新，(b)色谱图为咪达那新-d10；
图5是定量下限样品色谱图；
其中，(a)色谱图为咪达那新，(b)色谱图为咪达那新-d10；
图6是健康受试者服用咪达那新片后收集的血浆样品色谱图；
其中，(a)色谱图为咪达那新，(b)色谱图为咪达那新-d10；
图7是12名受试者给予受试/参比制剂咪达那新片后血浆中咪达那新的平均血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
材料与方法
1.仪器与试剂
高相液相色谱(Shimadzu LC-30AD系列)；质谱(API 5500，Applied Biosystems/Sciex)；纯水仪(MilliDirectQ，Millipore)；微量天平(XP6，METTLER TOLEDO)；离心机(HeraeusMuitifuge X1R，ThermoFisher)；振荡器(LPD2500，LE PARD)；氮吹仪(OrganomationMicrovap 11803；NG150-1A，莱普特科学仪器有限公司)。
乙腈(Merck，HPLC级别)，水(超纯水，实验室自制)，乙酸(Aladdin，HPLC级别)，乙酸铵(Aladdin，HPLC级别)，异丙醇(安徽时联特种溶剂股份有限公司，HPLC级别)，甲醇(Merck，HPLC级别)。空白的血浆来源于健康受试者。咪达那新(TLC，批号：1418-068A1)，咪达那新-d10(TLC，批号：3185-048A2)
2.液质条件
液相条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C8,2.1×50mm,1.7μm；柱温：35℃；进样器温度：5℃；流动相A为乙腈；流动相B为0.2％乙酸2mM乙酸铵水溶液(以2mM乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.2％乙酸)；梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70；在0.5-0.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至40:60；在0.6-1.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为40:60；在1.8-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至95:5；在2.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在3.0-3.2分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至30:70；在3.2-4.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70；流速0.4mL/min；洗针方式：Rinse Port Only；弱洗：乙腈：水(30:70，v/v)；清洗体积：500μL；强洗：甲醇：乙腈：异丙醇：水：甲酸(25:25:25:25:25:1,v/v/v/v/v)。
质谱条件：离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；离子极性：正离子(Positive)；检测对象：咪达那新，[M+H]+，m/z 320.2→238.1，DP值80V，CE值24V，咪达那新-d10，[M+H]+，m/z 330.2→248.2，DP值80V，CE值26V。质谱参数：IonSpray Voltage：1500V；TEM：600℃。
3.标准品溶液的配制
咪达那新工作溶液的配制：精密称取两份咪达那新对照品适量，经质量校正系数校正后，用甲醇:水(50:50,v/v)溶解后，得到两份终浓度均为200μg/mL的咪达那新储备液，储备液保存于-20℃冰箱。经储备液检查合格后，精密量取一份咪达那新储备液用甲醇:水(50:50,v/v)稀释，配制一系列浓度为20.0，18.0，10.0，5.00，2.00，1.00，0.40，0.20ng/mL的咪达那新标准曲线样品工作溶液，精密量取另一份咪达那新储备液用甲醇:水(50:50,v/v)稀释。配制浓度为15.0，3.00，0.6ng/mL的QC工作溶液。
咪达那新-d10工作溶液的配制：精密称取咪达那新-d10对照品适量，经质量校正系数校正后，用甲醇:水(50:50,v/v)溶解，得到最终浓度为200μg/mL的咪达那新-d10储备液，储备液保存于-20℃冰箱。精密量取一定量的咪达那新-d10用甲醇:水(50:50,v/v)稀释，配制成浓度为1.00ng/mL的内标工作液。
4.标准曲线样品及质控样品的配制
对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品，其配制过程举例如下：在285μL的空白血浆中加入15.0μL相应的工作溶液，混合均匀。配制体积可据实际情况适当调整。配成含咪达那新浓度分别为10.0，20.0，50.0，100，250，500，900，1000pg/mL的标准曲线样品和浓度分别为10.0pg/mL(LLOQ QC)、30.0pg/mL(LQC)、150pg/mL(MQC)、750pg/mL(HQC)的质控样品。
5.样品前处理
向1.0mL 96孔板中加入100μL的样品(待测生物样品，标准曲线样品、质控样品)；对于双空白样品和空白样品，加入100μL的空白基质。在双空白样品中加入50μL溶剂甲醇:水(50:50,v/v)，除双空白样品在外，在所有孔中加入50μL的内标工作液，后加入450μL萃取剂乙酸乙酯。将96孔板以2000rpm/min涡旋震荡10min。将96孔板在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min。取200μL上清液加入到干净的96孔板中，经氮气流吹干后加入100μL复溶液乙腈:水(30:70，v/v)混匀置于进样室或者相同温度冰箱中待测。
6.方法学考察内容
根据2015年新版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行方法学验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证包括以下内容：特异性、标准曲线、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。
7.生物等效性研究
选取12名健康受试者，受试者服药前0h及服药后、15min、30min、45min、1h、1h15min、1h30min、1h45min、2h、2h20min、2h40min、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h；静脉采血4mL置于5mL无抗凝负压采血管中。2-8℃冰箱静置30min以上，待血液凝集后离心(2～8℃，4000r/min，10min)，分离出上层血浆。分别取两个冻存管分装上清液。其中量取约0.75ml～1.5mL血浆至冻存管a用于检测，剩余的血浆装入另一冻存管b作为备份样本。分装完成后转入超低温冰箱(≤-60℃)冷冻保存。
结果与讨论
1.专属性
本试验所采用的色谱条件下，咪达那新的保留时间为1.12min左右，如图5；内标(咪达那新-d10)的保留时间为1.10min左右，如图4；分别取6种不同来源的空白血浆各100μL，除不加内标外，按样品预处理操作，获得空白血浆样品色谱图，如图3-1～图3-6；定量下限样品色谱图见图5；取健康受试者服用咪达那新后收集的血浆样品，按样品预处理操作，得健康受试者血浆样品色谱图，如图6。
2.准确度、精密度试验
配制含咪达那新浓度分别为10.0pg/mL、30.0pg/mL、150pg/mL、750pg/mL的质控样品，每个浓度各配制6份样品，并配制两条标准曲线(由两套标准曲线样品回归得到)，计算咪达那新的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，记作f，以f代入当天的标准曲线求得实测浓度及实测浓度平均值和准确度，计算批内精密度及准确度，结果见表2。结果表明：除最低定量限(LLOQ)外，咪达那新的批内质控样品的精密度RSD均小于15％，批内准确度RE至少有三分之二不超过±15％，且每个浓度水平至少二分之一数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±15％。最低定量限咪达那新样品的批内质控样品的精密度RSD均小于20％，批内准确度RE至少有三分之二不超过±20％，且每个浓度水平至少有二分之一数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±20％，综上，精密度及准确度均符合要求。
表2批内、批间样品检测的精密度和准确度
Figure BDA0002145064480000081
Figure BDA0002145064480000091
3.基质效应考察
基质样品配制：使用6批来自不同供体的空白血浆，每批空白血浆制备九个重复的双空白样品，按样品预处理操作，得到空白基质提取液，提取之后加入一定的分析物和内标，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平，三个重复)。
溶液样品的配制：以纯水代替空白血浆进行前处理步骤，后将工作溶液进行稀释配制成相应浓度使加入200μL空白基质提取液或200μL纯水提取液后浓度与低、中、高浓度质控样品前处理后进样浓度一致。且每一浓度3个重复样本。
结果显示，咪达那新基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.95～1.05，精密度小于0.9％，血浆基质不影响咪达那新准确定量。基质效应数据结果见表3。
表3基质效应(计算方式：基质效应因子：样品峰面积比/对照溶液峰面积比)
Figure BDA0002145064480000092
4.提取回收率考察
基质样品配制：使用6批不同供体的空白血浆混合而成的血浆，制备18个重复的双空白样品，按样品预处理操作，得到空白血浆提取液，提取之后加入一定的分析物和内标，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平，6个重复)。
质控样品配制：取低、中、高三种浓度的质控样品按照样品处理方法处理，每一浓度水平配制6份。
通过比较单个质控样品中分析物或内标响应值与提取后加入分析物、内标的双空白样品响应值均值，来评价回收率。
回收率的接受标准为：每个浓度水平和所有浓度水平的回收率的精密度应在15％之内。咪达那新提取回收率(以峰面积比值计算)为87.35％，其中低、中、高三个浓度提取回收率分别为90.02％，88.02％，84.01％。结果见表4。
表4待测物提取回收率
Figure BDA0002145064480000101
5.稳定性考察
进样器稳定性：考察精密度、准确度的分析批首次进样分析后，放置于自动进样器(5℃)72h后，再次进样分析，记录色谱图。结果见表5，咪达那新血浆样品处理后的进样溶液在进样器中放置72h稳定性良好，符合生物样品分析的要求。
室温稳定性：将配制好的低、高浓度水平的质控样品，含咪达那新浓度分别为30.0pg/mL，750pg/mL，每个浓度水平的样品混合均匀后，于室温放置24h后，进行LC-MS/MS分析，记录色谱图。结果如表6所示，血浆样品在室温条件下放置24h稳定性良好。
冻融稳定性：新鲜配制含咪达那新浓度分别为30.0pg/mL，750pg/mL的样品，分别放入-80℃冰箱中进行4次冻融循环。接受标准为：稳定性样品的平均测定值与其理论值的％RE不应超过±l5.0％，各浓度水平下稳定性样品测定值的％RSD应≤15.0％。结果见表7，样品在-80℃经过4次冻融循环后，稳定性良好。
长期稳定性：新鲜配制含咪达那新浓度分别为30.0pg/mL，750pg/mL的样品，分别放入-80℃冰箱中冻存45天后检测。接受标准为：稳定性样品的平均测定值与其理论值的％RE不应超过±l5.0％，各浓度水平下稳定性样品测定值的％RSD应≤15.0％。结果见表8，样品在-80℃冻存45天，稳定性良好。
表5进样器稳定性
Figure BDA0002145064480000111
表6室温稳定性
Figure BDA0002145064480000112
Figure BDA0002145064480000121
表7冻融稳定性
Figure BDA0002145064480000122
表8长期稳定性
Figure BDA0002145064480000123
6.人体生物等效性研究
12名健康受试者按试验方案分别给予咪达那新片(受试制剂A，含咪达那新0.1mg)和咪达那新片(参比制剂R，含咪达那新0.1mg)后，用LC-MS/MS法测定血浆中咪达那新的浓度，如图7所示。12名健康受试者按试验方案给予受试咪达那新片和参比咪达那新片后，计算的咪达那新的达峰浓度Cmax，达峰时间Tmax，AUC0-t。受试制剂和参比制剂中咪达那新的AUC0-t、AUC0-∞及Cmax经对数转换后进行方差分析，结果表明：Cmax、AUC0-t、AUC0-∞比值的90％置信区间在80.00％～125.00％范围内。Tmax经非参检验(配对Wilcoxon法)，不同制剂间无显著性差异(P＞0.05)。综上所述，该结果符合《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》中的生物等效性评价要求，认定两制剂具有人体生物等效性。
本发明方法建立了血浆中咪达那新的HPLC-MS/MS测定方法，专属性良好，血浆中内源性物质不干扰样品的测定，咪达那新标准曲线线性范围为10.0～1000pg/mL，线性关系良好：高浓度(750pg/mL)、中浓度(150pg/mL)、低浓度(30.0pg/mL)三个浓度水平的质控样品检测结果的批内和批间精密度均小于15.0％；定量下限的质控样品(10.0ng/mL)检测结果的批内和批间精密度均小于20.0％。咪达那新总基质效应因子为0.95～1.05，精密度小于0.9％，血浆基质不影响咪达那新准确定量。咪达那新提取回收率为87.35％。咪达那新血浆于室温放置24h后稳定性良好；在冷冻\解冻4个循环稳定性良好；血浆样品处理后在5℃自动进样器中放置72h稳定性良好；咪达那新血浆样品在-80℃条件下放置45d稳定性良好，符合生物样品分析要求。
综上所述，本发明方法所建立的HPLC-MS/MS法测定人体血浆中咪达那新浓度的方法符合2015版药典《生物样品定量分析方法验证指导原则》中的相关要求，可用于临床试验的血浆样品分析检测。

Claims (5)

1.一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中咪达那新的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）人血浆样品前处理：取100 μL人血浆样品，加入50 μL内标工作液和450 µL乙酸乙酯，涡旋及离心后取上清液经氮气流吹干后加入100 μL复溶液混合后，即得待测样品；其中，所述内标溶液的配制如下：称取咪达那新-d10对照品，以甲醇与水的体积比为50:50的混合溶液分别配制浓度为200 µg/mL咪达那新-d10储备液和1.00 ng/mL的咪达那新-d10工作液；
（2）液相色谱-质谱联用检测：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为2 mM乙酸铵水溶液，以乙酸铵水溶液的总体积为100%为基准，含有体积比为0.20%乙酸；
（3）人血浆中咪达那新浓度的测定：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱；柱温为30~45℃；流速为0.2~0.6 mL/min；所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70；在0.5-0.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至40:60；在0.6-1.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为40:60；在1.8-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至95:5；在2.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在3.0-3.2分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至30:70；在3.2-4.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70。
2.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中咪达那新的方法，其特征在于，液相色谱条件包括：所述色谱柱的长度为50 mm，直径为2.1 mm，填料粒径为1.7 µm；柱温为35℃；流速为0.4 mL/min。
3.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中咪达那新的方法，其特征在于，所述涡旋及离心的条件为：涡旋10 min，在4℃条件下以4000 rpm/min速度离心10 min；将待测样品置于自动进样器，进行LC-MS/MS分析，进样量为2 μL，进样器温度5℃。
4.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中咪达那新的方法，其特征在于，质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压1500 V，离子源温度600℃；咪达那新，[M+H]+，m/z320.2→ 238.1，DP值80 V，CE值24 V；咪达那新-d10，[M+H]+，m/z 330.2→ 248.2，DP值80 V，CE值 26 V。
5.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中咪达那新的方法，其特征在于，该方法可用于临床药代动力学样本检测。
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