CN114200038B - 液相色谱-质谱联用检测藿香正气口服液中化合物含量的方法 - Google Patents

液相色谱-质谱联用检测藿香正气口服液中化合物含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药剂成分分析技术领域，具体涉及一种液相色谱‑质谱联用检测藿香正气口服液中化合物含量的方法。所述方法包括：先使用液相色谱进行梯度洗脱分离，然后进行质谱检测；检测中，甘草苷、甘草酸、橙皮苷、柚皮芸香苷、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A在负离子扫描模式下检测；水和氧化前胡素、川陈皮素中在正离子扫描模式下检测，其对应的NCE能量分别为甘草苷为50V、甘草酸为30V、橙皮苷为50V、柚皮芸香苷为30V、厚朴酚为70V、和厚朴酚为70V、茯苓酸A 50V、水和氧化前胡素50V、川陈皮素50V。该检测方法重复性和精密度好，而且可以将其中含量较低的水合氧化前胡素和川陈皮素进行定性和定量。

Description

液相色谱-质谱联用检测藿香正气口服液中化合物含量的 方法
技术领域
本发明属于药剂成分分析技术领域，具体涉及一种液相色谱-质谱联用检测藿香正气口服液中化合物含量的方法。
背景技术
藿香正气口服液，中成药名。为祛暑剂，具有解表化湿，理气和中之功效。用于外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的感冒，症见头痛昏重、胸膈痞闷、脘腹胀痛、呕吐泄泻；肠胃型感冒。藿香正气口服液收载于2020版《中国药典》一部，其中记载了采用不同的HPLC方法分别测定橙皮苷的含量、和厚朴酚与厚朴酚的总含量。为了提高并完善藿香正气口服液质量标准，需要检测出藿香正气口服液中指标性成分的含量。
现有《中国中药杂志》记载了余佳文等人建立了同时测定藿香正气口服液中橙皮苷、柚皮芸香苷、和厚朴酚、厚朴酚、甘草苷、甘草酸铵含量的UPLC分析方法，以控制制剂中陈皮、厚朴和甘草浸膏。《HPLC法同时测定藿香正气系列制剂中6种成分的含量》文献记载了王姣等人建立了同时测定藿香正气口服液中橙皮苷、欧前胡素、异欧前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、苍术素含量的HPLC分析。《HPLC法同时测定藿香正气口服液中9种成分的含量》文献中记载了郭大乐等人建立了藿香正气口服液中甘草香豆素、异甘草素、芹糖甘草苷、柚皮芸香苷、甘草苷、川皮苷6种成分的含量检测方法。总之，现有技术不能精确检测藿香正气口服液中指标性成分的含量，特别是含量比较低的有效成分。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种测定藿香正气口服液中的甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚以及茯苓酸A种一种或多种化合物含量的方法，该方法使用液相色谱-质谱联用的方法进行检测，可以有效分离其中一种或多种成分并精确检测出每种成分的含量，可以为藿香正气口服液整体质量控制评价体系的建立提供科学实验依据。
所述液相色谱-质谱联用的方法包括：先使用液相色谱进行梯度洗脱分离，然后进行质谱检测；在质谱检测中，所述甘草苷、甘草酸、橙皮苷、柚皮芸香苷、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A中的一种在负离子扫描模式下检测，或所述水和氧化前胡素、川陈皮素中的一种或多种在正离子扫描模式下检测，所述化合物对应的NCE能量分别为甘草苷为50V、甘草酸为30V、橙皮苷为50V、柚皮芸香苷为30V、厚朴酚为70V、和厚朴酚为70V、茯苓酸A 50V；水和氧化前胡素50V、川陈皮素50V。
进一步，使用质荷比417.1191→135.0071作为甘草苷的检测离子对，使用质荷比579.1719→271.0609作为芸香柚皮苷的检测离子对，使用质荷比609.1825→301.0706作为橙皮苷的检测离子对，使用质荷比821.3965→351.0557作为甘草酸的检测离子对，使用质荷比265.1234→249.0917作为和厚朴酚的检测离子对，使用质荷比265.1234→245.0967作为和厚朴酚的检测离子对，使用质荷比497.3273→423.2904作为茯苓酸A的检测离子对，使用质荷比305.1019→203.0345作为水合氧化前胡素的检测离子对，使用质荷比403.1387→373.0924作为水合氧化前胡素的检测离子对。
进一步，所述质谱仪优选用四级杆轨道阱质谱。
进一步，所述质谱检测的条件为：选择平行反应检测模式；HESI源参数为：喷雾电压-3.0kV/+3.5kV、鞘气(N2)35L/h、辅助气(N2)10L/h、吹扫气(N2)0L/h、毛细管温度350℃、辅助气加热温度350℃；和/或PRM分辨率为17500、隔离宽度为4.0Da、AGC target为2e5、Maximum IT为100ms。
进一步，所述液相色谱可以选用高效液相色谱柱进行分离，也可以选用超高效液相色谱(UHPLC)进行分离，为了达到更好的分离效果，选用选用粒径≤3.7μm的填料为固定相的色谱柱，即超高效液相色谱柱。
进一步，所述液相色谱选用包含流动相A和流动相B的溶液为流动相，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，所述流动相B为0.1％甲酸乙腈；所述梯度洗脱分离的洗脱程序为：
0min≤T≤1min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：5-10:90-95；
1min＜T≤12min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：10-20:80-90；
12min＜T≤20min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：20-27:73-80；
20min＜T≤24min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：27-33:67-73；
24min＜T≤30min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：33-40:60-67；
30min＜T≤33min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：40-48:52-60；
33min＜T≤42min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：48-80:20-52；
T＞42min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：80-95:5-20。
在某些具体实施例中，如果检测对象为藿香正气口服液或者藿香正气丸，供试品溶液的制备为：分别精密量取藿香正气口服液于容量瓶中，用80％甲醇溶液稀释，超声处理10min，放冷，用80％甲醇溶液补足至刻度，16000rpm于4℃离心10min，过0.22μm滤膜得上清液，即供试品溶液。如果为藿香正气丸，则先研细混匀后进行以上步骤配制供试品溶液。
进一步，在检测中，设置内标物为淫羊藿苷，在负离子扫描模式下，NCE能量为50V，检测离子对为721.2349→367.1175；或在正离子扫描模式下，NCE能量为40V，检测离子对为677.2440→531.1864。
进一步，前任一所述检测方法的检测对象也可以替换为包含甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚以及茯苓酸A 9个成分中一种或多种组合物或者藿香正气丸。即前任一所述检测藿香正气丸或含有甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A中的一种或多种化合物的组合物中甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A中一种或多种化合物的含量。
本发明目的在于还提供一种分离藿香正气口服液中化合物的方法，该方法使用超高效液相色谱进行分离，可以有效将同时将藿香正气口服液中的甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚以及茯苓酸A等9个成分进行分离。
进一步，所述方法使用包含流动相A和流动相B的溶液作为流动相，选用粒径≤3.7μm的填料为固定相进行梯度洗脱分离；所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，所述流动相B为0.1％甲酸乙腈；所述梯度洗脱分离的洗脱程序为：
0min≤T≤1min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：5-10:90-95；
1min＜T≤12min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：10-20:80-90；
12min＜T≤20min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：20-27:73-80；
20min＜T≤24min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：27-33:67-73；
24min＜T≤30min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：33-40:60-67；
30min＜T≤33min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：40-48:52-60；
33min＜T≤42min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：48-80:20-52；
T＞42min，所述流动相B与所述流动相A的体积比为：80-95:5-20；
所述藿香正气口服液中化合物为甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A中的一种或多种。
进一步，所述藿香正气口服液可以替换为检测藿香正气丸或者包含甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚以及茯苓酸A中一种或多种的组合物。即所述分离藿香正气口服液中化合物的方法可以用于分离藿香正气丸或含有甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A中的一种或多种化合物的组合物中甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A中一种或多种化合物的含量。
本发明中，“藿香正气口服液”和“藿香正气丸”均为《中国药典》所收录的藿香正气口服液和藿香正气丸。
本发明有益效果在于
本发明提供的液相色谱-质谱联用检测藿香正气口服液中化合物含量的方法可以精确测定其中9种化合物的含量，并且重复性和精密度好，其中，水合氧化前胡素的检测限低达8.9816E－5μg/ml，定量限低达0.0002μg/ml；川陈皮素的检测限低达9.8201E－5μg/ml，定量限低达0.0001μg/ml，可以将含量较低的成分进行定性和定量。
本发明提供分离藿香正气口服液中化合物的方法可以有效将其中9种化合物进行分离，分离度好，可以在45分钟内完成全部化合物的分离。
附图说明
图1为空白溶剂中叠加的9个Q-markers的提取离子流图。
图2为混标溶液中叠加的9个成分的提取离子流图。
图3为藿香正气口服液样品中叠加的9个成分的提取离子流图。
图4为15批次藿香正气口服液样品9个成分的含量差异图。
其中，图4中，S1-S15各个纵坐标(含量)从大到小(从上往下)依次为：川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、甘草酸、茯苓酸A、橙皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，使用的仪器有：Waters I Class超高效液相色谱仪(Waters,Milford,MA,USA)，高分辨质谱质谱仪Q-Exactive-Orbitrap MS(Thermo FisherScientific,San Jose,CA,USA)，KQ-250E超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，江苏，中国)；AX205十万分之一天平(Mettler Toledo,Switzerland)；涡旋混合仪(上海泸西分析仪器厂，上海，中国)，5424R低温高速离心机(Eppendorf,Barkhausenweg 1,Hamburg,Germany)。
本发明实施例中，使用的药品与试剂有：
(1)对照品：甘草苷、甘草酸、橙皮苷、川陈皮素、柚皮芸香苷、厚朴酚、和厚朴酚、水和氧化前胡素、茯苓酸A和淫羊藿苷(内标)。这些对照品由上海源叶生物科技有限公司和上海诗丹德生物技术有限公司提供。
(2)15批次藿香正气口服液(批号：21010012，21010014，21010019，21010020，21010025，21010027，21010028，21010031，21010032，21010033，21010035，21010037，21010038，21010039，21010041)由太极集团重庆涪陵制药厂有限公司提供。
(3)色谱级乙腈、甲醇(Fisher,Fair lawn,NJ,USA)，甲酸(ACS,Wilmington,DE,USA)，实验用水为屈臣氏蒸馏水(广州屈臣氏食品有限公司)。
本发明实施例中，为了检测不同极性部位的成分，制备两种供试品：(1)分别精密量取15批藿香正气口服液0.2ml于10mL容量瓶中，用80％甲醇溶液稀释，超声处理10min，放冷，用80％甲醇溶液补足至刻度，16000rpm于4℃离心10min，0.22μm过膜得上清液，即供试品溶液，取上清液1μL，进入UPLC/Q-Orbitrap-MS系统分析。(2)另分别精密量取15批藿香正气口服液2.5ml于10mL容量瓶中，与(1)相同的方法制备，并进样。
本发明实施例中，标准曲线的制备方法为：精密称取甘草苷、甘草酸、厚朴酚、和厚朴酚、水和氧化前胡素、芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素0.5mg，分别置于1.5mL离心管中，加甲醇1.0mL，制成0.5mg/mL的母液；精密称取茯苓酸A1mg置于1.5mL离心管中，加甲醇1mL，依次稀释，最终制成10μg/mL的母液。应用上述母液用甲醇依次稀释，取甘草苷的6个浓度点：10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL；甘草酸的5个浓度点：60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL；厚朴酚的6个浓度点：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL；和厚朴酚的6个浓度点：10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.626μg/mL、0.3125μg/mL；柚皮芸香苷的6个浓度点：20μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL；橙皮苷的6个浓度点：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL；水和氧化前胡素的6个浓度点：20μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL；川陈皮素的6个浓度点：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.03125μg/mL。茯苓酸A的8个浓度点：0.8μg/mL、0.5μg/mL、0.4μg/mL、0.25μg/mL、0.2μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.05μg/mL。
本发明实施例中，内标溶液的制备方法为：精密称取淫羊藿苷0.5mg，置于1.5mL离心管中，加1mL甲醇，制成0.5mg/mL的储备液。继续稀释，制成1μg/mL的内标溶液。
本发明实施例中，制备一系列浓度的混标溶液用于标准曲线建立：精密称取甘草苷、甘草酸、厚朴酚、和厚朴酚、水和氧化前胡素、芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素0.5mg，分别置于1.5mL离心管中，加甲醇1.0mL，制成0.5mg/mL的母液；精密称取茯苓酸A1mg置于1.5mL离心管中，加甲醇1mL，依次稀释，最终制成10μg/mL的母液。应用上述母液用甲醇依次稀释，取甘草苷的6个浓度点：10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL；甘草酸的5个浓度点：60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL；厚朴酚的6个浓度点：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL；和厚朴酚的6个浓度点：10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.626μg/mL、0.3125μg/mL；柚皮芸香苷的6个浓度点：20μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL；橙皮苷的6个浓度点：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL；水和氧化前胡素的6个浓度点：20μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL；川陈皮素的6个浓度点：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.03125μg/mL。茯苓酸A的8个浓度点：0.8μg/mL、0.5μg/mL、0.4μg/mL、0.25μg/mL、0.2μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.05μg/mL。。
实施例1UHPLC/Q-Orbitrap MS检测条件验证
液相条件：Waters ACQUITY BEH Shield RP18(1.7μm,2.1×100mm)色谱柱，以0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈(B)为流动相，柱温35℃，流速为0.2mL/min，进样量为1μL。洗脱梯度见表1。
表1流动相洗脱梯度
时间/min 乙腈(B) 0.1％甲酸水(A)
0-1 5-10 95-90
1-12 10-20 90-80
12-20 20-27 80-73
20-24 27-33 73-67
24-30 33-40 67-60
30-33 40-48 60-52
33-42 48-80 52-20
42-42.5 80-95 20-5
42.5-45 95 5
质谱条件优化
随着NCE能量的增加，母离子碎片峰度逐渐减小，而特征子离子碎片峰度逐渐增大，能量过高则使特征子离子碎片峰度降低，为使得定量结果更加准确可靠，选择合适的离子对以及NCE能量尤为重要。本发明实施例采用平行反应检测模式(PRM)进行定量分析，优化了目标化合物的HCD-MS2碰撞能量即归一化碰撞能量(normalized collision energy，NCE)。
因此，为优化每个目标成分的NCE能量，在PRM方法中增加了Inclution列表，将11个目标成分甘草苷、甘草酸、橙皮苷、川陈皮素、柚皮芸香苷、厚朴酚、和厚朴酚、水和氧化前胡素、茯苓酸A和淫羊藿苷(内标)的NCE能量均设置为10V、20V、30V、40V、50V、60V、70V、80V，在采用PRM正/负离子扫描模式，配有加热的电喷雾离子源(HESI)。HESI源参数设置如下：喷雾电压-3.0kV/+3.5kV；鞘气(N2)35L/h；辅助气(N2)10L/h；吹扫气(N2)0L/h；毛细管温度350℃；辅助气加热温度350℃。PRM分辨率17500，隔离宽度设置为4.0Da，AGC target为2e5，Maximum IT为100ms的条件下进行质谱检测，并使用Thermo Fisher Xcalibur 4.0软件(Thermo Fisher Scientific)进行数据处理。
遵从NCE能量优化原则，确定负离子扫描模式下甘草苷为50V、甘草酸为30V、橙皮苷为50V、柚皮芸香苷为30V、厚朴酚为70V、和厚朴酚为70V、茯苓酸A 50V和淫羊藿苷50V；正离子扫描模式下，水和氧化前胡素50V、川陈皮素50V和淫羊藿苷40V，具体信息详见表2。
表2PRM参数
实施例2专属性验证
专属性是指在其他成分(杂质、辅料)可能存在的情况下，采用的方法能够准确检测出目标化合物的特性。在实施例1中色谱和质谱条件下，将空白溶剂、混标溶液、藿香正气口服液样品分别进样，正负离子扫描模式下结果如图1-3所示，结果显示，均可以准确检测出9个目标化合物和内标物，没有任何干扰，这表明该方法具有较高的选择性。
实施3线性范围、LODs和LOQs验证
使用制备的一系列浓度的混标溶液，通过绘制峰面积(Asample/AIS)相对于每种分析物浓度(Csample/CIS)的曲线来建立标准曲线。然后对标准曲线进行线性回归，查看所得线性回归方程的相关系数和线性范围。相关系数应满足r2≥0.999，所有样品的浓度应尽可能位于标准曲线最高和最低浓度之间。结果如表3所示，获得了9个目标化合物的线性回归方程，相关系数良好，r2均大0.999。
表3 9个化合物的线性范围
进一步，检测限和定量限分别以信噪比(S/N)为3和10来测量，结果如表4所示，LODs和LOQs的范围分别为8.9816E－5-0.0159μg/mL和0.0001-0.0507μg/mL。
表4 9个化合物检测限和定量限
化合物 LOD(μg/ml) LOQ(μg/ml)
甘草苷 0.0079 0.0195
芸香柚皮苷 0.0111 0.0310
橙皮苷 0.0040 0.0095
甘草酸 0.0159 0.0507
和厚朴酚 0.0052 0.0137
厚朴酚 0.0007 0.0024
茯苓酸A 0.0003 0.0011
水合氧化前胡素 8.9816E－5 0.0002
川陈皮素 9.8201E－5 0.0001
实施4精密度验证
精密度是指多次测定结果互相接近的程度。日内精密度：取同一供试品溶液，在同一天连续进样6次，分别记录9个成分的峰面积，计算峰面积的RSD值。日间精密度：连续三天进同一供试品溶液，每天重复进样三次，计算峰面积的RSD值。结果如表5所示，每个成分的日内和日间精密度均小于5％，这表明所建立的方法精密度良好。
表5 9个化合物的精密度
实施例5重复性验证
通过分析六个平行准备的样品来评估重复性。结果如表6所示，RSD值均在5％以内，表明所建立的方法具有良好的重复性。
表6 9个化合物的重复性
分析物 重复性(RSD,％)
甘草苷 0.93
芸香柚皮苷 1.67
橙皮苷 1.97
甘草酸 2.33
和厚朴酚 1.47
厚朴酚 1.63
水合氧化前胡素 0.74
川陈皮素 0.94
茯苓酸A 0.99
实施例6稳定性验证
在实施例过程中需要测的样品数量较多，检测周期较长，因此要对其相关稳定性进行考察。在样品盘为10℃的情况下，于0、1、2、4、6、8、10、12和24h时分析同一份供试品溶液。结果如表7所示，RSD值均在4％以内，表明在样品盘温度下具有较好的稳定性。
表7 9个化合物的稳定性
实施例7加样回收率验证
精密量取已知含量的藿香正气口服液(1/50稀释的样品)1ml，共9份，再分别加入甘草苷储备液(50μg/mL)49.2、61.5、73.8μL各3份，芸香柚皮苷储备液(50μg/mL)51.5、64.4、77.3μL各3份，橙皮苷储备液(50μg/mL)56.3、70.4、84.5μL各3份，甘草酸储备液(50μg/mL)154.9、193.6、232.2μL各3份，和厚朴酚储备液(50μg/mL)48.3、60.4、90.6μL各3份，厚朴酚储备液(50μg/mL)57.3、71.6、85.9μL各3份，水合氧化前胡素储备液(50μg/mL)6.2、7.8、9.4μL各3份，川陈皮素储备液(10μg/mL)2.6、3.2、3.8μL各3份，并加入5μL内标(500μg/mL)，最后每份均用甲醇补足至2mL。另精密量取已知含量的藿香正气口服液(1/4稀释的样品)1ml，共9份，再分别加入茯苓酸A储备液(1μg/mL)142.4、178、213.6μL各3份，加入6μL内标(1μg/mL)，最后每份均用甲醇补足至2mL。
然后制备供试品溶液，并按实施例1中的色谱条件和质谱条件测定，计算加样回收率。结果如表8所示，加样回收率从90％到105％不等，RSD值从0.58％到4.44％不等。结果表明该方法具有足够的准确性和可靠性。
表8不同浓度的9个化合物的加样回收率和RSD值
实施例9藿香正气口服液样品定量
本发明实施例分析了15批藿香正气口服液样品。每个批次的样品平行准备三份，表8显示了藿香正气口服液中9个化合物定量结果。结果表明，不同批次的含量不同。还发现甘草酸是含量最丰富的化合物，茯苓酸A含量最低，如图4所示。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.液相色谱-质谱联用检测藿香正气口服液中化合物含量的方法，其特征在于，所述藿香正气口服液中化合物为甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚和茯苓酸A；所述方法包括：先使用液相色谱进行梯度洗脱分离，然后进行质谱检测；在质谱检测中，所述甘草苷、甘草酸、橙皮苷、柚皮芸香苷、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A在负离子扫描模式下检测，所述水合氧化前胡素、川陈皮素在正离子扫描模式下检测，所述化合物对应的NCE能量分别为甘草苷为50V、甘草酸为30V、橙皮苷为50V、柚皮芸香苷为30V、厚朴酚为70V、和厚朴酚为70V、茯苓酸A 50V；水合氧化前胡素50V、川陈皮素50V；选用Waters ACQUITY BEHShield RP18色谱柱，1.7μm,2.1×100mm；
所述液相色谱选用包含流动相A和流动相B的溶液为流动相，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，所述流动相B为0.1％甲酸乙腈；所述梯度洗脱分离的洗脱程序为：
时间/min 流动相B 流动相A 0-1 5-10 95-90 1-12 10-20 90-80 12-20 20-27 80-73 20-24 27-33 73-67 24-30 33-40 67-60 30-33 40-48 60-52 33-42 48-80 52-20 42-42.5 80-95 20-5 42.5-45 95 5
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用质荷比417.1191→135.0071作为甘草苷的检测离子对，使用质荷比579.1719→271.0609作为芸香柚皮苷的检测离子对，使用质荷比609.1825→301.0706作为橙皮苷的检测离子对，使用质荷比821.3965→351.0557作为甘草酸的检测离子对，使用质荷比265.1234→249.0917作为和厚朴酚的检测离子对，使用质荷比265.1234→245.0967作为和厚朴酚的检测离子对，使用质荷比497.3273→423.2904作为茯苓酸A的检测离子对，使用质荷比305.1019→203.0345作为水合氧化前胡素的检测离子对，使用质荷比403.1387→373.0924作为水合氧化前胡素的检测离子对。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱仪选用四级杆轨道阱质谱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱检测的条件为：选择平行反应检测模式；HESI源参数为：喷雾电压-3.0kV/+3.5kV、鞘气N235 L/h、辅助气N210 L/h、吹扫气N20 L/h、毛细管温度350℃、辅助气加热温度350℃；和/或PRM分辨率为17500、隔离宽度为4.0Da、AGC target为2e5、MaximumIT为100ms。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，设置内标物为淫羊藿苷，在负离子扫描模式下，NCE能量为50V，检测离子对为721.2349→367.1175；或在正离子扫描模式下，NCE能量为40V，检测离子对为677.2440→531.1864。
6.权利要求5所述的方法用于检测藿香正气丸或含有甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A中的一种或多种化合物的组合物中甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、和厚朴酚、茯苓酸A中一种或多种化合物的含量的用途。
7.分离藿香正气口服液中化合物的方法，其特征在于，所述方法使用包含流动相A和流动相B的溶液作为流动相，选用Waters ACQUITY BEH ShieldRP18色谱柱，1.7μm,2.1×100mm进行梯度洗脱分离；所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，所述流动相B为0.1％甲酸乙腈；所述梯度洗脱分离的洗脱程序为：
时间/min 流动相B 流动相A 0-1 5-10 95-90 1-12 10-20 90-80 12-20 20-27 80-73 20-24 27-33 73-67 24-30 33-40 67-60 30-33 40-48 60-52 33-42 48-80 52-20 42-42.5 80-95 20-5 42.5-45 95 5
所述藿香正气口服液中化合物为甘草苷、甘草酸、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、水合氧化前胡素、厚朴酚、厚朴酚和茯苓酸A。
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