CN115083528B

CN115083528B - 一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN115083528B
Application number: CN202211012492.7A
Authority: CN
Inventors: 成晓亮; 余静; 周岳; 张伟; 郑可嘉
Original assignee: Jiangsu Pinsheng Medical Technology Group Co ltd; Shanghai Ammonia Biotechnology Co ltd; Nanjing Pinsheng Medical Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Pinsheng Medical Technology Group Co ltd; Shanghai Ammonia Biotechnology Co ltd; Nanjing Pinsheng Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-08-23
Filing date: 2022-08-23
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2042-08-23
Also published as: CN115083528A; WO2024040840A1

Abstract

本发明提供了一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法及其应用，所述构建方法包括如下步骤：（1）收集肠道微生物相关代谢物的标准品，将基本信息录入建库系统；（2）将肠道微生物相关代谢物标准品进样至色谱质谱联用仪中，进行色谱洗脱检测与质谱检测，采集得到保留时间及谱图信息；（3）将采集到的保留时间及谱图信息导入建库系统，整合信息，构建得到所述肠道微生物相关代谢物质谱数据库。相较于现有技术而言，本发明构建的肠道微生物相关代谢物质谱数据库更加全面，包含了405种代谢物，可以用于对不同来源的生物样品进行快速、准确的肠道微生物代谢物鉴定，降低了检测成本，大大提高了检测速度和效率，具有重要的应用价值。

Description

一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于肠道微生物相关代谢物领域，涉及一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法及其应用。

背景技术

近年来，肠道微生物结构及其代谢物谱与宿主代谢之间的相互作用已经在各种动物模型和人群中展开研究，实验数据表明，肠道微生物相关代谢物不仅对肠道健康，而且对身体里的许多其他系统（包括大脑）都有巨大的影响；肠道微生物生态失衡与许多疾病的发生具有密切的相关性，如肠易激综合征、肿瘤、肾衰竭、神经类疾病、肥胖与糖尿病等，肠道微生物代谢物作为互补的宿主受体成为关键信号分子会产生重要影响，利用微生物代谢组学可以监测这些“信号分子”的变化及影响。

目前，研究肠道微生物和宿主之间的这一复杂的体系，人体与肠道微生物在参与食物或外源性物质共代谢时产生了大量小分子代谢物，这其中存在一些对宿主细胞、肠道菌信息传递中起关键作用的代谢物。综合调研相关领域文献发现将近300多种常见的微生物-宿主代谢相关产物，包括胆汁酸、短链脂肪酸、氨基酸、苯甲酰和苯基衍生物、吲哚衍生物、脂类、胆碱、酚类、脂类、维生素、激素类以及多胺类等，其在宿主中扮演着重要的角色。但是，大部分文献研究仅针对于某一类代谢物进行靶向定量方法开发，这种模式就会造成成本的增大，如必须购买关注的代谢物的高纯度标准品和同位素重标，同时也会造成检测通量低、深度也不高的状况。

而代谢组学就可以解决以上两个问题（成本高的问题，检测通量及深度问题）。代谢组学中质谱检测平台作为一种相对全面、连续动态、无刺激的分析手段，能够全面的、深度的收集代谢组数据；结合高通量数据库检索等功能就可以实现快速、准确地对大量代谢物质进行鉴定和注释，解决通量及深度问题；而建立适用肠道微生物相关代谢物的鉴定及注释的质谱数据库，用于定性定量鉴定及确证，这将解决耗费财力的购买标准品的问题。

然而，目前现有技术中尚无关于肠道微生物相关代谢物质谱数据库的报道。

因此，如何建立一种适用的肠道微生物相关代谢物鉴定及注释的质谱数据库，并将其用于非靶向或者广泛靶向代谢组学研究中归属于肠道微生物相关代谢物的高通量鉴定和注释，成为了本领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法及其应用，相较于现有技术而言，本发明构建的肠道微生物相关代谢物质谱数据库更加全面，包含了405种代谢物，涵盖了脂肪酸类（Fatty acids）、有机酸类（Organic Acids）、苯类（Benzene）、多胺类（Catecholamines）、维生素及辅酶类（Vitaminsand Cofactors）、肽段类（Peptides）、核苷酸类（Nucleotides）、胆汁酸类（Bile acids）、胆碱代谢类（choline）、碳水化合物类（Carbohydrates）、氨基酸类（Amino Acids）、吲哚类（Indole）、磷脂酰乙醇胺（phoethanolamines）、甘油酯类（Glycerides）和其他类（Others）。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

（1）收集肠道微生物相关代谢物的标准品，将基本信息录入建库系统；

（2）将肠道微生物相关代谢物标准品进样至色谱质谱联用仪中，进行色谱洗脱检测与质谱检测，采集得到保留时间及谱图信息；

（3）将采集到的保留时间及谱图信息导入建库系统，整合信息，构建得到所述肠道微生物相关代谢物质谱数据库。

优选地，所述建库系统为mzvault建库系统。

优选地，步骤（1）中，将基本信息录入建库系统后，还包括计算标准品的精确分子量，存入建库系统。

优选地，所述基本信息包括所述标准品的名称、分子式、CAS号、类别、mol文件（本领域常用的一种记载代谢物结构的文件）及其在公共数据库和/或公共网站中的编号。

优选地，所述基本信息还包括SMILES Description。

优选地，所述公共数据库包括HMDB（Human Metabolome Database，人类代谢组学数据库）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）、SMPDB（The Small Molecule Pathway Database，小分子通路数据库）或METLIN中的任意一种或至少两种的组合，所述公共网站包括ChemSpider。

优选地，步骤（2）中，所述进样是指将标准品与溶剂混合得到标准品溶液，进行进样，所述溶剂包括甲醇、异丙醇或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合。

其中，强极性代谢物的标准品所用溶剂优选甲醇，常规极性代谢物的标准品所用溶剂优选异丙醇。

本发明所述强极性是指XLogP疏水性常数小于0，所述常规极性是指XLogP疏水性常数在0-5之间。

优选地，可以在甲醇或异丙醇中加入二甲基亚砜进行助溶。

优选地，所述标准品溶液的浓度为2-5 mg/mL，例如2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL、3.5 mg/mL、4 mg/mL、4.5 mg/mL、5 mg/mL等。

优选地，根据标准品的极性情况，选择不同的模式进行色谱洗脱检测，常规极性代谢物的标准品采用常规极性模式进行检测，强极性代谢物的标准品采用强极性模式进行检测。

所述常规极性模式中，所用色谱柱为BEH C18柱，所述强极性模式中，所用色谱柱为BEH Amide柱。

优选地，所述常规极性模式中，流动相包括A相和B相，A相为0.05%-0.15%甲酸水溶液（甲酸溶于水，甲酸质量百分含量为0.05%-0.15%），B相为0.05%-0.15%甲酸乙腈溶液（甲酸溶于纯乙腈，甲酸的质量百分含量为0.05%-0.15%）。

上述0.05%-0.15%中的具体数值例如0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%等。

优选地，所述常规极性模式中，色谱的洗脱方式为梯度洗脱，梯度设置为：第0-0.5min，流动相A的体积占比为97%-99%；第0.5-10 min，流动相A的体积占比为1%-3%；第10-16min，流动相A的体积占比为1%-3%；第16-16.1 min，流动相A的体积占比为97%-99%；第16.1-18 min，流动相A的体积占比为97%-99%。

上述97%-99%中的具体数值例如97%、97.2%、97.4%、97.6%、97.8%、98%、98.2%、98.4%、98.6%、98.8%、99%等。

上述1%-3%中的具体数值例如1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3%等。

优选地，所述强极性模式中，流动相包括A相和B相，A相为20-30 mM甲酸铵水溶液，B相为100%乙腈。

上述20-30 mM中的具体数值例如20 mM、21 mM、22 mM、23 mM、24 mM、25 mM、26mM、27 mM、28 mM、29 mM、30 mM等。

优选地，所述强极性模式中，色谱的洗脱方式为梯度洗脱，梯度设置为：第0-0.5min，流动相A的体积占比为4%-6%；第0.5-7 min，流动相A的体积占比为30%-40%；第7-8min，流动相A的体积占比为55%-65%；第8-9 min，流动相A的体积占比为55%-65%；第9-9.1min，流动相A的体积占比为4%-6%；第9.1-12 min，流动相A的体积占比为4%-6%。

上述4%-6%中的具体数值例如4%、4.2%、4.4%、4.6%、4.8%、5%、5.2%、5.4%、5.6%、5.8%、6%等。

上述30%-40%中的具体数值例如30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%等。

上述55%-65%中的具体数值例如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%等。

优选地，所述质谱检测包括正离子扫描模式和负离子扫描模式。

优选地，所述正离子扫描模式包括如下三种加合方式：[M+H]⁺、[M+NH₄]⁺和[M+Na]⁺，所述负离子扫描模式为[M-H]^-。

优选地，所述质谱检测中，质谱参数中的NCE（标准化碰撞能量）设置为10、20、30、40、50和60（6个窗口）。

优选地，所述色谱质谱联用仪为Q Exactive组合型四极杆 Orbitrap质谱仪。

第二方面，本发明提供一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库，所述肠道微生物相关代谢物质谱数据库由如第一方面所述的肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法建立得到。

第三方面，本发明提供一种检测生物样本中的肠道微生物相关代谢物的方法，所述方法包括如下步骤：

（a）按照如第一方面所述的肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法建立得到肠道微生物相关代谢物质谱数据库；

（b）将生物样本与提取试剂混合，提取得到生物样本中的代谢物；

（c）将提取到的代谢物进样至色谱质谱联用仪中，进行色谱洗脱检测与质谱检测，采集得到数据；

（d）将数据导入搜库软件中进行搜库，并与步骤（a）建立得到肠道微生物相关代谢物质谱数据库中的信息进行匹配，根据匹配程度，得到生物样本中的肠道微生物相关代谢物的鉴定结果。

优选地，所述生物样本包括血浆、血清、尿液、粪便、脑脊液、唾液或组织中的任意一种。

优选地，所述色谱洗脱检测包括两次检测：分别为在常规极性模式与强极性模式下进行检测，检测条件与步骤（a）的构建方法中所用的检测条件保持一致。

优选地，所述搜库软件包括CD（Compound Discoverer）软件。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明首次构建了代谢组学研究中肠道微生物相关代谢物的高通量鉴定及注释质谱数据库并展开应用（实际生物样本的检测），通过数据库中包含的代谢物名称、保留时间、分子式、母离子及碎片离子精确质量信息、类别、HMDB ID、KEGG ID、同位素丰度比等对生物样品中的肠道微生物相关代谢物进行快速鉴定和注释，为代谢组学研究提供有效技术支撑和高度的可重复性和可靠性。

相较于现有技术而言，本发明构建的肠道微生物相关代谢物质谱数据库更加全面，包含了405种代谢物，可以用于对不同来源的生物样品如组织、粪便等进行快速、准确地肠道微生物代谢物鉴定，降低了检测成本，大大提高了检测速度和效率。基于本发明的数据库中的信息，也可开发为基于串联四级杆质谱的广泛靶向代谢组学方法。

本发明中提及的代谢组学技术中肠道微生物相关代谢物质高通量鉴定及注释质谱数据库构建的标准操作流程，是基于Thermo Scientific Q Exactive 组合型四极杆Orbitrap 质谱仪（UPLC-HR-MS）基础上进行；本数据库还支持多种格式导出如.txt、.msp、.csv等，适用于多种代谢组学分析软件基于本谱图库进行比对；本数据库也已经开发html网页格式，用于代谢物快速查找。

值得一提的是，本发明首次提出了在采集标准品信息时，将质谱条件中的标准化碰撞能量（NCE）设置为：10、20、30、40、50、60，实现了一次进样同时完成6种不同碰撞能量（10 eV、20 eV、30 eV、40 eV、50 eV、60eV）下产生的一级和二级谱图的采集，这样设置的优势在于：（1）使用不同碰撞能量，能得到更多的碎片离子，采集到更多的谱图信息，建立的数据库信息更全面可信，有利于与实际复杂样本的匹配；（2）6种不同碰撞能量下的采集在一次进样中完成，避免了多次进样，大大缩短了检测时间，并节约了生物样本。

附图说明

图1是mzvault建库系统中质谱数据库代谢物标准品信息录入界面。

图2是建库过程中UPLC HR-MS高分辨质谱质谱方法设置界面。

图3是本发明构建的肠道微生物相关代谢物质谱数据库中405种代谢物分类统计图。

图4是待测样本检测过程中UPLC HR-MS高分辨质谱数据采集界面。

图5是待测样本的质谱原始数据图（上图为常规极性色谱模式；下图为强极性色谱模式）。

图6是待测样本中代谢物的鉴定过程中CD搜库系统的鉴定参数设置界面。

图7是待测样本中代谢物的鉴定过程中CD搜库系统的鉴定结果界面。

图8是待测样本与本发明构建的数据库之间的L-酪氨酸匹配镜像对比图。

图9是待测样本与本发明构建的数据库之间的L-苯丙氨酸匹配镜像对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1

本实施例提供一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法，具体步骤如下：

1 肠道微生物相关代谢物基础信息录入

将收集到的肠道微生物相关代谢物的信息包括中文名称、英文名称、分子式、CAS号、代谢物生物类别、代谢物类别亚类、mol文件、HMDB ID、KEGG ID、ChemSpider ID、SMILESDescription等，录入mzvault建库系统中新建的质谱数据库，同时mzvault建库系统会依据代谢物的分子式以及分子中各元素的天然丰度比，计算出代谢物的精确分子量，保存在质谱数据库后台，等待标准品谱图导入时进行分子量的比对；mzvault建库系统中质谱数据库代谢物标准品信息录入界面参见图1。

2 取单个肠道微生物相关代谢物的标准品加溶剂溶解，配制成浓度为2-5 mg/mL（按照各个标准品的质谱信号大小做适当调整）的标准溶液，其中强极性代谢物标准品的溶剂为甲醇，常规极性代谢物标准品的溶剂为异丙醇，存在溶解度特别低的代谢物标准品可以适量添加二甲基亚砜（DMSO）促进溶解；

3 设定超高效液相色谱参数确定代谢物标准品的色谱保留时间

3.1 色谱柱：常规的极性代谢物标准品选用Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1mm×1.8 μm)；强极性代谢物标准品选用Acquity BEH Amide柱(100 mm×2.1mm×1.7 μm)；各标准品的极性信息见表1；

3.2 流动相：常规的极性代谢物标准品选用流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；强极性代谢物标准品选用流动相A：25 mM甲酸铵水溶液（pH 9.0）；流动相B：纯乙腈；

3.3 色谱梯度：

常规的极性代谢物标准品梯度如下：

强极性代谢物标准品梯度如下：

3.4 其他条件：正负离子模式下常规的极性代谢物标准品选用流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；色谱柱的柱温：40℃；正负离子模式下强极性代谢物标准品选用流速：0.4mL/min；进样量：5 μL；色谱柱的柱温：50℃；

4. 优化高分辨质谱联用仪的质谱条件确定代谢物标准品的母离子及碎片离子谱图

4.1 离子源参数：电喷雾离子源（ESI源）；喷雾（Spray Voltage）电压：3.5kV（正离子模式）/2.8 kV（负离子模式）；离子源（Vaporizer Temp）温度：350℃；离子传输管温度（ITT Temp）：275℃；鞘气（Sheath Gas）流速：40 arb；辅助气（Aux Gas）流速：10 arb；

4.2 监测模式：所有代谢物标准品溶液均分别选择正离子（ESI⁺）和负离子（ESI^-）模式下的数据依赖扫描DDA（Full MS-ddMS2（Top N））模式；

4.3 通用设置：采集时间：18 min或12 min（与色谱梯度时间保持一致）；电离（Polarity）模式：正离子或负离子（与离子源设置保持一致）；

4.4 一级质谱参数：一级分辨率：70,000；最大注入时间：100 ms；扫描质核比范围：70-1050 Da；

4.5 二级质谱参数：二级分辨率：17,500；最大注入时间：50 ms；扫描质核比范围：70-1050 Da；Top N：10（选择响应强度排名前10的离子进入质谱）；隔离窗口：1.5 m/z；标准化碰撞能量（NCE）：10、20、30、40、50、60；动态排除时间：4.0 s；质谱方法设置界面见图2。

5 进行代谢物标准品质谱检测

根据代谢物标准品的极性特点（具体见表1），选择最合适的色谱及质谱条件进行代谢物标准品溶液的质谱检测；

6 进行代谢物标准品质谱数据库构建

代谢物标准品质谱检测环节完成后，利用Xcalibur系统将代谢物标准品的母离子以及子离子经CE碰撞能量下获得的不同碎片离子谱图导入mzvault系统中对应的代谢物栏，此时，该代谢物的质谱图及保留时间就存在于mzvault系统中了；重复以上环节，最终本发明构建了405种肠道微生物相关代谢物质谱数据库（命名为Microbial metabolitelibrary），数据库中代谢物的统计图见图3，详细信息汇总于表1。

表1

实施例2

本实施例提供一种检测血浆样本中肠道微生物相关代谢物的方法，具体如下：

血浆样本取自江苏省人民医院内分泌科健康志愿者，采集前该志愿者已知晓并同意，血浆样本的采集及使用符合医学领域必须遵循的伦理规范和原则。

1 待测样本制备

准确移取血浆100 μL，加入纯甲醇进行蛋白沉淀，涡旋混匀后并至于-80℃下静置2小时用于肠道微生物相关代谢物提取；提取完成后，于4℃下、12000 rpm离心10 min，将上清液均匀分成2份进行冻干，上机前，一份冻干样本中加入100 μL 75%乙腈溶液复溶样本中存在的强极性代谢物，另一份冻干样本中加入100 μL 30%乙腈溶液复溶样本中存在的常规极性代谢物，复溶液转移进入进样小瓶中作为待测样本备用；

2 待测样本质谱检测

由于生物样本中含有的肠道微生物相关代谢物的极性差异较大，将同一份待测样本经过两种不同极性（强极性或常规极性）色谱条件进行分离，最后注入质谱中进行分析。两种极性的色谱条件设置与实施例1中标准品所用条件一致。质谱条件中，质谱参数中的NCE（标准化碰撞能量）设置为20、40、60（1个窗口，在实际采集中仪器会根据不同离子优选出一个最适宜的混合能量，相当于从20-60区间内选一个能量赋予该离子），其他与实施例1中标准品所用条件一致。

样品的数据采集界面见图4，采集到的原始谱图见图5（上图为常规极性色谱模式下的谱图，下图为强极性色谱模式下的谱图）。

3 待测样本质谱结果鉴定

待测样本质谱检测完成后，将质谱原始数据导入CD（Compound Discoverer）系统开始质谱数据库搜库（参数界面见图6），进行肠道微生物相关代谢物鉴定，CD系统在搜库过程中，根据预设定的鉴定参数（一级/二级质量数误差小于5 ppm；二级谱库匹配大于70；保留时间误差小于0.5 min等），在待测样本的质谱原始数据中寻找各种肠道微生物相关代谢物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位素信息等，与我们在实施例1中已经构建的肠道微生物相关代谢物质谱数据库中录入的信息进行比对，然后根据系统中设定的鉴定结果判定标准。具体地，CD系统进行搜库时，系统会根据匹配结果计算待测样中各肠道微生物相关代谢物的mzvault best match score值，当mzvault best match score ≥70则可被确证为阳性结果，即待测样中含有此肠道微生物相关代谢物，就可以筛选出符合鉴定标准的肠道微生物相关代谢物相关信息，如代谢物名称、保留时间、分子式、分子量、偏差、mzvault best match score值以及在样本中鉴定出的代谢物的峰响应强度（鉴定结果界面见图7）。

鉴定结果：待测血浆样本经过肠道微生物相关代谢物质谱数据库最终鉴定出241种肠道微生物相关代谢物（mzvault best match score≥70），为节约篇幅，不再赘述代谢物的具体信息，仅列出HDMB ID，相关代谢物的信息可查找表1进行对应。鉴定到的代谢物的HDMB ID如下：HMDB0000500、HMDB0000292、HMDB0000221、HMDB0060038、HMDB0011637、HMDB0002340、HMDB0000812、HMDB0004370、HMDB0003164、HMDB0028929、HMDB0000893、HMDB0000267、HMDB0001201、HMDB0031321、HMDB0000535、HMDB0000156、HMDB0006409、HMDB0000975、HMDB0004095、HMDB0000613、HMDB0000807、HMDB0000157、HMDB0012328、HMDB0013713、HMDB0002274、HMDB0002285、HMDB0002581、HMDB0060002、HMDB0001341、HMDB0003447、HMDB0012252、HMDB0003405、HMDB0002117、HMDB0059999、HMDB0000626、HMDB0000619、HMDB0000867、HMDB0002003、HMDB0001397、HMDB0002006、HMDB0001432、HMDB0059773、HMDB0240254、HMDB0000128、HMDB0002035、HMDB0029738、HMDB0002092、HMDB0000719、HMDB0003072、HMDB0000176、HMDB0000962、HMDB0059805、HMDB0003152、HMDB0000407、HMDB0002189、HMDB0000740、HMDB0001488、HMDB0000045、HMDB0000056、HMDB0010319、HMDB0000235、HMDB0013751、HMDB0000472、HMDB0002231、HMDB0001624、HMDB0004259、HMDB0000306、HMDB0000752、HMDB0001476、HMDB0000517、HMDB0000511、HMDB0000094、HMDB0001885、HMDB0000254、HMDB0002199、HMDB0000215、HMDB0000673、HMDB0000122、HMDB0000194、HMDB0000792、HMDB0002259、HMDB0000763、HMDB0006116、HMDB0000002、HMDB0002579、HMDB0002486、HMDB0000073、HMDB0002100、HMDB0002586、HMDB0000423、HMDB0000637、HMDB0000064、HMDB0000168、HMDB0000557、HMDB0029412、HMDB0003229、HMDB0000686、HMDB0000466、HMDB0000822、HMDB0000357、HMDB0061741、HMDB0002226、HMDB0000400、HMDB0001873、HMDB0000661、HMDB0000193、HMDB0000043、HMDB0002925、HMDB0000881、HMDB0001972、HMDB0002243、HMDB0003345、HMDB0002991、HMDB0000734、HMDB0000840、HMDB0000097、HMDB0000806、HMDB0000426、HMDB0000821、HMDB0000510、HMDB0001401、HMDB0000230、HMDB0000700、HMDB0000696、HMDB0000951、HMDB0001276、HMDB0033724、HMDB0000019、HMDB0000068、HMDB0000929、HMDB0007098、HMDB0011530、HMDB0000755、HMDB0000502、HMDB0000733、HMDB0002215、HMDB0012162、HMDB0000895、HMDB0000689、HMDB0002183、HMDB0000910、HMDB0000020、HMDB0000098、HMDB0001999、HMDB0001565、HMDB0000134、HMDB0094657、HMDB0000638、HMDB0004437、HMDB0000883、HMDB0000022、HMDB0002172、HMDB0000555、HMDB0000008、HMDB0000232、HMDB0000467、HMDB0004461、HMDB0001901、HMDB0000150、HMDB0000303、HMDB0000243、HMDB0002302、HMDB0002641、HMDB0011631、HMDB0000163、HMDB0033193、HMDB0000904、HMDB0000158、HMDB0001256、HMDB0013678、HMDB0002642、HMDB0000663、HMDB0000132、HMDB0034297、HMDB0002580、HMDB0000532、HMDB0001900、HMDB0034146、HMDB0000708、HMDB0000606、HMDB0003633、HMDB0000058、HMDB0000892、HMDB0000033、HMDB0000161、HMDB0000707、HMDB0002068、HMDB0000048、HMDB0000682、HMDB0000484、HMDB0029739、HMDB0000452、HMDB0001866、HMDB0000917、HMDB0000167、HMDB0004989、HMDB0000191、HMDB0000187、HMDB0000152、HMDB0033774、HMDB0000210、HMDB0000617、HMDB0011567、HMDB0000716、HMDB0008923、HMDB0000039、HMDB0000172、HMDB0000192、HMDB0001190、HMDB0000182、HMDB0001160、HMDB0000195、HMDB0000326、HMDB0000631、HMDB0000729、HMDB0000162、HMDB0000205、HMDB0000902、HMDB0000244、HMDB0000148、HMDB0003320、HMDB0000669、HMDB0000259、HMDB0000202、HMDB0000159、HMDB0000679、HMDB0000849、HMDB0000946、HMDB0000491、HMDB0061740、HMDB0000620、HMDB0000721、HMDB0000925、HMDB0033567、HMDB0004073、HMDB0000896、HMDB0000634、HMDB0000667、HMDB0000139、HMDB0000518、HMDB0000138。

同时以鉴定到的L-酪氨酸（HMDB0000158）和L-苯丙氨酸（HMDB0000159）为例，详细解读待测样本与本发明构建的数据库的匹配结果：待测样本中的代谢物经过前处理后，通过色谱进行分离最终进入质谱进行二级谱图的采集，数据采集完成后，将采集到的二级谱图数据通过CD软件与本发明构建的肠道微生物相关代谢物数据库进行匹配，结果最终以代谢物匹配镜像对比图的形式给出（见图8和图9），镜像对比图的上半部分为待测样品中实际采集到的未知代谢物的二级质谱图，下半部分为本发明构建的数据库中参考代谢物的二级谱图；通过代谢物匹配镜像对比图可以直观的看到，待测样本与建立的数据库中相应代谢物匹配上的碎片离子较多，结果可信。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种肠道微生物相关代谢物质谱数据库，其特征在于，所述肠道微生物相关代谢物质谱数据库包含了405种代谢物，其中包含代谢物的名称、保留时间、分子式、母离子及碎片离子精确质量信息、类别、HMDB ID、KEGG ID和同位素丰度比；

所述肠道微生物相关代谢物质谱数据库由包括如下步骤的肠道微生物相关代谢物质谱数据库的构建方法建立得到；

所述进样是指将标准品与溶剂混合得到标准品溶液，进行进样，所述溶剂包括甲醇、异丙醇或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合，所述标准品溶液的浓度为2-5 mg/mL，根据标准品的极性情况，选择不同的模式进行色谱洗脱检测，常规极性代谢物的标准品采用常规极性模式进行检测，强极性代谢物的标准品采用强极性模式进行检测，所述常规极性模式中，所用色谱柱包括BEH C18柱，所述强极性模式中，所用色谱柱包括BEH Amide柱，所述质谱检测中，质谱参数中的NCE设置为6个窗口，分别为10、20、30、40、50和60，所述色谱质谱联用仪为Q Exactive组合型四极杆Orbitrap质谱仪；

2.一种检测生物样本中的肠道微生物相关代谢物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（a）将生物样本与提取试剂混合，提取得到生物样本中的代谢物；

（b）将提取到的代谢物进样至色谱质谱联用仪中，进行色谱洗脱检测与质谱检测，采集得到数据；

（c）将数据导入搜库软件中进行搜库，并与权利要求1所述的肠道微生物相关代谢物质谱数据库中的信息进行匹配，根据匹配程度，得到生物样本中的肠道微生物相关代谢物的鉴定结果。

3.如权利要求2所述的检测生物样本中的肠道微生物相关代谢物的方法，其特征在于，所述生物样本包括血浆、血清、尿液、粪便、脑脊液、唾液或组织中的任意一种。

4.如权利要求2或3所述的检测生物样本中的肠道微生物相关代谢物的方法，其特征在于，所述色谱洗脱检测包括两次检测：分别为在常规极性模式与强极性模式下进行检测，检测条件与权利要求1中所述的构建方法中所用的检测条件保持一致。