CN109521113A - 一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法 - Google Patents

一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物分析方法领域，具体地涉及一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，使用气相色谱‑质谱联用检测肉仔鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物和代谢通路的变化，从而确定酵母培养物对肉仔鸡盲肠代谢调控及代谢产物的影响。代谢组学的数据显示酵母培养物的饲喂，盲肠差异代谢产物主要涉及氨基酸代谢、胆固醇代谢，并且参与脂肪、维生素消化和吸收过程。

Description

一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法
技术领域
本发明涉及生物分析方法领域，具体地涉及一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法。
背景技术
生物体内数以万亿计的微生物群落与其寄生的宿主保持着互惠共生的关系。这些微生物拥有超过人类基因组的几百倍的基因编码，其基因总和为“微生物组”。而肠道微生物菌群就是近代学者们发现的一个富含微生物群的微生物组。有关肠道菌群的研究已经是当今的一个热门领域。它与许多疾病如代谢类综合症、肥胖等发生和发展都密切相关。肠道菌群是通过影响宿主的代谢能力和免疫能力，从而影响宿主的健康。因此，探究酵母培养物这类微生态制剂对鸡肠道微生物菌群及其代谢物的影响，进一步推进对酵母培养物保健作用机制的理解，对研究家禽肠道微生物区系，改善肠道健康和预防疾病起到指导作用。
肠道微生物的功能包括：营养代谢功能及抑菌作用、生物屏障免疫功能和促进生长发育功能。传统的研究肠道微生物的方法是纯培养，主要是通过提供一些必要的营养和存活条件来维持微生物的正常生长，如平板培养。但肠道中寄生的微生物大多为厌氧型，且种类繁多，另有报道约100-1000多种细菌很难甚至不可培养，因此传统的培养方式已经不能满足研究的需要。
酵母及其培养物的研究及应用始于19世纪20年代，在动物生产中受到了业界广泛青睐。酵母培养物营养丰富、成分复杂，主要由酵母代谢产物、活酵母菌、培养基3大部分组成。多年科学研究和生产应用实践证明，酵母培养物是通过其代谢产物来调节动物胃肠道中微生物区系的数量和平衡，提高动物的生产力水平，优化饲料营养价值，调节消化道微生态、改善动物健康状态。
随着代谢组学的发展，肠道内环境研究方法己逐渐被用于系统地研究不同环境、营养水平队及肠道菌群的改变对动物机体代谢物的变化。当饲养环境、日粮结构及和营养水平等发生变化以后，肠道内的代谢产物也会随之发生变化。利用代谢组评价不同饲粮对动物生长代谢的影响，在小鼠、猪和牛等方面的试验较多，但在家禽方面的研究却相对较少。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，利用GC/MS的代谢组学方法研究肉鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物变化，以及对其代谢通路的影响。最后对42日龄肉鸡盲肠内容物进行了检测，最终共检测并确认盲肠内容物中86种不同代谢物，随后通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中的代谢通路，找到与差异代谢产物相关的信息。
解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明设计了一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，使用气相色谱-质谱联用检测肉仔鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物和代谢通路的变化，从而确定酵母培养物对肉仔鸡盲肠代谢调控及代谢产物的影响。
所述的气相色谱-质谱联用的检测条件为：
气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱，柱温70℃，保留5min，以4℃/min升温至100℃，保持5min；以10℃/min升温至150℃，保持10min；以5℃/min升温至240℃，保持8min；以10℃/min升温至270℃，保持5min；载气为99.999％高纯He；柱前压7.62psi，载气流量1.0mL/min；进样量1μL；分流比50：1，溶剂延迟时间3min；
质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；接口温度280℃；质量范围20～800amu。
所述的不同发酵时间产出的酵母培养物是由吉林农业大学吉农博瑞研发中心提供的发酵时间分别为12h、24h、36h、48h、60h的五种酿酒酵母培养物和达农威中国有限公司提供的达农威益康VXP。
所述的盲肠内容物在进入气相色谱-质谱联用仪之前需要前处理，处理的步骤为：称取冻干样品0.05g，将样品于1mL PE管中，分别加入100μL的20mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，混合时使用漩涡振荡器震荡30s，然后放于37℃水浴锅中肟化反应90min；取出后加入含1％TMCS的BSTFA衍生试剂200μL，于70℃反应60min；衍生结束后，分别将各组样品进行离心，10000r/min离心10min，取上清液100ul，转移至GC瓶中，加入400uL正己烷定量至500uL，采取自动进样模式，进入气相色谱-质谱联用仪进行分析。
所述的分析为：待测样品进行GC-MS检测，在获得TIC图后对各色谱峰成分进行识别鉴定；GC-MS检测获得的原始数据通过GC-MS仪器工作站软件Xcalibur 1.2版本由RAW格式转化为netCDF格式，使用美国安捷伦公司，用于拆分TIC中的重叠峰的软件NISTAMDIS程序，对数据进行预处理，主要有降噪、保留时间校正、峰对齐和反卷积等数据标准化分析等。并且依据峰在GC/MS总离子流图中的保留时间，选择图谱中共有的色谱峰，将质谱图中检测化合物以及其保留指数通过NIST11库中作对比，完成峰的鉴别。
选择保留指数和标准品的保留时间库中可能性>70％的化合物为鉴定化合物。
还包括多元统计分析步骤，具体为：
将GC/MS标准化数据矩阵，即鉴定的代谢物名称和色谱峰面积校正结果，导入SIMCA-P+14.1.0软件(Umetrics AB,Sweden)软件，进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析；采用PCA主成分分析的方法来评价组间样本的分布状况，通过OPLS-DA模型及其模式下的S-Plot寻找到的代谢差异物，生物标志物筛选的标准为变量权重重要性排序VIP＞1，且t-检验的P＜0.05；利用KEGG数据库查询生物标志物的代谢通路。
本发明的有益效果是：
本发明思路清晰，建立了一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法。对42日龄肉鸡盲肠内容物进行了检测，最终共检测并确认盲肠内容物中86种不同代谢物，随后通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中的代谢通路，找到与差异代谢产物相关的信息。本发明着重比较生产性能差异较大的两组盲肠内容物，分别为饲喂发酵24h和60h的酵母培养物。两组肉鸡盲肠内容物中共有6种差异代谢产物发生显著性变化，丙氨酸、亮氨酸、苯乙酸、呋喃甘露糖、阿拉伯糖醇、胆固醇。两组差异代谢物质比较，丙氨酸、亮氨酸、苯乙酸含量升高；呋喃甘露糖、阿拉伯糖醇、胆固醇含量下降。这些物质主要涉及以下典型代谢途径苯丙氨酸代谢、丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢、胆固醇代谢、甾体激素合成、脂肪消化和吸收、维生素消化和吸收等。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明的实施例1的七种样品的GC/MS总离子流色谱图(TIC)；从上到下依次为M-对照组、A-12h、B-24h、C-36h、D-48h、E-60h、N-VXP；
图2为GC-MS谱PCA分析散点图；
图3为B-24h、E-60h的OPLS-DA图；
图4为B-24h、E-60h的S-plot图。
具体实施方式
实施例1：
材料的准备：
1)试验动物及添加剂：
AA肉仔鸡购自吉林德详公司；酿酒酵母培养物由吉林农业大学吉农博瑞研发中心提供(发酵时间分别为12h、24h、36h、48h、60h)；达农威益康VXP(达农威中国有限公司)。
2)主要试剂：
N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA含1％TMCS)、三甲基氯硅烷(TMCS)(美国Sigma-Aldrich公司)、吡啶(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、正己烷(美国TEDIA公司)、甲氧胺盐酸盐(美国Sigma-Aldrich公司)。
3)主要仪器与软件
Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)，配有Agilent化学工作站：MSD Chem station(E.02.01.1177,Agilent)，自动进样器(Agilent7683)，Agilent HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱。MIKRO-22R台式低温冷冻离心机(德国Hettich公司)，恒温水浴锅(HSC-24A)，冷冻干燥机(FD-1，北京博医康有限公司)，分析天平。
本实施例采用完全随机分组原则，将体重相近、健康状态良好的1日龄AA肉仔鸡336只，随机分配到7个处理组中，每组6个重复，每个重复8只。预饲7天，饲喂基础日粮，从第8天开始，在基础日粮中添加5个时间差异化培养物的酿酒酵母培养物，各处理组添加量为0.192％(比例为发酵液干物质质量/饲料质量)，日粮分配如下表1所示，分组情况针对检测酵母培养物对盲肠代谢物变化。
表1试验分组及日粮分配
注：A-E组酿酒酵母培养物添加量:0.192％(干重比例)；N组，在基础日粮基础上添加1％“益康VXP”饲料添加剂。各组肉仔鸡组间初始体重差异不显著。
1～21天饲喂前期基础日粮，22～42天为饲喂后期基础日粮。日粮配制是依据NRC(1994)和AA肉鸡饲养标准，日粮中不添加任何抗生素药物成分，试验日粮成分见表2。试验前对鸡舍清理消毒，采用双层笼养，肉仔鸡自由采食、饮水，鸡舍内保持合理的温度、湿度及通风，每日进行粪便清理。免疫程序于7天和21天进行滴鼻点新城疫免疫；14天和28天进行法氏囊免疫。
表2基础日粮组成及营养成分(风干基础)
日粮组成 1-21天 22-42天 营养成分 1-21天 22-42天
玉米 52.07 55.57 代谢能(MJ/kg) 12.746 12.719
大豆粕 35.50 34.00 粗蛋白(％) 20.722 19.609
鱼粉 5.00 3.60 钙(％) 0.910 0.865
大豆油 4.00 3.5 总磷(％) 0.676 0.584
磷酸氢钙 1.00 0.70 有效磷(％) 0.447 0.356
石粉 1.00 1.20 赖氨酸(％) 1.347 0.459
食盐 0.30 0.30 蛋氨酸(％) 1.248 0.432
赖氨酸 0.04 0.04
蛋氨酸 0.09 0.09
1％预混料 1.00 1.00
合计 100 100
注：每千克预混料包含:维生素A，5000IU；维生素D3，1500IU；维生素E，15IU；维生素K3，0.8mg；维生素B12，0.01mg；叶酸，0.5mg；烟酸，50mg；泛酸，8mg；生物素，0.1mg；吡哆醇，2.2mg；核黄素，4.4mg；硫胺素，1.6mg。每千克饲料包括:Fe,80g；Cu,6mg；Mn,100mg；Zn,80mg；I,0.4mg；Se,0.2mg。
样品采集和处理
肉鸡于42日龄进行屠宰实验，每个重复选2只宰杀并解剖，称取一侧盲肠内容物1g于5mL离心管中，随后加入2.5mL超纯水进行漩涡震荡溶解，溶解后离心，5000rpm/min，离心10min后取1mL上清液，在上清液中加200μL的25％的偏磷酸，置于-20℃存放，每组取肉仔鸡盲肠内容物0.5g。用于盲肠代谢物的测定。
盲肠内容物前处理：称取冻干样品0.05g将样品于1mL PE管中，分别加入100μL的20mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，混合时使用漩涡振荡器强烈震荡30s，然后放于37℃水浴锅中肟化反应90min；取出后加入200μL的BSTFA(含1％TMCS)的衍生试剂，于70℃反应60min。衍生结束后，分别将各组样品进行离心，10000r/min离心10min，取上清液各100ul，转移至GC瓶中，加入400uL正己烷定量至500uL，采取自动进样模式，进行气相色谱-质谱联用仪器进行分析。
气相色谱-质谱联用的检测条件为：
气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱，柱温70℃，保留5min，以4℃/min升温至100℃，保持5min；以10℃/min升温至150℃，保持10min；以5℃/min升温至240℃，保持8min；以10℃/min升温至270℃，保持5min；载气为99.999％高纯He；柱前压7.62psi，载气流量1.0mL/min；进样量1μL；分流比50：1，溶剂延迟时间3min；
质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；接口温度280℃；质量范围20～800amu。
待测样品进行GC-MS检测，在获得TIC图后对各色谱峰成分进行识别鉴定。GC-MS检测获得的原始数据通过GC-MS仪器工作站软件Xcalibur 1.2版本由RAW格式转化为netCDF格式。使用美国安捷伦公司，用于拆分TIC中的重叠峰的软件NISTAMDIS程序，对数据进行预处理，主要有降噪、保留时间校正、峰对齐和反卷积等数据标准化分析等。并且依据峰在GC/MS总离子流图中的保留时间，选择图谱中共有的色谱峰，将质谱图中检测化合物以及其保留指数通过NIST11库中作对比，完成峰的鉴别。在比对结果中，存在匹配度和可能性两个指标。一般情况选择匹配度需大于900且可能性大于80％的物质。然而，由于某些代谢产物(如碳水化合物)存在广泛同分异构体，可能出现定性的结果可能性低，但匹配率高的情况。为了确定这类物质，进一步使用标准品来识别代谢物中碳水化合物的物质。本实施例为了尽可能多地定性代谢产物，选择保留指数和标准品的保留时间库中可能性>70％的化合物为本实施例的鉴定化合物。
将GC/MS标准化数据矩阵，即鉴定的代谢物名称和色谱峰面积校正结果导入SIMCA-P+14.1.0(Umetrics AB,Sweden)软件，进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析(结果如图2-4所示)。采用主成分分析(PCA)的方法来评价组间样本的的分布状况，通过OPLS-DA模型及其模式下的S-Plot寻找到的代谢差异物，生物标志物筛选的标准为变量权重重要性排序VIP＞1，且t-检验的P＜0.05。利用KEGG数据库查询生物标志物的代谢通路。
数据结果如下：
表3所示为酵母培养物对肉仔鸡生长性能的影响:
表3酵母培养物对肉仔鸡生长性能的影响
注：同行数据肩标相同字母者表示差异不显(P>0.05)，字母不同者表示差异显著(P<0.05)。
由表3可以看出，在整个试验期(7-42天)，试验组ADFI、ADG、F/G均优于对照组，各试验组的平均日采食量(ADFI)均不同程度高于对照组，添加酿酒酵母培养物组对肉仔鸡的料重比(F/G)都有不同程度的降低趋势，其中B组显著低于对照组与对照组相比，降低了9.19％。
图1示出了本实施例的七种样品的GC/MS总离子流色谱图(TIC)；从上到下依次为M-对照组、A-12h、B-24h、C-36h、D-48h、E-60h、N-VXP；由图1可知，总离子流色谱图各不相同，对照组与酵母培养物组比较差异明显，各酵母培养物组谱图差异不大。色谱峰保留时间主要集中在10～70min，主要包括氨基酸，有机酸，糖类等。
各组盲肠代谢物色谱峰具体指认结果见表4:
表4各组肉仔鸡盲肠内容物代谢物质
注：表格中N/A表示该物质不存在。
采用PCA方法对所有样品的GC-MS数据进行分析，结果见图2。可知，各组之间沿t[1]轴均有分开趋势，表明各组的盲肠内容物成分有所差异。本实施例重点考察生产性能差异较大的两组盲肠内容物的情况。其中B组(24h)与E(60h)组距离较远，说明饲喂发酵24h和60h的酵母培养物对盲肠组织成分组成的影响比较显著。
下表5示出了特征代谢物组相对峰面积比较
表5特征代谢物组相对峰面积比较
与B组比较：**P＜0.01；*P<0.05**P<0.01；*P<0.05
对42日龄肉鸡盲肠内容物进行了检测，最终共检测并确认盲肠内容物中86种不同代谢物，随后通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中的代谢通路，找到与差异代谢产物相关的信息。本发明着重比较生产性能差异较大的两组盲肠内容物，分别为饲喂发酵24h和60h的酵母培养物。两组肉鸡盲肠内容物中共有6种差异代谢产物发生显著性变化，丙氨酸、亮氨酸、苯乙酸、呋喃甘露糖、阿拉伯糖醇、胆固醇。两组差异代谢物质比较，丙氨酸、亮氨酸、苯乙酸含量升高；呋喃甘露糖、阿拉伯糖醇、胆固醇含量下降。这些物质主要涉及以下典型代谢途径苯丙氨酸代谢、丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢、胆固醇代谢、甾体激素合成、脂肪消化和吸收、维生素消化和吸收等。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，使用气相色谱-质谱联用检测肉仔鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物和代谢通路的变化，从而确定酵母培养物对肉仔鸡盲肠代谢调控及代谢产物的影响。
2.根据权利要求1所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，所述的气相色谱-质谱联用的检测条件为：
气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱，柱温70℃，保留5min，以4℃/min升温至100℃，保持5min；以10℃/min升温至150℃，保持10min；以5℃/min升温至240℃，保持8min；以10℃/min升温至270℃，保持5min；载气为99.999％高纯He；柱前压7.62psi，载气流量1.0mL/min；进样量1μL；分流比50：1，溶剂延迟时间3min；
质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；接口温度280℃；质量范围20～800amu。
3.根据权利要求1所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，所述的不同发酵时间产出的酵母培养物是由吉林农业大学吉农博瑞研发中心提供的发酵时间分别为12h、24h、36h、48h、60h的五种酿酒酵母培养物和达农威中国有限公司提供的达农威益康VXP。
4.根据权利要求1所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，所述的盲肠内容物在进入气相色谱-质谱联用仪之前需要前处理，处理的步骤为：
称取冻干样品0.05g，将样品于1mL PE管中，分别加入100μL的20mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，混合时使用漩涡振荡器震荡30s，然后放于37℃水浴锅中肟化反应90min；取出后加入含1％TMCS的BSTFA衍生试剂200μL，于70℃反应60min；衍生结束后，分别将各组样品进行离心，10000r/min离心10min，取上清液100ul，转移至GC瓶中，加入400uL正己烷定量至500uL，采取自动进样模式，进入气相色谱-质谱联用仪进行分析。
5.根据权利要求4所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，所述的分析为：待测样品进行GC-MS检测，在获得TIC图后对各色谱峰成分进行识别鉴定；GC-MS检测获得的原始数据通过GC-MS仪器工作站软件Xcalibur1.2版本由RAW格式转化为netCDF格式，使用美国安捷伦公司，用于拆分TIC中的重叠峰的软件NIST AMDIS程序，对数据进行预处理，并且依据峰在GC/MS总离子流图中的保留时间，选择图谱中共有的色谱峰，将质谱图中检测化合物以及其保留指数通过NIST11库中作对比，完成峰的鉴别。
6.根据权利要求5所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，
选择保留指数和标准品的保留时间库中可能性>70％的化合物为鉴定化合物。
7.根据权利要求5或6任一项所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，还包括多元统计分析步骤，具体为：
将GC/MS标准化数据矩阵，导入SIMCA-P+14.1.0软件，进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析；采用PCA主成分分析的方法来评价组间样本的分布状况，通过OPLS-DA模型及其模式下的S-Plot寻找到的代谢差异物，生物标志物筛选的标准为变量权重重要性排序VIP＞1，且t-检验的P＜0.05；利用KEGG数据库查询生物标志物的代谢通路。
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