CN111443143A - 一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法，属于乳粉品质检测技术领域。所述方法是：样品经脂肪酶酶解，采用快速的碳酸钾‑乙醇皂化法，正己烷提取，经气相色谱‑串联质谱分析，同时获得定性和定量结果。胆固醇在0.5～50mg/L，α‑生育酚、β‑生育酚、γ‑生育酚、δ‑生育酚在0.25～25mg/L范围内具有较好的线性关系，线性系数(R²)大于0.999，加标回收率为75～100％，相对标准偏差为1.4～3.5，胆固醇定量限为10.0μg/100g，维生素E四种异构体的定量限均为5.0μg/100g，本方法检出限、线性、回收率均能满足乳粉中胆固醇和4种生育酚的检测要求。

Description

一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法

技术领域

本发明涉及一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法，属于乳粉品质检测技术领域。

背景技术

胆固醇和生育酚都是人体所必需的重要营养元素，是乳粉中的重要质量指标。胆固醇参与人体代谢，是合成类固醇激素的原料，也是胆汁酸、激素和维生素D的前体。维生素E(vitamin E，VE)又称生育酚，是一种人体必需的脂溶性维生素，对维持人体正常生理功能起重要作用，能提高机体免疫力、生育能力，也是人体内最重要的抗氧化剂。维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类8种化合物，其中生物效价较高的4种是α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。

目前，国家标准中用于检测食品中胆固醇和维生素E是两个不同的方法，且均需要经过传统的加热回流皂化、分液漏斗多次液液萃取、洗涤、浓缩，再用高效液相色谱或气相色谱法分离，而文献报道的关于维生素E或者胆固醇的方法几乎也都是与国家标准相同的前处理方法。这些前处理方法过程复杂、耗时长，色谱法分离胆固醇的干扰较大。目前对于胆固醇和混合生育酚同时检测的方法报道甚少。此外，严婉盈等采用固相萃取(SolidPhase Extraction,SPE)法测定胆固醇，但是该方法只能测定游离胆固醇而非总胆固醇，影响结果准确性，该文献将SPE用于测定植物油的方法并不适用于乳粉的前处理。

发明内容

鉴于乳粉基质成分复杂，本发明通过多次实验摸索了一种适用于各种乳粉中胆固醇和混合生育酚定性定量检测的方法，采用快速准确的简易皂化提取的前处理方法，用气相色谱三重四级杆质谱联用仪多反应监测(MRM)模式定性和定量，相比简单的气相色谱、液相色谱及单杆质谱更加准确。本研究将此快速法与国标方法进行了比对，并将本方法应用于快速同时测定各种乳粉中胆固醇和混合生育酚的含量。该方法简便、快速、灵敏、准确，可满足乳粉中胆固醇和混合生育酚的检测要求，为乳粉品质的快速检测奠定了理论基础。

本发明的第一个目的是提供一种提取乳粉中胆固醇和生育酚的预处理方法，所述方法是先采用脂肪酶酶解乳粉样品，再采用碳酸钾-无水乙醇溶液进行皂化处理，最后经提取溶剂提取得到胆固醇和生育酚混合溶液。

在本发明一种实施方式中，所述生育酚包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。

在本发明一种实施方式中，所述酶解条件为：脂肪酶添加量为100-150U/mg样品，pH为8.0-9.0，温度为30-40℃，酶解时间为2-10h。

在本发明一种实施方式中，所述碳酸钾-无水乙醇溶液与样品的用量比的(5-15)：1(v/w，mL/g)；碳酸钾-无水乙醇溶液中碳酸钾质量体积浓度为5％-10％(w/v，g/mL)。

在本发明一种实施方式中，所述皂化处理条件为：皂化温度为20-40℃，皂化时间为10-20min。

在本发明一种实施方式中，萃取溶剂为正己烷、石油醚:乙醚(1:1)或乙酸乙酯；优选地，溶剂为正己烷，萃取溶剂体积为2-10mL；萃取时间为5-15min。

优选地，萃取溶剂为正己烷，萃取溶剂体积为5mL，萃取时间为10min。

在本发明一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)酶解和快速皂化：称取乳粉样品2.00g于50mL离心管中，加入5mL37℃水溶解，加入0.2g脂肪酶，5mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)，混匀后置于37℃振荡水浴中酶解4小时。取出后立即冷却，待冷却至室温后依次加入1g碳酸钾、10mL超纯水、10mL无水乙醇充分混合后20℃水域震荡10min；

(2)提取：向步骤(1)中继续加入5mL正己烷充分涡旋萃取10min，4000r/min离心6min，取上清液过0.22μm有机膜，待测定。

本发明的第二个目的是提供一种同时检测乳粉中胆固醇和生育酚含量的方法，所述方法是应用上述预处理方法对乳粉中的胆固醇和生育酚进行提取，再采用气相色谱串联质谱法对胆固醇和生育酚进行定量检测。

在本发明一种实施方式中，色谱条件为：色谱柱为30m×0.25mm×0.25μm TG-5MSSil，进样口温度280℃，不分流模式进样，进样量2μL，载气流速：1.5mL/min；升温程序为：初始柱温150℃，维持1min，然后以10℃/min升至280℃，维持12min，最后20℃/min升至300℃，保持3min。

在本发明一种实施方式中，质谱条件：电子轰炸EI离子源，扫描方式为正离子扫描；多反应监测MRM模式，离子源温度300℃，接口温度300℃。

本发明第三个目的是提供一种所述预处理方法和检测方法在检测婴幼儿配方奶粉和低脂乳粉品质方面的应用。

本发明的有益效果：

鉴于现行胆固醇和4种生育酚的测定分别采用国家标准GB 5009-2016《食品中维生素A、D、E的测定》第一法，GB 5009-2016《食品中胆固醇的测定》。前处理方法过程复杂、耗费时间长，而且不能同时测定胆固醇和4种生育酚。本发明前处理只需经过酶解、常温皂化、直接萃取3个步骤，无需转移和多次萃取，高效便捷，且可以批量处理样品。本发明采用气质联用仪相比液相法、气相法定性定量更加准确、干扰少，胆固醇在0.5～50mg/L，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚在0.25～25mg/L范围内具有较好的线性关系，线性系数(R²)大于0.999，加标回收率为77％～93.1％，相对标准偏差为1.4～3.5，胆固醇定量限为10.0μg/100g，维生素E四种异构体的定量限均为5.0μg/100g，本方法检出限、线性、回收率均能满足乳粉中胆固醇和4种生育酚的检测要求。该方法简便、快速、灵敏、准确，可满足乳粉中胆固醇和混合生育酚的检测要求，为乳粉品质的快速检测奠定了理论基础。

附图说明

图1为5种物质的定量离子提取图。

图2为不同酶解时间对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响(n＝3)。

图3为不同皂化温度对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响(n＝3)。

图4为不同萃取剂对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响(n＝3)。

图5为不同萃取溶剂体积对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响(n＝3)。

图6为胆固醇和4种生育酚的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)。

图7为标准皂化法与快速皂化法的比较(n＝6)。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

1、脂肪酶购于SIGMA公司，型号为L1754-100G，酶活为1229U/mg。

实施例1：

(1)标准溶液的制备

标准储备溶液：准确称取0.0105g胆固醇标准品，正己烷溶解并定容至10.00mL，配制成1.00mg/mL标准溶液，保存于-18℃冰箱中。分别准确称取0.0104gα-生育酚标准品，0.0101gβ-生育酚标准品、0.0103gγ-生育酚标准品、0.0108gδ-生育酚标准品，分别用无水乙醇溶解并定容至10mL，分别得到1.00mg/mL的生育酚标准溶液，保存于-18℃冰箱中，备用。

混合标准中间液：量取适量的胆固醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚标准储备溶液，配制成胆固醇含量为200mg/L，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量均为100mg/L的混合标准中间液，备用。

标准系列工作溶液：由于加标回收率考察的含量和实际样品中的含量差距较大，因此，配制两个标准系列溶液，分别吸取混合标准中间液0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于10mL棕色容量瓶中，正己烷定容至刻度，标准系列1中胆固醇的浓度为：0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L，标准系列2中胆固醇的浓度为：5、10、20、30、40、50mg/L，标准系列1中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的浓度均为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L，标准系列2中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的浓度均为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/L。

(2)GC-MSMS测定

将标准工作溶液自动进样到气相色谱串联质谱仪，采用GC-MSMS分析，外标法定量。

色谱条件：色谱柱TG-5MS Sil(30m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度280℃，程序升温，不分流模式进样，进样量2μL，载气流速：1.5mL/min；

升温程序为：初始柱温150℃，维持1min，然后以10℃/min升至280℃，维持12min，最后20℃/min升至300℃，保持3min。

质谱条件：电子轰炸(EI)离子源，扫描方式为正离子扫描；多反应监测(MRM)模式，离子源温度300℃，接口温度300℃。

以TG-5MS Sil色谱柱分离，并通过改变升温程序，使得本研究的5种目标化合物得到较好的分离且峰形较好(见图1)。

(3)线性关系、检出限的确定

对标准系列溶液1、2进行测定，以标准溶液的质量浓度(x，mg/L)为横坐标，以相应的峰面积(y)为纵坐标，拟合线性方程得出相关系数，以最低加标结果推算10倍信噪比对应的浓度为定量下限，其中胆固醇在0.5～50mg/L，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚在0.25～25mg/L范围内具有较好的线性关系，方法定量限为5.0μg/100g～10.0μg/100g，具体结果见表1。

表1胆固醇和生育酚的校准曲线及相关系数

实施例2：一种快速测定乳粉中胆固醇含量的方法

(1)酶解和快速皂化：

称取乳粉样品2.00g于50mL离心管中，加入5mL37℃溶解，加入0.2g脂肪酶，5mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)，混匀后置于37℃振荡水浴中酶解4小时。取出后立即冷却，待冷却至室温后依次加入1g碳酸钾、10mL超纯水、10mL无水乙醇充分混合后25℃水域震荡10min。

(2)提取：

加入5mL正己烷充分涡旋提取10min，4000r/min离心6min，取上清液过0.22μm有机膜，待测定。

(3)GC-MS/MS测定：

将样品测试液自动进样到气相色谱串联质谱仪，采用GC-MS/MS分析，外标法定量。

色谱条件：色谱柱TG-5MS Sil(30m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度280℃，程序升温，不分流模式进样，进样量2μL，载气流速：1.5mL/min；

升温程序为：初始柱温150℃，维持1min，然后以10℃/min升至280℃，维持12min，最后20℃/min升至300℃，保持3min。

质谱条件：电子轰炸(EI)离子源，扫描方式为正离子扫描；多反应监测(MRM)模式，离子源温度300℃，接口温度300℃。

实施例3：前处理条件的优化

为了探究最优的前处理条件，先选定一个胆固醇和4种生育酚含量较低的脱脂乳粉样品作为空白基质，加标含量为2.0mg/100g，分别考察酶解时间、皂化温度、萃取溶剂的种类、容积体积以及萃取时间对回收率的影响，每个条件平行测定三次，以加标回收率为评价指标选出最优的前处理条件。

(1)酶解时间的选择

胆固醇和生育酚都是脂溶性物质，通过脂肪酶酶解，可以使其游离出来，并且避免了高温强碱环境。在其他条件相同的前提下，考察在37℃条件下酶解时间(2h、4h、12h)对回收率的影响，乳粉中胆固醇和4种生育酚的回收率如图2所示。酶解4h条件下乳粉中胆固醇和4种生育酚的回收率最高，最高达95.8％；2h和12h乳粉中胆固醇和4种生育酚的回收率相差不大，均低于酶解4h，其中酶解2h回收率低可能是是由于酶解时间短，乳粉未得到充分酶解，回收率偏低；酶解12h回收率低，可能是因为酶解时间过长，导致待测组分损失，因此选择37℃下酶解4h最佳。

(2)皂化温度的选择

将37℃酶解4h后的样品按照1.5.1加入试剂，分别采用常温(25℃)水浴震荡、40℃水浴振荡、80℃水浴振荡三种方式进行皂化。三种条件下各组分的回收率均在75～100％之间，其中常温(水域震荡)的条件下回收率最高，且平行性最好，由此可见采用常温(25℃)水浴震荡的条件，皂化效果最佳，结果详见图3。

(3)萃取溶剂种类的选择

以胆固醇和4种生育酚的溶解性作为选择提取溶剂的参考，分别考察了正己烷、石油醚：乙醚(1：1)、乙酸乙酯作为提取溶剂对回收率的影响(图4)，结果表明乙酸乙酯的提取效果最差，回收率最低至72.2％；石油醚：乙醚(1：1)提取效果优于乙酸乙酯，胆固醇和4种生育酚的回收率有所提高；正己烷提取效果最佳，回收率高达95.5％。

(4)萃取溶剂体积的选择

进一步考察了提取溶剂正己烷的体积对回收率的影响，具体考察了2mL、5mL、10mL，结果如图5所示。提取溶剂体积为5mL和10mL时的回收率显著高于2mL，但提取5mL和10mL，回收率结果无显著差异，考虑实验成本和环境问题，故最终选择提取溶剂的体积为5mL。

(5)提取时间的选择

除了考察不同的提取剂，提取剂的体积等因素，还考察了溶剂提取时间对乳粉中胆固醇和4种生育酚回收率的影响，结果表明，提取时间为10min和15min的回收率结果显著高于5min，但提取时间为10min和15min的回收率无显著差异，考虑到实验效率，故选择提取10min为最优提取时间。

实施例4：方法的准确性和重复性

(1)精密度与回收率试验

以脱脂乳粉为样品进行3水平加标试验，水平1、水平2、水平3胆固醇加标含量分别为1.0mg/100g、5.0mg/100g、25.0mg/100g，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚加标含量分别为0.1mg/100g、0.5mg/100g、2.5mg/100g，每一水平平行测定6次，计算方法的回收率和精密度，具体结果详见表2和图6。

表2样品测定分析结果

(2)标准皂化法与快速皂化法的比较

考虑加标回收率并不能完全反应该方法对实际样品的分解和提取能力，尤其是本研究的5种物质皆为脂溶性物质，与脂肪密切结合，加标回收并不能真正验证酶解效果。为了考察本研究方法对实际乳粉样品的测试效果，本研究选取一种婴幼儿乳粉样品，按照本研究的方法测试该乳粉中5种物质的含量，又按照国家标准GB 5009.82-2016《食品中维生素A、D、E的测定》第一法测定4种生育酚含量，按照GB 5009.128-2016《食品中胆固醇的测定》第一法测定胆固醇含量，每一方法平行测定6次，测试结果如图7所示。

由图7可知，相较于国标方法，本研究方法测得的胆固醇含量略低，可能是酶解和简易皂化方法提取效果不如国标方法，从而导致其回收率相对较低，但其余4种生育酚的测定含量均比国标方法略高。经显著性分析，国标方法与本研究方法对该乳粉中胆固醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量的检测结果无显著性差异(P＜0.05)，然而国标方法前处理操作繁琐，且需要分别按照两种方法前处理、测定胆固醇和4种生育酚，本研究方法更加快速、简便，便于实际乳粉中胆固醇和4种生育酚的同时快速检测。

实施例5：一种检测婴幼儿配方奶粉、低脂乳粉中胆固醇和4种生育酚含量的应用

为了解目前市售婴幼儿乳粉、其他低脂乳粉中胆固醇和4种生育酚的含量，利用上述所建立的分析方法，分别随机抽取了市面上出售的20种婴幼儿配方奶粉及4种低脂乳粉，对其胆固醇和4种生育酚含量进行了分析测试，检测结果详见表3。

表3实际乳粉中胆固醇和4种生育酚的含量(n＝3)

注：婴幼儿配方奶粉：1～20；低脂乳粉：21～24。

由表3可知，婴幼儿配方乳粉中胆固醇的含量显著高于低脂乳粉，婴幼儿乳粉中胆固醇含量最高可达81.4mg/100g；低脂乳粉中四种生育酚含量均低于婴幼儿乳粉，其中婴幼儿乳粉中四种生育酚α-生育酚和β-生育酚含量较高，平均值分别是3.6mg/100g和2.0mg/100g，γ-生育酚和δ-生育酚含量均较低，平均值分别为0.26mg/100g和0.79mg/100g。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提取乳粉中胆固醇和生育酚的预处理方法，其特征在于，所述方法是先采用脂肪酶酶解乳粉样品，再采用碳酸钾-无水乙醇溶液进行皂化处理，最后经萃取溶剂萃取得到胆固醇和生育酚混合溶液。

2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述生育酚包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。

3.根据权利要求1或2所述的预处理方法，其特征在于，所述酶解条件为：脂肪酶添加量为100-150U/mg乳粉样品，pH为8.0-9.0，温度为30-40℃，酶解时间为2-10h。

4.根据权利要求1-3任一所述的预处理方法，其特征在于，所述碳酸钾-无水乙醇溶液与样品的用量比的(5-15)：1；碳酸钾-无水乙醇溶液中碳酸钾质量体积浓度为5％-10％。

5.根据权利要求1-4任一所述的预处理方法，其特征在于，所述皂化处理条件为：皂化温度为20-40℃，皂化时间为10-20min。

6.根据权利要求1-5任一所述的预处理方法，其特征在于，萃取溶剂为正己烷，乙酸乙酯，或石油醚和乙醚的混合溶液；提取溶剂体积为2-10mL；提取时间为5-15min。

7.一种检测乳粉中胆固醇和/或生育酚含量的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1-6任一所述的预处理方法对乳粉中的胆固醇和生育酚进行萃取，再采用气相色谱串联质谱法对胆固醇和/或生育酚进行定量检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，色谱条件为：色谱柱为30m×0.25mm×0.25μm TG-5MS Sil，进样口温度280℃，不分流模式进样，进样量2μL，载气流速：1.5mL/min；升温程序为：初始柱温150℃，维持1min，然后以10℃/min升至280℃，维持12min，最后20℃/min升至300℃，保持3min。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，质谱条件：电子轰炸EI离子源，扫描方式为正离子扫描；多反应监测MRM模式，离子源温度300℃，接口温度300℃。

10.一种权利要求1-6任一所述的所述预处理方法或权利要求7-9任一所述的检测方法在检测奶粉和乳粉品质方面的应用。

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