CN113447593B - 一种那非类物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种那非类物质的检测方法。本发明采用高效液相色谱‑串联质谱法测定4种新型那非类物质，实现对食品中4种那非类物质的快速定性定量分析，具有简便、快捷、灵敏度高的优点。本发明的检测方法补充食品中非法添加那非类物质的检测，为食品检验提供技术支撑，弥补了目前针对N‑3‑羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N‑苄基他达拉非、去甲基哌嗪基丙氧基西地那非4种物质检测方法的空白，值得推广应用。

Description

一种那非类物质的检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种那非类物质的检测方法。
背景技术
食品中非法添加那非类物质为消费者埋下严重的健康隐患，该类化合物会使得服用者产生心律失常、心脏猝死、脑出血、高血压等严重不良反应。若患有心血管病或糖尿病患者在不知情的情况下服用这些非法添加药物甚至导致死亡。目前，在国内市场销售产品中发现有非法添加N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非、去甲基哌嗪基丙氧基西地那非等4种物质，且该4种化合物国内外未批准药用，未见其毒理学研究数据，毒性危害未知。
然而，目前国标法中还没有这4种化合物的定性、定量的检测方法。因此，建立该类非法添加物的检测方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种那非类物质的检测方法，采用本发明提供的方法能够快速、准确的实现待测样品中N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非、去甲基哌嗪基丙氧基西地那非的定性与定量检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种那非类物质的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品进行前处理，得到待测样品液；
采用超高效液相色谱串联质谱法对所述待测样品液进行检测；
所述超高效液相色谱串联质谱法包括超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件；
所述超高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为甲醇；
所述流动相体系的流速为300μL/min；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0.0min：所述流动相A的体积百分含量为90％；所述流动相B的体积百分含量为10％；
0.0～1.0min：所述流动相A的体积百分含量由90％匀速减少到50％；所述流动相B的体积百分含量由10％匀速增加到50％；
1.0～16.0min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速减少到35％；所述流动相B的体积百分含量由50％匀速增加到65％；
16.0～19.0min：所述流动相A的体积百分含量由35％匀速减少到2％；所述流动相B的体积百分含量由65％匀速增加到98％；
19.0～22.0min：所述流动相A的体积百分含量为2％；所述流动相B的体积百分含量为98％；
22.0～22.1min：所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到90％；所述流动相B的体积百分含量由98％匀速减少到10％；
22.1～30.0min：所述流动相A的体积百分含量为90％；所述流动相B的体积百分含量为10％；
所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正离子模式；喷雾电压为3.5kV；毛细管温度为320℃；鞘气流速为30psi；辅助气流速为8arb；碰撞气体为高纯氮气；
所述那非类物质为N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非和去甲基哌嗪基丙氧基西地那非中的一种或多种。
优选地，所述超高效液相色谱检测的条件还包括：采用Syncronis C18柱；柱温为35℃；进样量为5μL。
优选地，所述甲酸水溶液的体积浓度为0.1％。
优选地，所述前处理包括以下步骤：
采用醇水溶液对待测样品进行提取，得到提取液；
将所述提取液进行萃取，得到样品净化液；
将所述样品净化液过滤，得到待测样品液。
优选地，所述待测样品包括固态样品、半固态样品或液态样品。
优选地，所述醇水溶液包括甲醇水溶液。
优选地，所述甲醇水溶液的体积分数为60～90％。
优选地，当所述待测样品为固态样品、半固态样品时，所述待测样品的质量和醇水溶液的质量体积比为1g:20～50mL；
当所述待测样品为液态样品时，所述待测样品和醇水溶液的体积比为1:20～50。
优选地，所述提取为超声提取，所述超声提取的功率为200～300W，时间为15～20min。
优选地，所述萃取剂包括石油醚，所述石油醚的沸点为60～90℃。
本发明提供了一种那非类物质的检测方法，包括以下步骤：将待测样品进行前处理，得到待测样品液；采用超高效液相色谱串联质谱法对所述待测样品液进行检测；所述超高效液相色谱串联质谱法包括超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件；所述超高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为甲醇；所述流动相体系的流速为300μL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0.0min：所述流动相A的体积百分含量为90％；所述流动相B的体积百分含量为10％；0.0～1.0min：所述流动相A的体积百分含量由90％匀速减少到50％；所述流动相B的体积百分含量由10％匀速增加到50％；1.0～16.0min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速减少到35％；所述流动相B的体积百分含量由50％匀速增加到65％；16.0～19.0min：所述流动相A的体积百分含量由35％匀速减少到2％；所述流动相B的体积百分含量由65％匀速增加到98％；19.0～22.0min：所述流动相A的体积百分含量为2％；所述流动相B的体积百分含量为98％；22.0～22.1min：所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到90％；所述流动相B的体积百分含量由98％匀速减少到10％；22.1～30.0min：所述流动相A的体积百分含量为90％；所述流动相B的体积百分含量为10％；所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正离子模式；喷雾电压为3.5kV；毛细管温度为320℃；鞘气流速为30psi；辅助气流速为8arb；碰撞气体为高纯氮气；所述那非类物质为N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非和去甲基哌嗪基丙氧基西地那非。
本发明采用高效液相色谱-串联质谱法测定4种新型那非类物质，实现对食品中4种那非类物质的快速定性定量分析，具有简便、快捷、灵敏度高的优点。本发明的检测方法补充食品中非法添加那非类物质的检测，为食品检验提供技术支撑，弥补了目前针对N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非、去甲基哌嗪基丙氧基西地那非4种物质检测方法的空白，值得推广应用。
附图说明
图1为浓度为20μg/L的去甲基哌嗪基丙氧基西地那非标准品溶液提取的定量离子色谱图；
图2为浓度为20μg/L的N-3-羟丙基去甲基他达拉非标准品溶液提取的定量离子色谱图；
图3为浓度为20μg/L的环戊基去甲基他达拉非标准品溶液提取的定量离子色谱图；
图4为浓度为20μg/L的N-苄基他达拉非标准品溶液提取的定量离子色谱图；
图5为去甲基哌嗪基丙氧基西地那非一级质谱图；
图6为去甲基哌嗪基丙氧基西地那非二级质谱图；
图7为N-3-羟丙基去甲基他达拉非一级质谱图；
图8为N-3-羟丙基去甲基他达拉非二级质谱图；
图9为环戊基去甲基他达拉非一级质谱图；
图10为环戊基去甲基他达拉非二级质谱图；
图11为N-苄基他达拉非一级质谱图；
图12为N-苄基他达拉非二级质谱图；
图13为空白酒基质提取液的总离子流图；
图14为空白片剂基质提取液总离子流图；
图15为空白饮料基质提取液总离子流图；
图16为空白胶囊基质提取液总离子流图；
图17为空白咖啡基质提取液总离子流图；
图18为咖啡中提取的N-苄基他达拉非定量离子色谱图；
图19为咖啡中N-苄基他达拉非二级质谱图；
图20为玛咖压片糖中提取的N-3-羟丙基去甲基他达拉非定量离子色谱图；
图21为玛咖压片糖中N-3-羟丙基去甲基他达拉非二级质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种那非类物质的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品进行前处理，得到待测样品液；
采用超高效液相色谱串联质谱法对所述待测样品液进行检测，得到那非类物质检测结果；
在本发明中，若没有特殊说明，所采用的试剂均为本领域技术人员所熟知的市售商品。
本发明将待测样品进行前处理，得到待测样品液。
在本发明中，所述前处理优选包括以下步骤：
采用醇水溶液对待测样品进行提取，得到提取液；
将所述提取液进行萃取，得到样品净化液；
将所述样品净化液过滤，得到待测样品液。
在本发明中，所述待测样品优选包括固态样品、半固态样品或液态样品。
本发明中，所述固态样品优选包括蛋白粉、牡蛎粉或咖啡。本发明实施例中所述固态样品具体优选为无限极有限公司提供的无限极元泰片，批号为18D02CAB01(该样品为不含目标物的阴性样品)。在本发明中，所述固态样品的粒径优选为50～80目，进一步优选为65～80目。当所述固态样品的粒径不在上述范围内，本发明优选将所述固态样品进行研磨，本发明对所述研磨的操作不作具体限定，以能将固态样品研磨至上述粒径为准。
本发明中，所述半固态样品优选包括果冻或油脂基质软胶囊。本发明实施例中所述半固态样品具体为武汉市元大生物科技有限公司提供的元大牌标淳胶囊，批号为20160801(该样品为不含目标物的阴性样品)。
本发明中，所述液体样品优选包括饮料或者酒。本发明实施例中所述液态样品具体为鹿龟神酒业有限公司提供的鹿龟神葆力酒(批号为20171212)(该样品为不含目标物的阴性样品)，以及达利食品有限公司提供的乐虎氨基酸维生素功能饮料(批号为20190110)(该样品为不含目标物的阴性样品)。
在本发明中，所述提取的醇水溶液优选包括甲醇水溶液。在本发明中，所述醇水溶液中醇的纯度优选为色谱级。在本发明中，所述醇水溶液中水优选为超纯水；所述超纯水优选利用超纯水机制备，本发明实施例中具体为威立雅提供的ELGA超纯水机。在本发明中，所述醇水溶液的体积浓度优选为70～90％，进一步优选为80％。
在本发明中，所述待测样品为固态样品或半固态样品时，所述待测样品的质量和醇水溶液的体积的比值优选为1g：(25～100)mL，更优选为1g：50mL。在本发明中，所述待测样品为液态样品时，所述待测样品和醇水溶液的体积比优选为1：(10～100)，更优选为1：50。
在本发明中，所述半固态样品为油脂基质软胶囊时，所述油脂基质软胶囊和醇水溶液混合前，优选和乙酸乙酯混合。在本发明中，所述油脂基质软胶囊与乙酸乙酯的用量比优选为1g：2～25mL；进一步优选为1g：5～15mL；最优选为1g：10mL。
在本发明中，所述提取的方式优选为超声提取，所述超声提取的功率优选为100～500W，更优选为200～300W，最优选为250W。在本发明中，所述超声提取的时间优选为15～30min，更优选为15～20min，最优选为15min。在本发明中，所述超声提取优选在超声波提取器进行，本发明实施例中超声波提取器具体为济宁天华超声天子仪器有限公司提供的THC-10B超声波提取器。
所述提取后，本发明优选还包括将所得提取料液冷却至室温。
得到提取液后，本发明将所述提取液进行萃取，得到样品净化液。
本发明中，所述萃取的萃取剂优选包括石油醚。本发明中，所述待测样品为固态样品、半固态样品时，所述待测样品与萃取剂的质量体积比优选为1g：(20～40)mL，进一步优选为1g：(25～35)mL。本发明中，所述待测样品为液态样品时，待测样品与萃取剂的体积比优选为1：(20～40)，进一步优选为1:(25～35)。本发明中，所述萃取的次数优选为3次。本发明中，所述萃取优选得到醇相。
本发明中，所述待测样品为固态样品、半固态样品时，得到醇相后，优选还包括对所述醇相依次进行定容、离心，得到样品净化液。在本发明中，所述定容的试剂优选为醇水溶液。本发明中，所述定容后的体积与待测样品的比值优选为50mL：1g。在本发明中，所述离心的转速优选为2000～6000r/min；进一步优选为3000～5000r/min，最优选为4000r/min。本发明中，所述离心的时间优选为2～15min，进一步优选为5～10min，最优选为5min。本发明中，所述离心优选在离心机中进行，本发明实施例中所述离心机具体采用Sigma提供的离心机3K15。
本发明中，当所述待测样品为液态样品时，所述醇相优选进行定容，得到样品净化液。所述定容的试剂优选为醇水溶液；所述醇水溶液的体积浓度优选为50％。本发明中，所述定容后的体积与待测样品的比值优选为50：1。
得到样品净化液后，本发明将所述样品净化液过滤，得到待测样品液。
本发明中，所述过滤的滤膜的孔径优选为0.22μm；在本发明的实施例中优选采用孔径为0.22μm的有机相型微孔滤膜。
过滤后，当得到的过滤液浓度在2～50ng/mL时，可直接作为待测样品液。当得到的过滤液浓度高于50ng/mL时，根据需要利用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝1:1)将过滤液稀释至2～50ng/mL，作为待测样品液；本发明对所述稀释没有特殊的限定，根据本领域技术人员预估，将所述待测样品液稀释至2～50ng/mL即可。
得到待测样品液后，本发明采用超高效液相色谱串联质谱法对所述待测样品液进行检测。
在本发明中，所述超高效液相色谱串联质谱法包括超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件。
在本发明中，所述液相色谱检测的条件包括：
流动相为流动相A和流动相B；所述流动相A为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的体积浓度优选为0.1％；所述流动相B为甲醇；所述流动相的流速为300μL/min；洗脱方式为梯度洗脱。在本发明中，所述梯度洗脱的程序如表1所示。
表1液相色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0003163778690000071
/>
Figure BDA0003163778690000081
在本发明中，所述液相色谱检测的条件优选还包括：色谱柱优选为Syncronis C18柱；柱温优选为35℃；进样量优选为5μL。
在本发明中，所述质谱检测的条件包括：检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正离子模式；喷雾电压为3.5kV；毛细管温度为320℃；鞘气流速为30psi；辅助气流速为8arb；碰撞气体为高纯氮气。
在本发明中，所述质谱检测的条件优选还包括：雾化气优选为高纯氮气；气帘气优选为高纯氮气；鞘气优选为高纯氮气；
在本发明中，4种那非类物质的定性离子对、定量离子对、碰撞能量、保留时间如表2所示。
表2 4种那非类物质的质谱参数
Figure BDA0003163778690000082
其中，*代表定量离子。
在本发明中，所述质谱检测采用的仪器优选为三重四级杆质谱(赛默飞Q-Exactive高分辨液质联用仪)。
在本发明中，所述超高效液相色谱串联质谱对所述待测样品液进行检测优选包括定性检测和定量检测。
在本发明中，所述定性检测的步骤优选包括：
将所述待测样品液和混合标准工作溶液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行测定，记录待测样品液和混合标准工作溶液中那非类物质的色谱保留时间，当待测样品液中检出与某标准工作溶液中的那非类物质标准品保留时间一致的色谱峰(变化范围在±2.5％之内)，并且待测样品液色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比(k)的偏差不超过表3规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。
表3为定性时相对离子丰度的最大允许偏差。
表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度/％ ＞50 20-50 10-20 ≤10
允许相对偏差/％ ±20 ±25 ±30 ±50
在本发明中，所述混合标准工作溶液的配制方法优选包括：
配制200μg/mL那非类物质的标准储备溶液；
配制1.0μg/mL那非类物质的混合标准中间工作溶液；
配制那非类物质的混合标准工作溶液。
在本发明中，所述标准储备溶液的配置具体为：分别精密称的那非类物质标准品各10.0mg(精确至0.01mg)，用乙腈或甲醇溶解并稀释定容至50mL，摇匀，得到浓度为200μg/mL的那非类物质标准储备液，-20℃保存，有效期3个月。
在本发明中，所述那非类物质标准品为N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非和去甲基哌嗪基丙氧基西地那非标准品。本发明中，所述那非类物质标准品的具体规格优选详见表4，所述那非类物质的纯度优选≥98％。
表4那非类物质标准品的具体规格
Figure BDA0003163778690000091
在本发明中，所述混合标准中间工作溶液的配制方法，优选包括：
分别准确吸取标准储备液各0.1mL，用甲醇稀释定容至20mL，摇匀，制成1μg/mL的混合标准工作溶液。在本发明中，所述的混合标准中间工作溶液临用时新配即可。
在本发明中，混合标准工作溶液的配制方法，优选包括：
分别准确吸取混合标准中间工作液，用甲醇水溶液(V甲醇：V甲醇＝1:1)稀释定容，摇匀，作为混合标准工作溶液，得到浓度为2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的混合标准工作溶液。本发明中对吸取混合标准中间工作液的体积以及利用甲醇水溶液稀释定容的最终体积没有特殊要求，以最终能够得到相应浓度的混合标准工作溶液为准。
本发明中，所述混合标准工作溶液临用时新配即可。
在本发明中，所述混合标准工作溶液优选按照仪器响应情况配制或根据实际需要采用空白基质提取液，配制适当浓度的混合标准工作溶液。本发明中，所述空白基质提取液是指不含有上述那非类物质的待测样品，预处理步骤不变。
本发明中，所述定量检测优选包括标准曲线的制作、待测样品液那非类物质的测定。
在本发明中，所述标准曲线的制备方法，优选包括以下步骤：
将所述混合标准工作溶液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，得到那非类物质的色谱峰面积，以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，那非类物质定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。
本发明中，所述待测样品液那非类物质的测定，优选包括以下步骤：
将待测样品液按按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件，得到待测样品液中那非类物质的色谱峰面积。
根据所述标准曲线回归方程得到待测液中组分的浓度。
本发明中所述待测样品液的测定次数优选≥2次。
在本发明中，所述待测样品中那非类物质含量的计算式，如式(1)所示：
Figure BDA0003163778690000111
式(1)中：X—待测样品液中那非类物质的含量，单位为毫克每千克或毫克每升(mg/kg或mg/L)；
c—标准曲线中得出的待测样品液中那非类物质的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
V—待测样品液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；
m—试样溶液所代表的质量，单位为克(g或mL)；
f—稀释倍数。
本发明中，所得计算结果优选以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示。本发明中，所述重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值优选不得超过算术平均值的20％。
所述那非类物质为N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非和去甲基哌嗪基丙氧基西地那非。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的实施例中，具体仪器、试剂以及待测样品的规格如下所示：
所述仪器具体为：Q-Exactive高分辨液质联用仪(赛默飞)；DV215CD电子天平(奥豪斯)(感量分别为0.01mg和0.1mg)；THC-10B超声波提取器(济宁天华超声天子仪器有限公司)；3K15离心机(Sigma)和ELGA超纯水机(威立雅)；
所述试剂为N-3-羟丙基去甲基他达拉非(厂家：TLC，批号：3000-015A4，纯度：99.4％)；环戊基去甲基他达拉非(厂家：TLC，批号：1709-005A9，纯度：100％)；N-苄基他达拉非(厂家：苏州毅顺江生物科技有限公司，纯度：98.2％)；去甲基哌嗪基丙氧基西地那非(厂家：苏州毅顺江生物科技有限公司，纯度：69.2％)；甲醇为色谱纯级(厂家：迪马科技有限公司)；甲酸为色谱级(天津科密欧化学试剂有限公司)；
所述待测样品为鹿龟神葆力酒(鹿龟神酒业有限公司，批号：20171212)(以下简称酒)；乐虎氨基酸维生素功能饮料(达利食品有限公司，批号：20190110)(以下简称饮料)；无限极元泰片(无限极有限公司，批号：18D02CAB01)(以下简称片剂)；元大牌标淳胶囊(武汉市元大生物科技有限公司，批号：20160801)(以下简称胶囊)；醇品速溶咖啡(东莞雀巢有限公司，批号：20180626)(以下简称咖啡)(注：以上样品均为不含目标物的阴性样品)
所述液相色谱串联质谱检测中液相色谱检测的条件为：色谱柱为Syncronis C18柱；柱温为35℃；进样量为5μL；流动相为流动相A和流动相B；所述流动相A为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的体积浓度优选为0.1％；所述流动相B优选为甲醇；所述流动相的流速优选为300μL/min；洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱的条件如表1所示。
所述液相色谱串联质谱检测中质谱检测的条件包括优选包括：离子源为电喷雾离子源；毛细管电压为3.5kV；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应检测；碰撞气为高纯氮气。
雾化气为高纯氮气；气帘气优选为高纯氮气；鞘气为高纯氮气。定性离子对、定量离子对、碰撞能量、保留时间，如表2所示。
实施例1
一、标准曲线的制作
(1)混合标准工作溶液的配制
(1.1)配制200μg/mL的那非类物质标准储备溶液
分别准确称取N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非和去甲基哌嗪基丙氧基西地那非各10mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解并稀释定容至50mL，摇匀，得到浓度为200μg/mL的N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非和去甲基哌嗪基丙氧基西地那非的标准储备液，-20℃保存，有效期3个月。
那非类物质标准品提取的定量离子色谱图参见图1～图4，从图1～4可以看出：4种那非类物质标准品提取的定量离子的保留时间及碰撞能量。
一级质谱图见图5、图7、图9、图11，从图中可以看出：四种化合物母离子的精确质荷比。
二级质谱图见图6、图8、图10、图12。从图中可以看出：4种化合物产生各个子离子的质荷比及强度。
(1.2)配制1.0μg/mL的那非类物质的混合标准中间工作溶液。
分别准确吸取0.1mL所述N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非和去甲基哌嗪基丙氧基西地那非化合物标准储备液，用甲醇稀释定容至20mL，摇匀，制成1μg/mL的混合标准工作溶液。
(1.3)配制那非类物质混合标准工作溶液。
分别准确吸取混合标准中间工作液适量(20μL、50μL、100μL、200μL、500μL)，用甲醇水溶液(V甲醇：V甲醇＝1:1)稀释定容至10mL，摇匀，作为混合标准工作溶液，得到浓度为2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的混合标准工作溶液。
(2)线性回归方程
将所述浓度为2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的混合标准工作溶液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，得到那非类物质的色谱峰面积，以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，那非类物质定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程，见表5。
表5那非类物质标准曲线回归方程
成分 线性范围(ng/mL) 线性方程 相关系数
去甲基哌嗪基丙氧基西地那非 2～50 Y＝-40087+257795*X 0.9998
N-3-羟丙基去甲基他达拉非 2～50 Y＝-4514.13+146500*X 0.9999
环戊基去甲基他达拉非 2～50 Y＝-36592+216222*X 0.9999
N-苄基他达拉非 2～50 Y＝88.4452+1755505*X 1.0000
从表5可以看出，4种待测化合物在2ng/mL～50ng/mL线性关系良好。
二、待测样品的前处理
(1)固态样品
(1.1)取固态试样适量，研细，得到粒径为65～80目的固态样品粉末。
(1.2)精确称取1.000g(精确至0.001g)所述固态样品于50mL容量瓶中，加入40mL甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)混合，超声提取15min，放冷至室温。然后，加30mL石油醚萃取3次，取甲醇层，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)定容至50mL，再转移至50mL离心管中，4000r/min离心5min，精密吸取上清液0.02mL，置10mL量瓶中，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝1:1)稀释至刻度，摇匀。再精密吸取稀释后的溶液0.1mL，置10mL量瓶中，用甲醇水溶液(体积浓度50％)稀释至刻度，摇匀。经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得到待测样品液。
所述固态样品为：无限极元泰片(无限极有限公司，批号：18D02CAB01)
(2)液态样品
(2.1)准确吸取1mL待提取液态样品置于50mL容量瓶中，加入40mL甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)，超声提取15min，放冷至室温。然后，加30mL石油醚萃取3次，取甲醇层，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)定容至50mL，精密吸取上清液0.02mL，置10mL量瓶中，用甲醇水溶液(体积浓度50％)稀释至刻度，摇匀。再精密吸取稀释后的溶液0.1mL，置10mL量瓶中，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝1:1)稀释至刻度，摇匀。经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得到待测样品液。
所述液态样品为：乐虎氨基酸维生素功能饮料(达利食品有限公司，批号：20190110)、鹿龟神葆力酒(鹿龟神酒业有限公司，批号：20171212)、醇品速溶咖啡(东莞雀巢有限公司，批号：20180626)
(3)油脂基质(软胶囊)样品
(3.1)精确称取1.000g(精确至0.001g)置于50mL容量瓶中，加入5mL乙酸乙酯，振摇，使其分散均匀，然后加40mL甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)混合，超声提取15min，放冷至室温。然后，用30mL石油醚萃取3次，取甲醇层，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)定容至50mL，再转移至50mL离心管中，4000r/min离心5min，取上清液，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得到待测样品液。所述待测样品液根据实际浓度用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝1:1)适当稀释至线性范围内，备用。
所述油脂基质(软胶囊)样品为：元大牌标淳胶囊(武汉市元大生物科技有限公司，批号：20160801)。
三、专属性测试
空白基质是指不含有上述那非类物质的待测样品，然后空白基质按照“二样品前处理”过程进行处理，得到空白基质提取液(也称为专属性测试溶液)。
将空白基质提取液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，结果如图13～17，从图13～17可以看出：空白基质无干扰，该方法专属性强。
四、空白试验
将体积浓度为80％的甲醇水溶液按照“二样品前处理”过程进行处理，制备得到的空白溶液；
将得到的空白溶液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，结果证明空白溶液即提取剂无干扰。
五、仪器精密度测试
精密吸取所述混合标准中间工作溶液(1μg/mL)适量，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝1:1)稀释成10ng/mL，作为仪器精密度溶液。
将仪器精密度溶液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，得到那非类物质的峰面积。
根据峰面积计算RSD，具体检测结果以及RSD值见表6。
表6仪器精密度测试数据
Figure BDA0003163778690000151
从表6可以看出：仪器精密度良好。
六、检出限及定量限的测定
取“一(1.1)所述的那非类物质标准储备溶液”适量加入到1.0g或1.0mL空白基质中，按“二样品前处理”过程进行处理，处理后的待测液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，以被测组分信号(S)和基线噪音(N)的比值≥10(S/N≥10)的相应浓度确定定量限，S/N≥3的相应浓度确定检出限。
结果为：4种那非类物质的检出限均为0.05mg/kg或0.05mg/L，定量限均为0.1mg/kg或0.1mg/L。
七、准确度测试
准确称取酒、饮料、片剂、胶囊和咖啡5种空白基质，每个基质精密量取或称取18份(每份约1.0mL或1.0g)，分3组，每组6份，置于50mL容量瓶中，分别加入0.1(1倍定量限)、0.2(2倍定量限)、1.0mL(10倍定量限)的混合标准中间工作溶液，按照“二样品前处理”过程进行处理，得到梯度回收溶液，根据标准曲线计算浓度，并计算回收率及RSD，检测结果见表7～表11。
表7回收率测试数据(酒)
Figure BDA0003163778690000161
表8回收率测试数据(饮料)
Figure BDA0003163778690000162
Figure BDA0003163778690000171
表9回收率测试数据(片剂)
Figure BDA0003163778690000172
表10回收率测试数据(胶囊)
Figure BDA0003163778690000173
表11回收率测试数据(咖啡)
Figure BDA0003163778690000174
/>
Figure BDA0003163778690000181
从表7～11可以看出：本方法可以实现对不同基质、不同浓度4种那非类物质的进行准确测试。
八、精密度测试
日内精密度测试：取酒、饮料、片剂、胶囊和咖啡五种空白基质，分别精密量取或称取6份(每份1.0mL或1.0g)，分别加入0.2mL所述混合标准中间工作溶液(1.0μg/mL)，按照“二样品前处理”过程进行处理，制备样品，作为日内精密度溶液，然后将所述日内精密度溶液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，测试结果见表12。
表12日内精密度测试数据
Figure BDA0003163778690000182
/>
Figure BDA0003163778690000191
日间精密度：取酒、饮料、片剂、胶囊和咖啡五种空白基质，分别精密量取或称取1.0mL或1.0g样品，加入0.5mL所述混合标准中间工作溶液(1.0μg/mL)，按照“二样品前处理”过程进行处理，制备日间精密度溶液，连续制备6天，每天测定1次，然后将所述日间精密度溶液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，测试结果见表13。
表13日间精密度测试数据
Figure BDA0003163778690000192
/>
Figure BDA0003163778690000201
从表12和13可知：本方法日内及日间精密度良好。
九、溶液稳定性测试
取酒、饮料、片剂、胶囊和咖啡五种空白基质，分别精密量取或称取1.0mL或1.0g样品，加入0.5mL混合标准中间工作溶液(1.0μg/mL)，按照“二样品前处理”过程进行处理，制备稳定性测试溶液，然后分别在0h、4h、8h、12h、24h时间点，将所述稳定性测试溶液按照超高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行检测，测试结果见表14。
表14溶液稳定性测试数据
Figure BDA0003163778690000202
/>
Figure BDA0003163778690000211
由表14可知，样品制备后在24h之内完成测试。
十、结果汇总
将实施例“三～九部分”的结果汇总于下表，表15是对上述实施例测试结果的汇总，无特殊含义。
表15汇总结果
Figure BDA0003163778690000212
/>
Figure BDA0003163778690000221
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例2
精密称取某咖啡1.000g(精确至0.001g)置于50mL容量瓶中，加40mL甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)，超声提取15min(功率：250W，频率：33kHz)，放冷至室温。然后，加30mL石油醚萃取3次，取甲醇层，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)定容至50mL，再转移至50mL离心管中，4000r/min离心5min。
精密吸取上清液0.02mL，置10mL量瓶中，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝1:1)稀释至刻度，摇匀。再精密吸取上述溶液0.1mL，置10mL量瓶中，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝1:1)稀释至刻度，摇匀。经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。
实施例3
将某玛咖压片糖10片，研细，得到粒径为65～80目的粉末，精密称取1.000g(精确至0.001g)置于50mL容量瓶中，加40mL甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)，超声提取15min(功率：250W，频率：33kHz)，放冷至室温。然后，加30mL石油醚萃取3次，取甲醇层，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝8:2)定容至50mL，再转移至50mL离心管中，4000r/min离心5min。
精密吸取上清液0.02mL，置10mL量瓶中，用甲醇水溶液(体积浓度50％)稀释至刻度，摇匀。再精密吸取上述溶液0.05mL，置10mL量瓶中，用甲醇水溶液(V甲醇：V水＝1:1)稀释至刻度，摇匀。经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。
采用高效液相色谱-串联质谱法对咖啡及玛咖压片糖样品进行检测，结果如表16所示；色谱图如图18～21所示。
表16样品测试结果
含量 咖啡 玛咖压片糖
去甲基哌嗪基丙氧基西地那非(mg/kg) 未检出 未检出
N-3-羟丙基去甲基他达拉非(mg/kg) 未检出 5.81×10<sup>4</sup>
环戊基去甲基他达拉非(mg/kg) 未检出 未检出
N-苄基他达拉非(mg/kg) 1.81×10<sup>4</sup> 未检出

Claims (6)

1.一种那非类物质的检测方法，包括以下步骤：
采用超高效液相色谱串联质谱法对待测样品液进行检测，得到那非类物质检测结果；
超高效液相色谱检测的条件包括：色谱柱为SyncronisC18柱；流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为甲醇；
所述流动相体系的流速为300μL/min；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0.0min：所述流动相A的体积百分含量为90％；所述流动相B的体积百分含量为10％；
0.0～1.0min：所述流动相A的体积百分含量由90％匀速减少到50％；所述流动相B的体积百分含量由10％匀速增加到50％；
1.0～16.0min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速减少到35％；所述流动相B的体积百分含量由50％匀速增加到65％；
16.0～19.0min：所述流动相A的体积百分含量由35％匀速减少到2％；所述流动相B的体积百分含量由65％匀速增加到98％；
19.0～22.0min：所述流动相A的体积百分含量为2％；所述流动相B的体积百分含量为98％；
22.0～22.1min：所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到90％；所述流动相B的体积百分含量由98％匀速减少到10％；
22.1～30.0min：所述流动相A的体积百分含量为90％；所述流动相B的体积百分含量为10％；
质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正离子模式；喷雾电压为3.5kV；毛细管温度为320℃；鞘气流速为30psi；辅助气流速为8arb；碰撞气体为高纯氮气；
所述那非类物质为N-3-羟丙基去甲基他达拉非、环戊基去甲基他达拉非、N-苄基他达拉非和去甲基哌嗪基丙氧基西地那非；
所述待测样品液的获取，包括以下步骤：
采用甲醇水溶液对待测样品进行超声提取，得到提取液；
将所述提取液进行萃取，得到样品净化液；
将所述样品净化液过滤，得到待测样品液；
所述待测样品包括固态样品、半固态样品或液态样品；所述固态样品包括蛋白粉、牡蛎粉或咖啡；所述半固态样品包括果冻或油脂基质软胶囊；所述液体样品包括饮料或酒；
所述萃取的萃取剂为石油醚；
当所述半固态样品为油脂基质软胶囊时，采用甲醇水溶液对油脂基质软胶囊提取前，还包括将油脂基质软胶囊和乙酸乙酯混合。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的条件还包括：柱温为35℃；进样量为5μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲酸水溶液的体积浓度为0.1％。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的体积分数为60～90％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，当所述待测样品为固态样品或半固态样品时，所述待测样品的质量和甲醇水溶液的体积比为1g:20～50mL；
当所述待测样品为液态样品时，所述待测样品和甲醇水溶液的体积比为1:20～50；
当所述待测样品为油脂基质软胶囊时，所述油脂基质软胶囊与乙酸乙酯的用量比为1g：2～25mL。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超声提取的功率为200～300W，时间为15～20min。
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