CN117761222A - 一种保健食品中维生素的提取及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种保健食品中维生素的提取及检测方法，属于检测分析技术领域。本发明提供的保健食品中维生素的提取及检测方法包括以下步骤：(1)向待测样品中加入溶剂，然后进行加速溶剂萃取、冷却，得到维生素提取液；(2)采用液相色谱‑质谱联用法检测步骤(1)所得维生素提取液，得到所述待测样品中维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12和维生素C的含量。本发明采用加速溶剂萃取法，大幅缩短了提取时间；且该提取方法能够同时提取保健食品中的九种维生素并检测，准确度高、灵敏度高、精密度好，在保健食品等检测中有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，尤其涉及一种保健食品中维生素的提取及检测方法。
背景技术
维生素与人体的生长、代谢、发育和健康有着密切关系，是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素。维生素大多在生物体内不能合成或合成量不足，且与脂溶性维生素不同，水溶性维生素在人体内存储量也较小，必须不断从食物、药物或外界环境摄取和补充。人体如从膳食摄入维生素的量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生故障时，就会引起各种维生素缺乏症。但过量摄入维生素会造成严重危害，如维生素B3过量会引起高血糖、肝脏毒性作用。
随着社会经济的飞速发展和人们保健意识的不断提升，叠加我国人口老龄化日趋严重，维生素的消费量持续攀升，导致了包括维生素在内的药品和保健品消费需求大幅提升。同时我国维生素出口量也呈现增长趋势。但目前我国仍未完善针对此类商品功效成分检测的相关标准。目前，常见的水溶性维生素的提取方法主要为超声波萃取和灭菌锅水解两种，但前者极容易提取不完全，特别对于食品中的天然维生素提取困难，耗时长；后者面对叶酸、生物素和维生素B12时效果很差，回收率偏低。现有标准尚无同步检测保健食品中维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素H、维生素B9、维生素B12和维生素C的方法。
因此，开发出一种准确、快速、灵敏度高、选择性好的，能同时测定多种维生素含量测定方法不仅可评价食品的营养价值，对保健食品的质量监控、疾病的诊断和治疗以及生命科学等领域也具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种保健食品中维生素的提取及检测方法。本发明所提供的提取方法大幅缩短了前处理时间，且能够同时快速提取出保健食品中多达九种维生素，提取效率高、回收率高，在保健食品检测中有极高的应用价值。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种保健食品中维生素的提取方法，包括以下步骤：向待测样品中加入溶剂，然后进行加速溶剂萃取、冷却，得到所述维生素的提取液；所述溶剂为甲醇水溶液，所述溶剂的pH值为4.4-4.6；所述待测样品的质量与溶剂的体积比为1g：(40-60)mL；所述加速溶剂萃取中：萃取温度为39-41℃，萃取压力为10-12MPa，萃取时间为270s-330s，所述萃取时间包括加热时间和静态萃取时间；所述待测样品为保健食品；所述维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12、维生素C中至少一种。
本方法采用加速溶剂萃取代替超声萃取等传统方法进行样品前处理，得到所述保健食品中维生素的提取液。加速溶剂法前处理，对市售的水溶性多维补充食品的提取效果好，可以同时提取出待测保健食品样品中的以下九种维生素：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12和维生素C。
在上述加速溶剂萃取条件下，利用加热及压力处理加速溶剂对待测样品基体的渗透、使待提取成分更快地被提取进入溶剂中，保健食品待测样品中的九种维生素能够在270-330s内快速溶出，达到较好的提取效果，能大幅缩短提取时间、回收率高，适用于多种含水溶性维生素的保健食品基质。
采用上述溶剂、并控制待测样品的质量与溶剂的体积比，可较为充分地使基质中的维生素溶出、进入溶剂中，对九种维生素组分的提取效果好，回收率高；且溶剂的极性适宜，对于加速溶剂萃取的条件有良好响应，可通过加速溶剂萃取显著提升萃取效率。若选用其他溶剂或单使用水提取，可能导致部分维生素的溶解性差、回收率显著降低，提取效率低。
采用磷酸溶液调节流动相的pH值，控制溶剂的pH在4.5；实际测量可能存在±0.1的波动，即pH范围在4.4-4.6内：此时萃取过程中维生素的稳定性高，提取回收率高。采用中性环境的萃取溶剂环境，九种维生素的回收率皆大幅下降；在偏碱性环境中维生素发生降解，除叶酸外其余八种维生素回收率大幅下降。
本发明所提供的在特定条件下加速溶剂萃取的提取方法，大幅提升了传统前处理提取效率，处理样品的方法简单快捷，且能够在极短的时间内同时提取出保健食品中的九种维生素，且九种维生素的回收率皆能达到85％以上，在保健食品领域多种维生素的快速协同检测中有极高的应用价值。
优选地，所述甲醇水溶液包括甲醇和水，所述甲醇与水的体积比为甲醇与水的体积比为1:4。采用甲醇与水体积比为1:4的混合液作为萃取溶剂，提取效率高，对九种维生素萃取的回收率高，萃取效果最佳。单采用其中一种溶剂，或其他组合，则其中几种维生素的萃取回收率可能低于70％。
优选地，所述待测样品的质量与溶剂的体积比为1g：50mL。该配比范围内，溶剂用量适中。降低溶剂用量，回收率显著降低；继续提升溶剂用量，回收率不会进一步提升、且有机溶剂过多可能产生爆炸危险。
优选地，所述加速溶剂萃取中：萃取温度为40℃，萃取压力为10MPa。该温度及压力下进行萃取，温度适中，九种维生素的回收率较高，且不会发生过度氧化维生素降解。继续提升温度或萃取压力，维生素可能由于过度氧化而导致轻微降解，回收率反而降低。萃取温度或压力降低，则部分维生素的回收率未达到最高。
进一步优选地，所述加速溶剂萃取中，萃取时间为300s；优选地，所述萃取时间中，加热时间为120s，静态萃取时间为180s。300s萃取时间可使保健食品样品中各维生素的回收率综合达到最高。萃取时间继续增加，回收率不再上升；萃取时间不足，则部分维生素未萃取完全。
进一步优选地，所述加速溶剂萃取中，萃取的淋洗体积为40％，吹扫时间为60s，循环次数为2次。综合上述萃取温度、压力及萃取时间，该萃取条件下，萃取效率高，且九种维生素的回收率最高。
第二方面，本发明提供了一种保健食品中维生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)采用上述维生素的提取方法提取待测样品中的维生素，得到维生素的提取液；
(2)采用液相色谱-质谱联用法检测步骤(1)得到的维生素提取液，得到待测样品中维生素的含量。
上述保健食品中维生素的提取方法进一步结合液质联用法测定九种维生素含量：液相色谱-质谱联用法可准确检测待测液中的九种维生素的含量，灵敏度高、特异性好，且结果的准确度高、精密度好，方法学验证结果均符合《实验室质量控制规范食品理化检测》GB/T 27404-2008的要求，适用于多种不同基质的保健食品中九种水溶性维生素的检测，具有很高的应用价值。
优选地，所述步骤(1)中将所得维生素的提取液以10000r/min离心5min，然后稀释、过膜0.22μm的滤膜，然后再进行步骤(2)的检测。可以除去样液中的残留基质及小颗粒，使前处理后的待测样液达到液相色谱-质谱联用仪的检测要求。
优选地，所述步骤(2)中，液相色谱-质谱联用法中液相色谱的条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，色谱柱的尺寸为1.8μm，100mm×2.1mm；流动相包括A相和B相，所述A相为20mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸甲醇溶液；所述A相和B相的流速之和为0.3mL/min。进一步优选地，柱温为40℃；进样体积为5μL。
进一步优选地，所述步骤(2)中，液相色谱采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下表所示：
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0.0 | 99 | 1 |
| 3.0 | 99 | 1 |
| 5.0 | 5 | 95 |
| 8.0 | 50 | 50 |
| 10.0 | 99 | 1 |
| 15.0 | 99 | 1 |
选用该液相条件，初步分离纯化，可较好地去除待测样液中的干扰物，提高检测灵敏度及特异性，提升可靠性。
优选地，步骤(2)中，液相色谱-质谱联用法中质谱的条件为：电离方式为电喷雾正离子模式；检测方式为多反应检测(MRM)；离子喷雾电压为5500V；气帘气流速为30.0L/min；雾化气流速(GS1)为50.0L/min；辅助加热气流速(GS2)为50.0L/min；辅助加热气温度为550℃；碰撞气(CAD)为中等强度(medium)。
进一步优选地，步骤(2)中，各维生素的离子对及质谱参数如下表所示：
上表中*为定量离子；采用上表中的离子对及检测参数，可实现同时准确地对待测样液中的九种维生素进行定性定量，测试准确度高、回收率均在90-110％范围内，符合《实验室质量控制规范食品理化检测》GB/T 27404-2008附录F的要求。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用特定条件的加速溶剂萃取进行提取、提升了前处理效率，大幅缩短了检测时间；同时与液相色谱-质谱联用法结合，能够同时测定保健食品中的九种维生素的含量，方法的专属性好，特异性强，无杂质干扰；具有极低的检测限及定量限，可对保健食品中微量的维生素进行定量检测；分析九种维生素结果的精密度、重复性好、准确度高、结果稳定，符合GB/T 27404-2008的要求；且在适用于多种不同基质的片剂、冲剂等保健品的检测，适用性广，在保健食品等检测中具有很高的应用价值。
附图说明
图1-9为实施例8中阴性空白基质及阴性空白基质中分别添加维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、维生素B12和L-抗坏血酸标准品的液相色谱-质谱联用检测图谱。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径获得的试剂和材料。
下述实施例及对比例中，采用的液相色谱-质谱联用法检测的条件如下：采用超高效液相色谱串联质谱仪(带ESI源和APCI源)进行检测。
(1)使用液相色谱条件：采用色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，1.8μm，100mm×2.1mm，柱温为40℃；进样体积为5μL。
流动相条件为：A相：20mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，B相：0.1％甲酸甲醇溶液；流速：0.3mL/min。
采用梯度洗脱的程序如下表所示：
| 时间(min) | A相(％) | B相(％) |
| 0.0 | 99 | 1 |
| 3.0 | 99 | 1 |
| 5.0 | 5 | 95 |
| 8.0 | 50 | 50 |
| 10.0 | 99 | 1 |
| 15.0 | 99 | 1 |
(2)设定质谱条件为：
电离方式为电喷雾正离子模式；检测方式：多反应检测(MRM)；离子喷雾电压：5500V；气帘气流速：30.0L/min；雾化气流速(GS1)：50.0L/min；辅助加热气流速(GS2)：50.0L/min；碰撞气(CAD)：中等强度(medium)；辅助加热气温度：550℃。
九种维生素的离子对及质谱参数如下表所示，其中标*为定量离子：
下述实施例及对比例中，液相色谱-质谱联用法中使用的九种维生素的标准溶液的配制方法如下：
S1.分别配制九种维生素的标准储备液：
(1)维生素B1标准储备溶液：准确称取经五氧化二磷或者氯化钙干燥24h的盐酸硫胺素标准品约11.2mg(精确至0.01mg)，相当于10mg硫胺素，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至10mL，使其浓度约为1000μg/mL。混匀后转入棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱中，保存期为3个月。
(2)维生素B2标准储备溶液：将维生素B2标准品置于真空干燥器或装有五氧化二磷的干燥器中干燥处理24h后，准确称取10mg(精确至0.01mg)维生素B2标准品，加入1mL盐酸溶液(1+1)超声溶解后，立即用水转移并定容至50mL，使其浓度约为200μg/mL。混匀后转移入棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期2个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参照GB5009.85-2016附录A执行。
(3)维生素B3标准储备溶液：准确称取烟酰胺标准品10mg(精确到0.01mg)，用0.1mol/L盐酸溶液溶解后定容到10mL，使其浓度约为1000μg/mL。混匀后转移入棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期1个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参照GB5009.89-2016附录B执行。
(4)维生素B5标准储备溶液：准确称取泛酸钙标准品10.87mg(精确到0.01mg)，相当于10mg泛酸，用水溶解并定容到10mL，使其浓度约为1000μg/mL。混匀后转移入棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期5天。
(5)维生素B6标准储备溶液：准确称取12.2mg(精确至0.01mg)盐酸吡哆醇标准品，相当于10mg吡哆醇，用0.1mol/L盐酸溶液溶解后定容到10mL，使其浓度约为1000μg/mL。混匀后转移入棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期1个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参照GB5009.154-2016附录A执行。
(6)维生素B7标准储备溶液：精确称取10mg(精确至0.01mg)生物素标准品，用50％乙醇溶液溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，使其浓度约为1000μg/mL。混匀后转移入棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期12个月。
(7)维生素B9标准储备溶液：精确称取10mg(精确至0.01mg)叶酸标准品，用0.5％氨水溶液溶解后定容到10mL，使其浓度约为1000μg/mL。混匀后转移入棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期3个月。
(8)维生素B12标准储备溶液：精确称取10mg(精确至0.01mg)维生素B12标准品，用5％乙醇溶液溶解后定容到10mL，使其浓度约为1000μg/mL。混匀后转移入棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期1个月。
(9)维生素C标准储备溶液：精确称取L-抗坏血酸标准品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，用20g/L偏磷酸溶液溶解并稀释至刻度，。
S2.配制标准中间液：吸取S1中各标准储备液适量，用水稀释至浓度各为：
浓度为10μg/mL的维生素B1、维生素B2、吡哆醇、生物素、维生素B12标准中间液；
浓度为20μg/mL的烟酰胺、泛酸、维生素B9标准中间液；
浓度为200μg/mL的L-抗坏血酸标准中间液。
S3.标准使用液的配制
(1)维生素B1、维生素B2、维生素B3(烟酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)和维生素C(L-抗坏血酸)标准混合使用液：使用移液枪准确移取5.0mL维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇和L-抗坏血酸标准混合中间液于50mL棕色容量瓶中，并用水稀释，定容至刻度。使该标准混合中间液中维生素B1、维生素B2、吡哆醇的浓度分别为1.0μg/mL，烟酰胺和泛酸的浓度分别为2.0μg/mL，L-抗坏血酸的浓度为20.0μg/mL，临用前配制。
(2)维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)标准混合使用液：使用移液枪准确移取1.0mL生物素、叶酸标准混合中间液于10mL棕色容量瓶中，并用水稀释，定容至刻度。使该标准混合中间液中生物素浓度为1.0μg/mL，叶酸浓度分别为2.0μg/mL。临用前配制。
(3)维生素B12标准使用液：使用移液枪准确移取1.0mL维生素B12标准中间液于10mL棕色容量瓶中，并用水稀释，定容至刻度。使该标准混合中间液中维生素B12浓度为1.0μg/mL。临用前配制。
S4.配制阴性空白基质溶液：
称取不含维生素的阴性空白试样准确称取混合均匀的试样1g(精确至0.001g)于50mL棕色容量瓶中，加入40mLpH＝4.5的甲醇水溶液，摇匀，置加入溶剂萃取仪萃取，萃取条件，取出冷却，加pH＝4.5甲醇水溶液至刻度，混匀。以10000r/min离心5min，分离上清液，制得阴性空白基质溶液。
S5.标准系列工作溶液的配制
(1)维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇和L-抗坏血酸标准混合系列工作液：准确吸取1mL阴性空白基质溶液于100mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀制得稀释100倍的阴性空白基质溶液。分别准确吸取维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇和L-抗坏血酸标准混合使用液0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.80mL、1.00mL、2.00mL、4.0mL、5.0mL于10mL棕色容量瓶中，用稀释100倍的阴性空白基质溶液定容至刻度混匀。此标准混合系列工作液中维生素B1、维生素B2、吡哆醇的浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、500ng/mL；烟酰胺、泛酸的浓度分别为20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1000ng/mL；维生素C浓度分别为200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL、8000ng/mL、10000ng/mL。
(2)维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)标准混合系列工作液：准确吸取50mL阴性空白基质溶液于100mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀制得稀释2倍的阴性空白基质溶液。分别准确吸取生物素、叶酸标准混合使用液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.0mL于10mL棕色容量瓶中，用稀释2倍的阴性空白基质溶液定容至刻度混匀。此标准混合系列工作液中生物素的浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，叶酸的浓度分别为20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL。
(3)维生素B12标准系列工作液：分别准确吸取维生素B12标准使用液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.0mL于10mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL。
实施例所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明实施例的一种保健食品中维生素的提取方法，包括以下步骤：
(1)准确称取混匀的多维片待测样品1g(精确至0.001g)置于棕色容量瓶中，加入40mL的溶剂甲醇水溶液(体积比甲醇：水＝1:4，pH＝4.5)摇匀，使用加速溶剂萃取仪萃取，设定萃取条件为：萃取温度为40℃，萃取压力10MPa，加热时间为120s，静态萃取时间为180s，总萃取时间300s，淋洗体积40％，吹扫时间60s，循环次数2次，萃取完成后取出冷却，使用溶剂甲醇水溶液(体积比甲醇：水＝1:4，pH＝4.5)定容至50mL、混匀，得到维生素的提取液。
本发明实施例的一种保健食品中维生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将得到的维生素的提取液以10000r/min离心5min，取上清液1mL至100mL棕色容量瓶中，加水定容、混匀，然后采用0.22μm水相滤膜过滤后，采用液相色谱-串联质谱仪测定，得到九种维生素的定量离子响应峰面积。
(2)同时测定九种维生素的标准系列工作溶液，以标准系列工作溶液中定量离子的响应峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线及待测样液九种维生素的定量离子响应峰面积，得到多维片试样中九种维生素的含量。
对本实施例中九种维生素的标准曲线线性回归方程和相关系数R2如表1所示。可知，九种维生素的标准曲线相关系数均达到0.999以上，在表中所列线性范围内，方法线性关系良好。
表1线性测试结果
| 项目 | 线性回归方程 | 相关系数R2 | 线性范围(ng/mL) |
| 维生素B1 | y＝5833.12x+1223.5 | 0.99938 | 10ng/mL～200ng/mL |
| 维生素B2 | y＝14687.21x+16231.0 | 0.9937 | 10ng/mL～200ng/mL |
| 烟酰胺 | y＝3617.21x+18979.3 | 0.99991 | 80ng/mL～1000ng/mL |
| 泛酸 | y＝8881.15x-14712.2 | 0.99988 | 80ng/mL～1000ng/mL |
| 吡哆醇 | y＝16252.18x+90421.7 | 0.99981 | 10ng/mL～200ng/mL |
| 生物素 | y＝12733.49x-13857.9 | 0.99978 | 10ng/mL～500ng/mL |
| 叶酸 | y＝3828.53x-19211.8 | 0.99990 | 20ng/mL～1000ng/mL |
| 维生素B12 | y＝2957.36x+733.1 | 0.99991 | 10ng/mL～500ng/mL |
| L-抗坏血酸 | y＝113.56x+13579.2 | 0.99993 | 800ng/mL～10000ng/mL |
实施例2
实施例2与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂萃取中静态萃取的时间为150s，总萃取时间为270s。
实施例3
实施例3与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂萃取中静态萃取的时间为210s，总萃取时间为330s。
实施例4
实施例4与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂中萃取压力为11MPa。
实施例5
实施例5与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂中萃取压力为12MPa。
实施例6
实施例6与实施例1的不同之处仅在于，溶剂的总体积为40mL。
实施例7
实施例7与实施例1的不同之处仅在于，溶剂的总体积为60mL。
实施例1-7中，以多维片中九种维生素的实际添加量计算九种维生素的回收率如表2。回收率计算公式如下：
回收率＝测定得到的维生素总量/维生素实际添加量*100％
表2实施例1-7的检测回收率结果
| 回收率(％) | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
| 维生素B1 | 95.2 | 83.3 | 94.1 | 94.4 | 94.3 | 93.3 | 95.4 |
| 维生素B2 | 97.2 | 90.1 | 95.0 | 95.1 | 95.0 | 96.3 | 94.8 |
| 烟酰胺 | 95.1 | 89.2 | 95.5 | 94.3 | 94.5 | 94.4 | 95.6 |
| 维生素B6 | 97.1 | 96.3 | 96.0 | 96.5 | 96.8 | 94.0 | 95.7 |
| 泛酸 | 95.7 | 94.8 | 93.5 | 94.9 | 94.2 | 94.5 | 95.1 |
| 生物素 | 89.2 | 85.8 | 87.3 | 88.8 | 88.6 | 87.1 | 88.1 |
| 叶酸 | 90.5 | 88.0 | 88.0 | 89.2 | 89.1 | 89.4 | 88.7 |
| 维生素B12 | 90.1 | 88.2 | 90.2 | 89.5 | 88.9 | 88.7 | 90.3 |
| L-抗坏血酸 | 90.3 | 89.5 | 89.1 | 91.7 | 90.5 | 90.5 | 91.5 |
实施例8
实施例8与实施例1的不同之处仅在于，待测样品为实施例1中多维片的不含九种维生素的阴性空白基质，以及分别向阴性空白基质中添加维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、维生素B12和L-抗坏血酸标准溶液的九种试样。阴性空白基质和阴性空白基质中分别添加维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、维生素B12和L-抗坏血酸标准品的液相色谱-质谱联用检测图谱分别为图1-图9；图中得到的九种维生素的保留时间及离子丰度比、杂质干扰评估结果如表3。
由图1-9和表3可知：阴性空白基质中不含有对采用本方法测定维生素B1、B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、B12和L-抗坏血酸造成干扰的杂质，方法专属性好，特异性强。
表3方法特异性验证结果
| 标准品名称 | 保留时间(min) | 离子丰度比 | 有无杂质干扰 |
| 维生素B1 | 1.27 | 0.4211 | 无 |
| 维生素B2 | 5.88 | 0.3326 | 无 |
| 烟酰胺 | 2.62 | 0.9167 | 无 |
| 泛酸 | 5.56 | 1.9156 | 无 |
| 吡哆醇 | 2.75 | 0.4179 | 无 |
| 生物素 | 5.85 | 0.0899 | 无 |
| 叶酸 | 5.67 | 0.3356 | 无 |
| 维生素B12 | 5.59 | 0.6239 | 无 |
| L-抗坏血酸 | 1.49 | 1.0367 | 无 |
实施例9
实施例9与实施例1的不同之处仅在于，待测样品为在实施例1的多维片阴性空白基质溶液中加入适量维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、维生素B12和L-抗坏血酸标准储备液(维生素B12所用空白溶液为水)、逐级稀释得到的稀释液。
测试得到各稀释液中九种维生素的定量离子响应峰，以大于3倍信噪比时的稀释溶液浓度为检出限，大于10倍信噪比时的稀释液浓度为定量限，结果如表4，可知：
检测限：维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、叶酸、生物素、维生素B12的检测限浓度为1.0ng/mL；维生素C(L-抗坏血酸)的检测限浓度为10.0ng/mL。采用实施例1的待测样品质量及溶剂量，维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、叶酸的、生物素、维生素B12的检测限均为0.05μg/g；维生素C的检测限为0.5μg/g。
定量限：维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、叶酸、生物素、维生素B12的定量限浓度均为3.0ng/mL；维生素C(L-抗坏血酸)的定量限浓度为30.0ng/mL。采用实施例1的待测样品质量及溶剂量，维生素B1、维生素B2、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、叶酸、生物素、维生素B12的定量限均为0.15μg/g；维生素C的定量限为1.5μg/g。
本发明所提供方法具有极低的检测限及定量限，可对保健食品中微量的维生素进行定量检测。
表4检测限及定量限测试结果
实施例10
实施例10与实施例1的不同之处仅在于，平行配制六份待测样液进行测试。分析六平行的平均值、RSD、及实验室变异系数，结果如表5所示。
可知：
根据《实验室质量控制规范食品理化检测》GB/T 27404-2008附录F的要求：维生素B1、维生素B2、吡哆醇和泛酸在该浓度下实验室内变异系数为3.8％，即≤3.8％，方法RSD％分别为1.8％、1.4％、1.2％、1.7％；烟酰胺在该浓度下实验室内变异系数为2.7％，即≤2.7％，方法RSD％为1.6％；生物素在该浓度下实验室内变异系数为7.5％，即≤7.5％，方法RSD％为2.1％；叶酸在该浓度下实验室内变异系数为5.3％，即≤5.3％，方法RSD％为2.2％；维生素B12在该浓度下实验室内变异系数为11％，即≤11％，方法RSD％为2.9％；维生素C(L-抗坏血酸)在该浓度下实验室内变异系数为2.0％，即≤2.0％，方法RSD％为1.9％。
因此，本发明所提供的提取及检测方法，分析九种维生素结果的精密度均符合GB/T 27404-2008的要求，且RSD小于4％，方法精密度好，检测结果的重复性良好。
表5精密度试验测试结果
表5-1维生素B1检测精密度
表5-2维生素B2检测精密度
表5-3烟酰胺检测精密度
表5-4泛酸检测精密度
表5-5吡哆醇检测精密度
表5-6生物素检测精密度
表5-7叶酸检测精密度
表5-8维生素B12检测精密度
表5-9L-抗坏血酸检测精密度
实施例11
实施例11与实施例10的不同之处仅在于，待测样品不同，本实施例的待测样品如下：
准备9个干净棕色容量瓶，向其中依次加入0.090mL、0.180mL、0.270mL浓度为1000.0μg/mL的维生素B1标准储备液，0.070mL、0.140mL、0.210mL浓度为1000μg/mL的维生素B2标准储备液，0.200mL、0.400mL、0.600mL浓度为2.0mg/mL的烟酰胺标准储备液，0.150mL、0.300mL、0.450mL浓度为2.0mg/mL的泛酸标准储备液，0.120mL、0.240mL、0.360mL浓度为10μg/mL的生物素标准中间液，0.080mL、0.160mL、0.240mL浓度为100μg/mL的烟酸标准中间液，0.075mL、0.150mL、0.225mL浓度为1μg/mL的维生素B12标准中间液，以及0.550mL、1.100mL、1.650mL浓度为5.0mg/mL的维生素C(抗坏血酸)标准储备液，每个浓度平行三份，分别往其中精密加入0.5g样品，即为待测样品。
得到样品中九种维生素各自的总含量结果如表6。以实施例10中的六次平行实验结果平均值作为样品中个维生素本底含量值，计算九种维生素的回收率，公式如下：
回收率＝(各维生素总含量－各本底值)/加入标准量*100％
由表6可知：
本发明提供的提取及检测方法，检测保健食品中九种维生素的样品平均加标回收率均在90～110％范围内，符合GB/T 27404-2008的要求；且RSD值均小于3％，本方法的准确度高、稳定性好。
表6样品加标回收率实验数据
表6-1维生素B1回收率实验结果
注：样品中维生素B1本底含量值为356μg/g。
表6-2维生素B2回收率实验结果
/>
注：样品中维生素B2本底含量值为275μg/g。
表6-3烟酰胺回收率实验结果
注：样品中烟酰胺本底含量值为1.55mg/g。
表6-4泛酸回收率实验结果
注：样品中泛酸本底含量值为1.18mg/g。
表6-5吡哆醇回收率实验结果
注：样品中吡哆醇本底含量值为376μg/g。
表6-6生物素回收率实验结果
注：样品中生物素本底含量值为4.66μg/g。
表6-7叶酸回收率实验结果
注：样品中叶酸本底含量值为31.6μg/g。
表6-8维生素B12回收率实验结果
注：样品中维生素B12本底含量值为0.287μg/g。
表6-9维生素C回收率实验结果
注：样品中维生素C本底含量值为10.7mg/g。
实施例12
实施例12与实施例1的不同之处仅在于，待测样品为多维矿物片。
实施例13
实施例13与实施例1的不同之处仅在于，待测样品为复合蛋白粉。
上述实施例1、实施例12-13中不同待测样品中九种维生素含量的检测值如表7。
由表7可知：本发明所提供的保健食品中九种维生素的提取及检测方法适用于多种不同基质的片剂、冲剂等保健品的检测，适用性广。
表7不同基质样品中九种维生素含量的检测结果
综合实施例可知：本发明所限定的保健食品中九种维生素的提取及检测方法，专属性好，特异性强，无杂质干扰；具有极低的检测限及定量限，可对保健食品中微量的维生素进行定量检测；分析九种维生素结果的精密度、重复性好、准确度高、结果稳定，符合GB/T27404-2008的要求；且在适用于多种不同基质的片剂、冲剂等保健品的检测，适用性广，有很高的应用价值。
对比例1
对比例1与实施例1的不同之处仅在于，萃取采用的溶剂为水(pH＝4.5)。
对比例2
对比例2与实施例1的不同之处仅在于，萃取采用的溶剂为乙腈水溶液(体积比乙腈：水＝1:4，pH＝4.5)。
对比例3
对比例3与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂中静态萃取的时间为100s，总萃取时间为220s。
对比例4
对比例4与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂中静态萃取的时间为270s，总萃取时间为390s。
对比例5
对比例5与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂中萃取压力为5MPa。
对比例6
对比例6与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂中萃取温度为30℃。
对比例7
对比例7与实施例1的不同之处仅在于，加速溶剂中萃取温度为50℃。
上述对比例1-7中，待测样品中九种维生素含量的检测回收率如表8。
表8对比例中九种维生素含量的检测回收率
| 维生素 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 |
| 维生素B1 | 99.6 | 95.1 | 79.5 | 94.2 | 90.1 | 91.2 | 93.0 |
| 维生素B2 | 80.1 | 94.9 | 65.2 | 95.8 | 93.6 | 94.3 | 94.6 |
| 烟酰胺 | 95.2 | 95.1 | 84.0 | 92.1 | 94.1 | 93.1 | 93.1 |
| 维生素B6 | 92.5 | 96.3 | 83.4 | 96.1 | 94.6 | 90.5 | 95.7 |
| 泛酸 | 91.3 | 88.7 | 89.2 | 93.2 | 92.2 | 85.4 | 95.8 |
| 生物素 | 75.1 | 74.2 | 79.8 | 87.5 | 78.1 | 79.3 | 84.5 |
| 叶酸 | 66.8 | 79.3 | 73.3 | 84.6 | 69.8 | 80.4 | 86.5 |
| 维生素B12 | 83.9 | 88.1 | 81.5 | 90.3 | 81.2 | 85.5 | 89.6 |
| L-抗坏血酸 | 91.3 | 91.7 | 88.9 | 86.3 | 90.5 | 91.1 | 90.4 |
由表2及表8实施例及对比例的回收率比较可知：
(1)由实施例1及对比例1-2：采用本发明所限定的溶剂甲醇水溶液(体积比甲醇：水＝1:4，pH＝4.5)，进行加速溶剂萃取，测试样品中九种维生素的回收率都能控制在89％以上；仅采用水、或采用其他有机溶剂的水溶液，加速溶剂萃取的效果较差，生物素、叶酸、维生素B12等维生素的回收率显著下降。
(2)由实施例1-3及对比例3-4：本发明所限定的萃取时间270-330s内，提取、检测多维片样品中九种维生素的回收率皆能达到85％以上，提取效果较好；静态萃取时间减少，则维生素B2、叶酸等的回收率显著下降；静态萃取时间继续增加；部分维生素产生略微降解，回收率并不继续提升。综合看，总萃取时间为300s，静态萃取时间为180s时效果最优。
(4)由实施例1、4、5及对比例5：本发明所限定的加速溶剂萃取压力10-12MPa内，提取、检测多维片样品中九种维生素的回收率皆能达到89％以上，提取效果好；萃取压力降低，则维生素B9(叶酸)、维生素B7(生物素)等无法被完全萃取出来，回收率显著降低；在压力10MPa以上时，继续提升压力，回收率并不继续提升，部分维生素出现略微降解。综合看，萃取压力为10MPa时效果最优。
(5)由实施例1及对比例6-7：在40℃的萃取温度下，综合可达到最好的萃取效果。降低萃取温度，维生素B9(叶酸)、维生素B7(生物素)等提取效果差、回收率显著降低；升高萃取温度，回收率不会进一步提升、部分维生素出现降解，且有机溶剂过多可能产生爆炸危险。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种保健食品中维生素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：向待测样品中加入溶剂，然后进行加速溶剂萃取、冷却，得到所述维生素的提取液；所述溶剂为甲醇水溶液，所述溶剂的pH值为4.4-4.6；所述待测样品的质量与溶剂的体积比为1g：(40-60)mL；所述加速溶剂萃取中：萃取温度为39-41℃，萃取压力为10-12MPa，萃取时间为270s-330s，所述萃取时间包括加热时间和静态萃取时间；所述待测样品为保健食品；所述维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12、维生素C中至少一种。
2.根据权利要求1所述保健食品中维生素的提取方法，其特征在于，所述甲醇水溶液包括甲醇和水，所述甲醇与水的体积比为1:4。
3.根据权利要求1所述保健食品中维生素的提取方法，其特征在于，所述待测样品的质量与溶剂的体积比为1g：50mL。
4.根据权利要求1所述保健食品中维生素的提取方法，其特征在于，所述加速溶剂萃取中，萃取温度为40℃，萃取压力为10MPa。
5.根据权利要求4所述保健食品中维生素的提取方法，其特征在于，所述加速溶剂萃取中，萃取时间为300s；优选地，所述萃取时间中，加热时间为120s，静态萃取时间为180s。
6.根据权利要求5所述保健食品中维生素的提取方法，其特征在于，所述加速溶剂萃取中，萃取的淋洗体积为40％，吹扫时间为60s，循环次数为2次。
7.一种保健食品中维生素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用权利要求1-6中任一项所述提取方法提取待测样品中的维生素，得到所述维生素的提取液；
(2)采用液相色谱-质谱联用法检测步骤(1)得到的维生素提取液，得到所述待测样品中维生素的含量。
8.根据权利要求7所述保健食品中维生素的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述液相色谱-质谱联用法中液相色谱的条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，色谱柱的尺寸为1.8μm，100mm×2.1mm；流动相包括A相和B相，所述A相为20mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸甲醇溶液；所述A相和B相的流速之和为0.3mL/min。
9.根据权利要求8所述保健食品中维生素的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下表所示：
10.根据权利要求7所述保健食品中维生素的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液相色谱-质谱联用法中质谱的条件为：电离方式为电喷雾正离子模式；检测方式为多反应检测；离子喷雾电压为5500V；气帘气流速为30.0L/min；雾化气流速为50.0L/min；辅助加热气流速为50.0L/min；辅助加热气温度为550℃。
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