CN112162052A - 一种水产品中兽药多残留的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种水产品中兽药多残留的测定方法，步骤如下：①标准系列工作液的制备：分别称取4种孔雀石绿类药物0.1g将其转移至容量瓶中，采用乙腈定容；分别称取8种喹诺酮类药物0.1g将其一起转移至容量瓶中，采用2％乙酸乙腈定容；②试样制备；③称取粉碎好的样品，加内标工作液，加入20‑30mL酸化乙腈(含1～5％乙酸或0.5％～5％甲酸)，振摇混匀、均质，加入5g中性氧化铝粉末，振荡混匀，冰浴超声、低温离心，取上清，惰性气体吹至近干，得待净化液；加入1～2mL乙腈+水溶液溶解待净化液，加入正己烷混匀，淋洗去除正己烷，用聚醚砜滤膜过滤；然后确定色谱、质谱条件及色谱、质谱参数设定；有益效果：检测精准度更高、可信度更高，可降低化学试剂带来的危害，节约成本。

Description

一种水产品中兽药多残留的测定方法
技术领域
本发明涉及兽药多残留检测技术，尤其是涉及一种水产品中兽药多残留的测定方法。
背景技术
兽药残留是指畜禽动物、水产动物用药后，蓄积或储存在其机体细胞、组织或器官以及其产品(乳、蛋等)中的原型药物、代谢产物或与兽药相关的杂质残留。食品中残留的药物经过食物链传递到人体内并在其中不断富集，从而引发人体慢性中毒。
其中，水产品普遍使用的兽药包括喹诺酮类及孔雀石绿共两种。
喹诺酮类(Quinolones，QNs)又称吡啶酮酸类，是具有1,4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸结构人工合成的一类新型抗菌药，不合理使用不仅会引发一些不良反应(恶心、呕吐、头晕等)甚至会增强细菌的耐药性。
孔雀石绿(Malachite green，MG)又名苯胺绿、碱性绿、盐基块氯或中国绿等，是一种带油金属光泽的绿色结晶状固体。由于其含有致癌基团三苯甲基，而显示出高毒、致癌、致畸、致突变等特点。其代谢物隐色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)是一种稳定性更好、残留毒性更强的物质。孔雀石绿及其代谢物被国际癌症研究机构列为第2类致癌。
目前市面上能同时检测喹诺酮类及孔雀石绿的公司很少，一般采用不同的方法分别进行检测，其检测过程试剂类别多，使用量大，处理过程复杂，耗时长，也有同时检测各种药物的方法，一般情况下该方法误差很大，检测结果不可靠。但也有能同时测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类药物的方法，包括专利号：201710101179.3，名称为测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法的专利，该方法已经可以对有/无色孔雀石绿、氘代有/无色孔雀石绿、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氘代环丙沙星进行检测，从该专利的实施例可知，该检测方法中有数据的回收率超过了100％，例如恩诺沙星的回收率为101.3％，因此该检测方法的回收率有一定误差，准确率还不够准确；因此在样品量稀释倍数增大的情况下，其检测结果更为不准确，不可靠。还包括专利号：201611046606.4，名称为一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法的专利，其主要针对孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、吡哌酸、依诺沙星进行检测，该检测方法也存在同样问题，甚至误差率更多更高，而且上述专利针对其他类的喹诺酮类药物均没有披露定量离子对、定性离子对等检测参数，因此如何研制出一种但单独检测喹诺酮类及孔雀石类药物，准确度更高、相对偏差较小的水产品中兽药多残留的测定方法是本领域的技术人员有待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种标准曲线系列浓度的配置采取与样品同时处理的方式来降低基质效应带来的误差、数据的准确性更高、误差性更小、通过优化UPLC和三重四级杆质谱检测器参数，可进一步排除干扰降低基质效应，并获得更低的检出限的水产品中兽药多残留的测定方法。
为实现上述的发明目的，本发明的技术方案如下：
一种水产品中兽药多残留的测定方法,该方法包括如下几步：
(1)步骤一，标准系列工作液的制备：
分别称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫0.1g，并将其转移至100mL容量瓶中，采用乙腈定容至刻度，得到孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准混合溶液；
进一步，分别称取所述孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫0.1g均精确至0.00001g；
分别称取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸0.01g，并将其一起转移至100mL容量瓶中，采用2％乙酸乙腈定容至刻度，得到8种喹诺酮类标准混合溶液；
进一步，上述分别称取所述洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸0.1g均精确至0.00001g；
采用加标前处理的方式制备标准系列工作液；
(2)步骤二，试样制备
试样制备，对照样品溶液制备；
(3)步骤三，提取
称取2～5g粉碎好的样品，加入MG-D5及LMG-D6内标工作液，加入20-30mL酸化乙腈，剧烈振摇混匀，均质器均质20～40s，加入5g中性氧化铝粉末，振荡混匀1～5min，冰浴超声20～40min，4～15℃低温离心5～10min，转速6000～9500rpm，取上清，惰性气体30～45℃吹至近干，得待净化液；
进一步，上述步骤中的酸化乙腈中含1～5％乙酸或0.5％～5％甲酸；
加入1～2mL乙腈+水溶液溶解待净化液，加入2～5mL正己烷混匀，淋洗去除正己烷，下层清液用0.22μm聚醚砜滤膜过滤至上机瓶中，得到待测液；
进一步，上述步骤中的乙腈+水的比例为(0.5～1)：(9～9.5)；
(4)步骤四，确定色谱条件及色谱参数设定
a、喹诺酮类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
时间(min) A：乙腈(％) B：甲酸水(0.2％)(％) 流量(mL/min) 压力(psi)
0 10 90 0.2 12000
2.50 10 90 0.2 12000
3.00 95 5 0.2 12000
6.00 95 5 0.2 12000
6.01 10 90 0.2 12000
8.00 10 90 0.2 12000
b、孔雀石绿类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
时间(min) A：乙腈(％) B：水(％) 流速(mL/min) 压力(psi)
0.00 10 90 0.20 12000
1.00 10 90 0.20 12000
1.50 90 10 0.20 12000
3.50 90 10 0.20 12000
3.51 10 90 0.20 12000
5.00 10 90 0.20 12000
(5)步骤五，确定质谱条件及质谱参数设定
a、喹诺酮类：离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
Figure BDA0002765660510000031
b、孔雀石绿类：质谱参数设定：
离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
项目名称 定量离子对(m/z) 定性离子对(m/z)
MG 329.4/313.2 329.4/208.2
LMG 331.5/316.0 331.5/239.0
CV 372.2/356.2 372.2/251.1
LCV 374.0/359.0 374.0/238.0
MG-D<sub>5</sub> 334.2/318.1
LMG-D<sub>6</sub> 337.3/322.1
(6)步骤六，标准工作曲线的绘制
量取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫分别0.1g，采用乙腈定容至100mL；再量取MG-D5和LMG-D6分别0.01g，采用乙腈定容至10mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫内标浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，MG-D5和LMG-D6的内标浓度均为1ng/mL；
量取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸分别0.1g，2％乙酸乙腈定容至100mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，喹诺酮类外标浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL。
内标法定量，试验结果，确定孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫质量浓度均在1～20ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.99～0.9999之间；
确定洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸质量浓度在5～200ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.993～0.9997之间；
(7)步骤七，灵敏度、准确度和精密度的确定
8种喹诺酮类和孔雀石绿药物的标准曲线回归方程、相关系数与方法检出限：
Figure BDA0002765660510000041
Figure BDA0002765660510000051
灵敏度：在本方法规定的取样体积和定容体积下，按3倍信噪比计算得，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的检出限均为0.25μg/kg，洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸的检出限为2.0μg/kg；准确度：以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)，有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，喹诺酮定量限均为2.0μg/kg；
精密度：本方法批内相对偏差≤10％，批间相对偏差≤10％；
本发明的有益效果是：
本发明给出了一种能减少基质效应问题，更为节能、环保的水产品中兽药多残留的测定方法，本发明采用酸化乙腈同步提取4种孔雀石绿类和8种喹诺酮类，不仅提取效率高，且能排除杂质干扰，该方法通过将提取过程与净化过程同时进行，来提高净化效率，减少基质效应，净化过程采用的是液液萃取，提取过程中试剂消耗量少，仅消耗20～30mL酸化乙腈；采用中性氧化铝粉末代替中性氧化铝柱进行净化，可减少洗脱液的使用，采用乙腈+水/甲酸水作为流动相，无需添加盐类(如乙酸铵)，出峰响应高，且利于设备的维护；本发明通过优化UPLC和三重四级杆质谱检测器参数，可进一步排除干扰降低基质效应，并获得更低的检出限；标准曲线系列浓度的配置采取与样品同时处理的方式，可降低基质效应带来的误差，数据的准确性更高。
进一步，本水产品中兽药多残留的测定方法的检测精准度更高、更准确、可信度更高，由检测方法的验证环节结合由各个药品的色谱图、标准工作曲线图等验证出，本方法几乎避免了基质效应问题，采用本方法使得批内相对偏差≤10％，批间相对偏差≤10％，目前为止该方法为市面上准确度最高的检测方法，且检出限及定量限值较低，定量、定性准确度均较好；进一步，采用本方法在样品量减少或稀释倍数增大的情况下，同样可以检测出待测物，同时还可以降低基质效应带来的误差；同时本发明所采用的化学试剂类型少(仅使用乙腈、甲酸和中性氧化铝，同类方法使用乙腈、甲酸、乙酸铵、乙酸乙酯及中性氧化铝固相萃取柱等)，使用量也较少，不仅可以降低化学试剂带来的危害，同时可以节约成本。
由于本发明给出了检测孔雀石类及喹诺酮类药物的检测方法、详细步骤、检测时的各项参数及其他，其精密度高、灵敏度高、准确度高，检测结果极为可靠，在样品量减少或稀释倍数增大的情况下，同样可以检测出待测物，因此该方法可引用到其他类似的药品检测上，本发明为今后该类、相似药物奠定了坚实的基础。
附图说明：
图1：洛美沙星色谱图；
图2：氧氟沙星色谱图；
图3：沙拉沙星色谱图；
图4：恩诺沙星色谱图；
图5：奥比沙星色谱图；
图6：麻保沙星色谱图；
图7：司帕沙星色谱图；
图8：吡哌酸色谱图；
图9：孔雀石绿色谱图；
图10：隐色孔雀石绿色谱图；
图11：结晶紫色谱图；
图12：隐色结晶紫色谱图；
图13：MG-D5色谱图；
图14：LMG-D6色谱图；
图15：孔雀石绿(MG)标准工作曲线图；
图16：隐色孔雀石绿(LMG)标准工作曲线图；
图17：结晶紫(CV)标准工作曲线图；
图18：隐色结晶紫(LCV)标准工作曲线图；
图19：MG-D5标准工作曲线图；
图20：LMG-D6标准工作曲线图；
图21：洛美沙星标准工作曲线图；
图22：氧氟沙星标准工作曲线图；
图23：沙拉沙星标准工作曲线图；
图24：恩诺沙星标准工作曲线图；
图25：奥比沙星标准工作曲线图；
图26：麻保沙星标准工作曲线图；
图27：司帕沙星标准工作曲线图；
图28：吡哌酸标准工作曲线图；
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施案例提供了一种采用超高效液相色谱串联质谱质谱法测试水产品中孔雀石绿类和8种喹诺酮类药物残留含量的方法，包括以下步骤：
标准系列工作液的制备：分别称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫0.1g(精确至0.00001g)，并将其转移至100mL容量瓶中，采用乙腈定容至刻度，得到孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准混合溶液；分别称取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸0.1g(精确至0.00001g)，并将其一起转移至100mL容量瓶中，采用2％乙酸乙腈定容至刻度，得到8种喹诺酮类标准混合溶液。采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，孔雀石绿内标MG-D5和隐色孔雀石绿LMG-D6的浓度为1ng/mL，喹诺酮类浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL。
样品制备：将市场采购的草鱼去鳞、去皮、去骨，肉切成块，粉碎成肉糜。
提取：取5g粉碎好的样品，加入酸化乙腈(含3％乙酸)，加入酸化乙腈之后采用均质器进行均质提取，均质时间为30s，加入5g中性氧化铝粉末，振荡混匀2min，冰浴超声30min，4℃低温离心5min，转速为9000rpm。取离心后全部上清液进行氮吹浓缩至近干，氮吹的温度为40℃。
进一步，上述酸化乙腈的添加量为20mL；
净化：加入乙腈+水(比例为1+9)定容，加入2mL正己烷，轻轻摇匀，离心，弃去上层正己烷，取下层过0.22μm无机滤膜。
测定：
a、喹诺酮类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
时间(min) A：乙腈(％) B：甲酸水(0.2％)(％) 流量(mL/min) 压力(psi)
0 10 90 0.2 12000
2.50 10 90 0.2 12000
3.00 95 5 0.2 12000
6.00 95 5 0.2 12000
6.01 10 90 0.2 12000
8.00 10 90 0.2 12000
质谱参数设定：
离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
Figure BDA0002765660510000081
b、孔雀石绿类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
时间(min) A：乙腈(％) B：水(％) 流速(mL/min) 压力(psi)
0.00 10 90 0.20 12000
1.00 10 90 0.20 12000
1.50 90 10 0.20 12000
3.50 90 10 0.20 12000
3.51 10 90 0.20 12000
5.00 10 90 0.20 12000
质谱参数设定：
离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
项目名称 定量离子对(m/z) 定性离子对(m/z)
MG 329.4/313.2 329.4/208.2
LMG 331.5/316.0 331.5/239.0
CV 372.2/356.2 372.2/251.1
LCV 374.0/359.0 374.0/238.0
MG-D5 334.2/318.1
LMG-D6 337.3/322.1
(6)步骤六，标准工作曲线的绘制
量取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫分别0.1g，采用乙腈定容至100mL；再量取MG-D5和LMG-D6分别0.01g，采用乙腈定容至10mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫内标浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，MG-D5和LMG-D6的内标浓度均为1ng/mL；
量取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸分别0.1g，2％乙酸乙腈定容至100mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，喹诺酮类外标浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL。
内标法定量，试验结果，确定孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫质量浓度均在1～20ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.995～0.9999之间；
确定洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸质量浓度在5～200ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.996～0.9992之间；
(7)步骤七，灵敏度、准确度和精密度的确定
8种喹诺酮类和孔雀石绿药物的标准曲线回归方程、相关系数与方法检出限：
Figure BDA0002765660510000091
Figure BDA0002765660510000101
灵敏度：在本方法规定的取样体积和定容体积下，按3倍信噪比计算得，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的检出限均为0.25μg/kg，洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸的检出限为2.0μg/kg；准确度：以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)，有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，喹诺酮定量限均为2.0μg/kg；
精密度：本方法批内相对偏差≤10％，批间相对偏差≤10％；
本检测方法的验证：
试验采用空白加标的方式，在水产品空白基质中做3个水平组的加标，有/无孔雀石绿0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.25μg/kg，喹诺酮2μg/kg、4μg/kg、10μg/kg，每组6个平行，按上述处理后测定，孔雀石绿在空白样品中添加回收率和相对标准偏差(n＝6),喹诺酮在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)；
孔雀石绿在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差
Figure BDA0002765660510000102
喹诺酮类在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差
Figure BDA0002765660510000111
实验结果表明：有/无孔雀石绿、喹诺酮类在水产品中的加标回收率均能达到检测要求，说明本方法具有较高的标准性。同时，相对标准偏差RSD均低于10％，表明结果在置信区间内，本方法具有较高的可靠性。
实施例2
本实施案例提供了一种采用超高效液相色谱串联质谱质谱法测试水产品中孔雀石绿类和8种喹诺酮类药物残留含量的方法，包括以下步骤：
1)标准系列工作液的制备：分别称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫0.1g(精确至0.00001g)，并将其转移至100mL容量瓶中，采用乙腈定容至刻度，得到孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准混合溶液；分别称取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸0.1g(精确至0.00001g)，并将其一起转移至100mL容量瓶中，采用2％乙酸乙腈定容至刻度，得到8种喹诺酮类标准混合溶液。采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，孔雀石绿内标MG-D5和隐色孔雀石绿LMG-D6的浓度为1ng/mL，喹诺酮类浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL。
2)样品制备：将市场采购的草鱼去鳞、去皮、去骨，肉切成块，粉碎成肉糜。
3)提取：取5g粉碎好的样品，加入酸化乙腈(含1.5％乙酸)，加入酸化乙腈之后采用均质器进行均质提取，均质时间为30s，加入5g中性氧化铝粉末，振荡混匀2min，冰浴超声30min，4℃低温离心5min，转速为9000rpm。取离心后全部上清液进行氮吹浓缩至近干，氮吹的温度为35℃。
进一步，上述酸化乙腈的添加量为20mL；
4)净化：加入乙腈+水(比例为0.5+9.5)定容，加入3mL正己烷，轻轻摇匀，离心，弃去上层正己烷，取下层过0.22μm无机滤膜。
5)测定：
a、喹诺酮类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
时间(min) A：乙腈(％) B：甲酸水(0.2％)(％) 流量(mL/min) 压力(psi)
0 10 90 0.2 12000
2.50 10 90 0.2 12000
3.00 95 5 0.2 12000
6.00 95 5 0.2 12000
6.01 10 90 0.2 12000
8.00 10 90 0.2 12000
质谱参数设定：
离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
Figure BDA0002765660510000121
b、孔雀石绿类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
Figure BDA0002765660510000122
Figure BDA0002765660510000131
质谱参数设定：
离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
项目名称 定量离子对(m/z) 定性离子对(m/z)
MG 329.4/313.2 329.4/208.2
LMG 331.5/316.0 331.5/239.0
CV 372.2/356.2 372.2/251.1
LCV 374.0/359.0 374.0/238.0
MG-D5 334.2/318.1
LMG-D6 337.3/322.1
(6)步骤六，标准工作曲线的绘制
量取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫分别0.1g，采用乙腈定容至100mL；再量取MG-D5和LMG-D6分别0.01g，采用乙腈定容至10mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫内标浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，MG-D5和LMG-D6的内标浓度均为1ng/mL；
量取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸分别0.1g，2％乙酸乙腈定容至100mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，喹诺酮类外标浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL。
内标法定量，试验结果，确定孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫质量浓度均在1～20ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.994～0.9993之间；
确定洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸质量浓度在5～200ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.995～0.9994之间；
(7)步骤七，灵敏度、准确度和精密度的确定
8种喹诺酮类和孔雀石绿药物的标准曲线回归方程、相关系数与方法检出限：
Figure BDA0002765660510000132
Figure BDA0002765660510000141
灵敏度：在本方法规定的取样体积和定容体积下，按3倍信噪比计算得，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的检出限均为0.25μg/kg，洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸的检出限为2.0μg/kg；准确度：以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)，有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，喹诺酮定量限均为2.0μg/kg；
精密度：本方法批内相对偏差≤10％，批间相对偏差≤10％；
本检测方法的验证：
试验采用空白加标的方式，在水产品空白基质中做3个水平组的加标，有/无孔雀石绿0.25μg/kg、0.5μg/kg、1.25μg/kg，喹诺酮2μg/kg、4μg/kg、10μg/kg，每组6个平行，按上述处理后测定，孔雀石绿在空白样品中添加回收率和相对标准偏差(n＝6),喹诺酮在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)；
孔雀石绿在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差
Figure BDA0002765660510000142
Figure BDA0002765660510000151
喹诺酮类在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差
Figure BDA0002765660510000152
实验结果表明：有/无孔雀石绿、喹诺酮类在水产品中的加标回收率均能达到检测要求，说明本方法具有较高的标准性。同时，相对标准偏差RSD均低于10％，表明结果在置信区间内，本方法具有较高的可靠性。
实施例3
本实施案例提供了一种采用超高效液相色谱串联质谱质谱法测试水产品中孔雀石绿类和8种喹诺酮类药物残留含量的方法，包括以下步骤：
1)标准系列工作液的制备：分别称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫0.1g(精确至0.00001g)，并将其转移至100mL容量瓶中，采用乙腈定容至刻度，得到孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准混合溶液；分别称取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸0.1g(精确至0.00001g)，并将其一起转移至100mL容量瓶中，采用2％乙酸乙腈定容至刻度，得到8种喹诺酮类标准混合溶液。采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，孔雀石绿内标MG-D5和隐色孔雀石绿LMG-D6的浓度为1ng/mL，喹诺酮类浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL。
2)样品制备：将市场采购的草鱼去鳞、去皮、去骨，肉切成块，粉碎成肉糜。
3)提取：取5g粉碎好的样品，加入酸化乙腈(含2.5％乙酸)，加入酸化乙腈之后采用均质器进行均质提取，均质时间为20s。加入5g中性氧化铝粉末，振荡混匀2min，冰浴超声30min，4℃低温离心5min，转速为9000rpm。取离心后全部上清液进行氮吹浓缩至近干，氮吹的温度为45℃。
进一步，上述酸化乙腈的添加量为20mL；
4)净化：加入乙腈+水(比例为0.5+9.5)定容，加入3mL正己烷，轻轻摇匀，离心，弃去上层正己烷，取下层过0.22μm无机滤膜。
5)测定：
a、喹诺酮类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
时间(min) A：乙腈(％) B：甲酸水(0.2％)(％) 流量(mL/min) 压力(psi)
0 10 90 0.2 12000
2.50 10 90 0.2 12000
3.00 95 5 0.2 12000
6.00 95 5 0.2 12000
6.01 10 90 0.2 12000
8.00 10 90 0.2 12000
质谱参数设定：
离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
Figure BDA0002765660510000161
b、孔雀石绿类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
Figure BDA0002765660510000162
Figure BDA0002765660510000171
质谱参数设定：
离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
项目名称 定量离子对(m/z) 定性离子对(m/z)
MG 329.4/313.2 329.4/208.2
LMG 331.5/316.0 331.5/239.0
CV 372.2/356.2 372.2/251.1
LCV 374.0/359.0 374.0/238.0
MG-D5 334.2/318.1
LMG-D6 337.3/322.1
(6)步骤六，标准工作曲线的绘制
量取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫分别0.1g，采用乙腈定容至100mL；再量取MG-D5和LMG-D6分别0.01g，采用乙腈定容至10mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫内标浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，MG-D5和LMG-D6的内标浓度均为1ng/mL；
量取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸分别0.1g，2％乙酸乙腈定容至100mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，喹诺酮类外标浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL。
内标法定量，试验结果，确定孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫质量浓度均在1～20ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.992～0.9995之间；
确定洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸质量浓度在5～200ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.993～0.9990之间；
(7)步骤七，灵敏度、准确度和精密度的确定
8种喹诺酮类和孔雀石绿药物的标准曲线回归方程、相关系数与方法检出限：
序号 中文名称 线性范围(μg/kg) 回归方程 相关系数(R<sup>2</sup>) 检出限(μg/kg)
1 孔雀石绿 1～20 y＝2.2463x-0.939108 0.9994 0.25
2 隐色孔雀石绿 1～20 y＝1.9715x-0.71364 0.9922 0.25
3 结晶紫 1～20 y＝0.3823x-1.18843 0.9929 0.25
4 隐色结晶紫 1～20 y＝1.17758x+2.34505 0.9995 0.25
5 洛美沙星 5～200 y＝229.155x+417.5 0.9957 2.0
6 氧氟沙星 5～200 y＝467.561x+297.99 0.9967 2.0
7 沙拉沙星 5～200 y＝103.09x+60.841 0.9936 2.0
8 恩诺沙星 5～200 y＝61.0249x+-6.85137 0.9986 2.0
9 奥比沙星 5～200 y＝69.2039x+373.912 0.9990 2.0
10 麻保沙星 5～200 y＝45.2033x+9.29101 0.9968 2.0
11 司帕沙星 5～200 y＝17.1587x-47.9861 0.9987 2.0
12 吡哌酸 5～200 y＝566.619x+544.93 0.9988 2.0
灵敏度：在本方法规定的取样体积和定容体积下，按3倍信噪比计算得，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的检出限均为0.25μg/kg，洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸的检出限为2.0μg/kg；准确度：以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)，有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，喹诺酮定量限均为2.0μg/kg；
精密度：本方法批内相对偏差≤10％，批间相对偏差≤10％；
本检测方法的验证：
试验采用空白加标的方式，在水产品空白基质中做3个水平组的加标，有/无孔雀石绿0.25μg/kg、0.5μg/kg、1.25μg/kg，喹诺酮2μg/kg、4μg/kg、10μg/kg，每组6个平行，按上述处理后测定，孔雀石绿在空白样品中添加回收率和相对标准偏差(n＝6),喹诺酮在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)；
孔雀石绿在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差
Figure BDA0002765660510000181
Figure BDA0002765660510000191
喹诺酮类在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差
Figure BDA0002765660510000192
实验结果表明：有/无孔雀石绿、喹诺酮类在水产品中的加标回收率均能达到检测要求，说明本方法具有较高的标准性。同时，相对标准偏差RSD均低于10％，表明结果在置信区间内，本方法具有较高的可靠性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改和等同替换，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种水产品中兽药多残留的测定方法,其特征在于：该方法包括如下几步：
(1)步骤一，标准系列工作液的制备：
分别称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫0.1g，并将其转移至100mL容量瓶中，采用乙腈定容至刻度，得到孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准混合溶液；
进一步，分别称取所述孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫0.1g均精确至0.00001g；
分别称取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸0.1g，并将其一起转移至100mL容量瓶中，采用2％乙酸乙腈定容至刻度，得到8种喹诺酮类标准混合溶液；
进一步，上述分别称取所述洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸0.1g均精确至0.00001g；
采用加标前处理的方式制备标准系列工作液；
(2)步骤二，试样制备
试样制备，对照样品溶液制备；
(3)步骤三，提取
称取2～5g粉碎好的样品，加入MG-D5及LMG-D6内标工作液，加入20-30mL酸化乙腈，剧烈振摇混匀，均质器均质20～40s，加入5g中性氧化铝粉末，振荡混匀1～5min，冰浴超声20～40min，4～15℃低温离心5～10min，转速6000～9500rpm，取上清，惰性气体30～45℃吹至近干，得待净化液；
进一步，上述步骤中的酸化乙腈中含1～5％乙酸或0.5％～5％甲酸；
加入1～2mL乙腈+水溶液溶解待净化液，加入2～5mL正己烷混匀，淋洗去除正己烷，下层清液用0.22μm聚醚砜滤膜过滤至上机瓶中，得到待测液；
进一步，上述步骤中的乙腈+水的比例为(0.5～1)：(9～9.5)；
(4)步骤四，确定色谱条件及色谱参数设定
a、喹诺酮类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
Figure FDA0002765660500000011
Figure FDA0002765660500000021
b、孔雀石绿类：超高效液相色谱仪串联质谱质谱仪，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，流动相梯度设定：
Figure FDA0002765660500000022
(5)步骤五，确定质谱条件及质谱参数设定
a、喹诺酮类：离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
Figure FDA0002765660500000023
b、孔雀石绿类：质谱参数设定：
离子源：ESI+；扫描模式：MRM；离子对：
Figure FDA0002765660500000024
Figure FDA0002765660500000031
(6)步骤六，标准工作曲线的绘制；
(7)步骤七，灵敏度、准确度和精密度的确定。
2.根据权利要求1所述的一种水产品中兽药多残留的测定方法,其特征在于：步骤六中的标准工作曲线的绘制方法如下：
量取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫分别0.1g，采用乙腈定容至100mL；再量取MG-D5和LMG-D6分别0.01g，采用乙腈定容至10mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫内标浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，MG-D5和LMG-D6的内标浓度均为1ng/mL；
量取洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸分别0.1g，2％乙酸乙腈定容至100mL，采用加标前处理的方式制备标准系列工作液，喹诺酮类外标浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL；
内标法定量，试验结果，确定孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫质量浓度均在1～20ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.99～0.9999之间；
确定洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸质量浓度在5～200ng/mL范围内与峰值面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2在0.993～0.9997之间。
3.根据权利要求2所述的一种水产品中兽药多残留的测定方法,其特征在于：步骤七中的灵敏度、准确度和精密度的确定方法为：
8种喹诺酮类和孔雀石绿药物的标准曲线回归方程、相关系数与方法检出限：
Figure FDA0002765660500000032
Figure FDA0002765660500000041
灵敏度：在本方法规定的取样体积和定容体积下，按3倍信噪比计算得，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的检出限均为0.25μg/kg，洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、恩诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、司帕沙星、吡哌酸的检出限为2.0μg/kg；
准确度：以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)，有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，喹诺酮定量限均为2.0μg/kg；
精密度：本方法批内相对偏差≤10％，批间相对偏差≤10％。
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