CN104730190B - 同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法,具体步骤包括:分别制备样品混合标准溶液和待测液,利用高效液相色谱仪,以乙腈‑磷酸溶液为流动相梯度洗脱分离各种维生素,对各混合标样和待测液进行检测,然后依据多组混合标样的检测数据进行线性回归,进而依据这些线性回归方程以及待测液的检测数据,分析计算待测液中水溶性维生素VB1,VB2,VB3,VC,VB5,VB6,VB9,VB12的含量,从而推知所测食品或保健品样品当中各种水溶性维生素的含量本发明能一次性同时完成8种水溶性维生素的检测分析,能够有效改善多种维生素的分离效率,可以测定基质较为复杂的样品。
Description
技术领域
本发明涉及一种可同时测定食品或保健品中多种水溶性维生素含量的方法。
背景技术
维生素是维持人体正常物质代谢和某些特殊生理功能不可缺少的低分子有机化合物,多数是辅基和酶的组成部分。维生素根据其物理性质可分为脂溶性维生素和水溶性维生素。水溶性维生素包括B族维生素(VB1、VB2、VB3、VB6、VB12等),VC,泛酸等。人体每天需要摄取不同的维生素来参与人体的正常生理代谢过程,而这些维生素主要来源于食物。但是人体摄取的维生素太多和太少都有可能引起身体的不适,严重的还会引起病变。例如,能促进食欲的维生素VB9(叶酸),不仅存在于绿色蔬菜中,也存在于肝脏和肾脏中,肠道中细菌也能合成。VB9缺乏会引起骨髓巨红细胞成熟受损,引起巨红细胞贫血,白血球减少症,还会导致孕妇妊娠中毒、早产等。因此,测定食品和饮料中维生素含量具有十分重要的意义。
食品中多种维生素含量的检测方法已有一些报道,但多数是对基体较为简单,维生素种类少的食品进行检测。在液相色谱中,为了提高检测的灵敏度,也采用多种检测器并用。韩雅珊等同时检测四种维生素(VB1、VB2、VB5、VB6),在检测波长为254nm下测定VB1,VB2和VB5,而在荧光(EX295/EX395nm)条件下测定VB6。廖国东等人采用胶束液相色谱分离测定婴儿食品中的水溶性维生素,使用十二烷基磺酸钠的水溶液为流动相,加入三乙胺等有机改性剂,考察了6种水溶性维生素(VB1、VB2、VB6、VC、PP)的最佳分离条件, 与其他相关报道相比,该方法结果比较满意,但分析的维生素种类仍然较少。
高效液相色谱法由于能进行快速、灵敏准确的测定,并能与其他分析技术联用等优点,已经成为了目前最常用的分析手段,如中国专利申请201210584541.4中揭示的一种检测水溶性维生素的方法,虽然能同时测定维生素B1、B2、B3、B6四种维生素,但测试种类仍然较少。
发明内容
本发明的目的在于解决上述技术问题,提出一种同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法。
本发明的技术方案是:一种同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法,所述食品或保健品包括片剂、粉剂、胶囊、软胶囊、冲剂、口服液、饮品形式。
具体包括如下步骤:
步骤一、标准液的制备
按照以下参数进行各种维生素标准液的制备
组分 | 标准品重/g | 标准品浓度μg/ml |
VB1 | 0.0292 | 1168 |
VB2 | 0.0047 | 188 |
VB3 | 0.0289 | 2890 |
VB5 | 0.0425 | 1700 |
VC | 0.1780 | 7120 |
VB6 | 0.0343 | 1372 |
VB9 | 0.0156 | 624 |
VB12 | 0.0056 | 224 |
分别吸取0.6ml VB1,0.2ml VB2,0.2ml VB3,0.4ml VB5,0.4ml VB9, 0.1ml VB6,0.1ml VC,0.1ml VB12置于5ml离心管中,然后加入1.9ml0.85%H3PO4,配成混合标样。
步骤二、待测液的制备
取含有多种水溶性维生素的食品或保健品样品,在样品中加入提取溶剂,进行蜗旋、超声,再加入稀释溶剂,再超声离心,最后用稀释溶剂稀释后通过过滤膜进行过滤;其中,当所述食品或保健品为复合维生素片,所述步骤二中待测液的制备过程中,先将复合维生素片研磨成粉末,然后加入提取溶剂,继而再进行后续处理。
所述提取溶剂按以下步骤制备获得:称取硫氰酸铵置于离心管中,加入二甲基亚砜和冰醋酸,超声使其溶解;
所述稀释溶剂按以下步骤制备获得:称取硫酸钠置于离心管中,加入冰醋酸和去离子水,超声使其溶解;
步骤三、利用串联有紫外检测器和荧光检测器、柱温箱、二元梯度泵、自动进样器组成的高效液相色谱仪,以乙腈-磷酸溶液为流动相梯度洗脱分离各种维生素,对步骤一和步骤二制得的各混合标样和待测液当中的各种水溶性维生素的含量进行检测;
步骤四、根据步骤三的检测结果,依据多组混合标样的检测数据进行线性回归,得到VB1,VB2,VB3,VC,VB5,VB6,VB9,VB12的线性回归方程,进而依据这些线性回归方程以及待测液的检测数据,分析计算待测液中水溶性维生素VB1,VB2,VB3,VC,VB5,VB6,VB9,VB12含量,从而推知所测食品或保健品样品当中各种水溶性维生素的含量。
优选地,步骤三当中,色谱条件如下:
色谱柱:Phenomenex Luna C18,5.0μm,4.6mm×250mm内 径;
流动相:流动相A:0.1%H3PO4,流动相B:80%乙腈;
流速:0.8-1ml/min;
柱温:30℃;
进样量:20μl;
洗脱时间:0~5min,100%A;5~13min,线性下降至70%A;13~25min,保持在70%A。
优选地,波长经过优化,水溶性维生素的最优紫外吸收波长最终确定为:VB1260nm,VB3280nm,VC 230nm,VB5210nm,VB9210nm,VB12210nm,VB2210nm;VB6的荧光检测波长为Ex 290nm/Em 395nm。并且,所述滤膜为0.45μm滤膜。
本发明的有益效果是:本方法能一次性同时完成8种水溶性维生素的检测分析,能够有效改善多种维生素的分离效率,测定食品或保健品当中基质较为复杂的样品。由于现有的复合维生素片都是经过CFDA批准以保健食品的方式上市,该方法对于测定复合维生素片非常有效;同时,该方法也适用于对片剂、粉剂、胶囊、软胶囊、冲剂、口服液、饮品等各种形态的保健品和食品中多种水溶性维生素的检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述:
(1)实验仪器
Agilent 1100Seriese高效液相色谱仪(配G1312二元梯度泵,自动进样器,G1314A自紫外检测器,柱温箱等);色谱柱:Phenomenex Luna C18(2)(4.6*250mm;5.0μm);天平(HANGPING,Model FA2104N);超声清洗器(SHUMEI,Model KQ5200E);粉碎机 (XA-1A);离心机(Anke TDL-40B);1ml注射器;0.45μm滤膜;30~300μL,100~1000μL移液器。
(2)实验所需试剂和标准品
标准品:抗坏血酸(VC,纯度99.9%),盐酸硫胺素(VB1,纯度99.0%),核黄素(VB2,纯度99.0%),烟酰胺(VB3,纯度99.9%),D-泛酸半钙盐(VB5,纯度99.0%),吡哆胺(VB6,纯度99.9%),叶酸(VB9,纯度98.0%),氰钴维生素(VB12,纯度99.0%)。均购于Sigma公司。
试剂:甲醇(色谱纯,MERCK),氨水(分析纯,国药集团),H3PO4(分析纯,国药集团),硫氰酸铵(分析纯,国药集团),二甲基亚砜(分析纯,国药集团),硫酸钠(分析纯,国药集团),冰醋酸(分析纯,国药集团),超纯水由Milli-Q Gradient A 10TM制备。
样品:购买于美国市场代表性的复合维生素片(ONE A DAY,BAYER)。
以下具体以复合维生素为例,进行测定:
步骤一、标准样品溶液的制备
VB1的配制:准确称量0.0292g纯度为99%的盐酸硫胺素至25ml容量瓶中,加入适量0.85%H3PO4超声溶解,再用0.85%H3PO4定容至刻度。
VB3的配制:准确称量0.0289g纯度为99%的烟酰胺至10ml容量瓶中,加入适量0.85%H3PO4超声溶解,再用0.85%H3PO4定容至刻度。
VB6的配制:准确称量0.0343g纯度为99%的吡哆胺至25ml容量瓶中,加入适量0.85%H3PO4超声溶解,再用0.85%H3PO4定容至刻度。
VB5的配制:准确称量0.0425g纯度为99%的D-泛酸半钙盐至 25ml容量瓶中,加入适量0.85%H3PO4超声溶解,再用0.85%H3PO4定容至刻度。
VB12的配制:准确称量0.0056g纯度为99%的氰钴维生素至25ml容量瓶中,加入适量0.85%H3PO4超声溶解,再用0.85%H3PO4定容至刻度。
VC的配制:准确称量0.1780g纯度为99%的抗坏血酸至25ml容量瓶中,加入适量0.85%H3PO4超声溶解,再用0.85%H3PO4定容至刻度。
VB2的配制:准确称量0.0047g纯度为99%的核黄素至50ml离心管中,加入2.5mlH2O和0.5ml浓度为26%的氨水,用H3PO4调节PH=7,然后转移至25ml容量瓶中,用水加至刻度。
VB9的配制:准确称量0.0156g纯度为98%的叶酸至50ml离心管中,加入2.5ml H2O和0.5ml浓度为26%的氨水,用H3PO4调节PH=7,然后转移至25ml容量瓶中,用水加至刻度。
配制的具体要求如下表1所示:
表1:维生素标准品浓度
组分 | 标准品重/g | 标准品浓度μg/ml |
VB1 | 0.0292 | 1168 |
VB2 | 0.0047 | 188 |
VB3 | 0.0289 | 2890 |
VB5 | 0.0425 | 1700 |
VC | 0.1780 | 7120 |
VB6 | 0.0343 | 1372 |
VB9 | 0.0156 | 624 |
VB12 | 0.0056 | 224 |
分别吸取0.6ml VB1,0.2ml VB2,0.2ml VB3,0.4ml VB5,0.4ml VB9,0.1ml VB6,0.1ml VC,0.1ml VB12置于5ml离心管中,然后加入1.9ml0.85%H3PO4,配成混合标样。
步骤二、待测液的制备
取复合维生素片,放入研钵中研磨成粉末,再放入粉碎机中粉成粉末,称取2.6767g,先加10ml提取溶剂,蜗旋1min,超声10min后,再加入20ml稀释溶剂,再超声10min,离心5min;用稀释溶剂稀释50倍,过0.45μm滤膜。
所述提取溶剂的制备包括如下步骤:称取0.2500g硫氰酸铵置于50ml离心管中,加入48ml二甲基亚砜和2ml冰醋酸,超声使其溶解。
所述稀释溶剂包括如下步骤:称取0.3350g硫酸钠置于50ml离心管中,加入1ml冰醋酸和49ml去离子水,超声使其溶解。
步骤三、利用串联有紫外检测器和荧光检测器、柱温箱、二元梯度泵、自动进样器组成的高效液相色谱仪,以乙腈-磷酸溶液为流动相梯度洗脱分离各种维生素,色谱条件如下:
色谱柱:Phenomenex Luna C18,5.0μm,4.6mm×250mm内径;
流动相:流动相A:0.1%H3PO4,流动相B:80%乙腈;
流速:0.8-1ml/min;
柱温:30℃;
进样量:20μl;
洗脱时间:0~5min,100%A;5~13min,线性下降至70%A;13~25min,保持在70%A。
所述洗脱条件如表2所示:
表2:线性梯度洗脱条件
Time(min) | Mobile phase A(%) | Mobile phase B(%) |
0 | 100 | 0 |
5 | 100 | 0 |
13 | 70 | 30 |
25 | 70 | 30 |
波长经过优化,水溶性维生素的最优紫外吸收波长最终确定为VB1260nm,VB3280nm,VC 230nm,VB5210nm,VB9210nm,VB12210nm,VB2210nm;VB6的荧光检测波长为Ex290nm/Em 395nm。
步骤四、分别取制备获得的标准样品溶液及待测液,采用上述色谱条件进行进样检测,线性回归分析计算待测溶液中水溶性维生素VB1,VB2,VB3,VC,VB5,VB6,VB9,VB12含量。
(3)线性分析
将配制好的混合标样溶液用0.85%H3PO4四倍稀释成4个不同浓度,分别为std-1,std-4,std-16,std-64。按照上述色谱条件分析,以峰面积为纵坐标(Y),各维生素浓度为横坐标(X)进行线性回归分析,结果见表3。试验结果表明在各自的线性范围内,8种维生素具有良好的相关性(R2≧0.99)。
表3:线性回归分析方程
表4:维生素的测定含量和回收率
由表4可以看出,VB1、VB3、VC、VB6、VB5、VB9、VB12、VB2的直接测定结果与样品标签上注明的含量比较一致,差异主要在±5%左右。为了验证实验结果的准确性以及实验数据是否真实反映每种检测组分的真实含量,可以通过加标回收率实验来进行进一步的验证。实验数据表明:每种组分的加标回收率的范围为96.2%~106.7%,误差基本控制在±5%以内。由此说明,本发明同时检测8种水溶性维生素含量的方法可准确有效地检测待测样品中各种维生素组分的具体含量。
由于现有的复合维生素片都是经过CFDA批准以保健食品的方式上市的,所以,本发明的实施例是以复合维生素片作为检测对象。 本领域技术人员可以推知,本方法适用于对其它各种食品或保健品当中多种水溶性维生素的检测;同时,本方法对于食品或保健品的形态也不作限制,可以为各种片剂、粉剂、胶囊、软胶囊、冲剂、口服液、饮品等。
当然,本发明尚有多种实施方式,凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法,其特征在于:具体包括如下步骤:
步骤一、标准液的制备
分别配制水溶性维生素VB1,VB2,VB3,VC,VB5,VB6,VB9,VB12的标准样品溶液,进而按一定比例提取各标准样品溶液,然后定量加入已知浓度的H3PO4溶液,配制成多组混合标样;
步骤二、待测液的制备
取含有多种水溶性维生素的食品或保健品样品,在样品中加入提取溶剂,进行蜗旋、超声,再加入稀释溶剂,再超声离心,最后用稀释溶剂稀释后通过过滤膜进行过滤;其中,
所述提取溶剂按以下步骤制备获得:称取硫氰酸铵置于离心管中,加入二甲基亚砜和冰醋酸,超声使其溶解;
所述稀释溶剂按以下步骤制备获得:称取硫酸钠置于离心管中,加入冰醋酸和去离子水,超声使其溶解;
步骤三、利用串联有紫外检测器和荧光检测器、柱温箱、二元梯度泵、自动进样器组成的高效液相色谱仪,以乙腈-磷酸溶液为流动相梯度洗脱分离各种维生素,对步骤一和步骤二制得的各混合标样和待测液当中的各种水溶性维生素的含量进行检测;
步骤四、根据步骤三的检测结果,依据多组混合标样的检测数据进行线性回归,得到VB1,VB2,VB3,VC,VB5,VB6,VB9,VB12的线性回归方程,进而依据这些线性回归方程以及待测液的检测数据,分析计算待测液中水溶性维生素VB1,VB2,VB3,VC,VB5,VB6,VB9,VB12含量,从而推知所测食品或保健品样品当中各种水溶性维生素的含量。
步骤三当中,色谱条件如下:
色谱柱:Phenomenex Luna C18 ,5.0μm ,4.6 mm×25mm内径;
流动相:流动相A:0.1% H3PO4,流动相B:80% 乙腈;
流速:0.8-1 ml/min;
柱温:30℃;
进样量:20μl;
洗脱时间:0~5min,100%A;5~13min,线性下降至70% A;13~25min,保持在70%A。
2.如权利要求1所述的同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法,其特征在于:波长经过优化,水溶性维生素的最优紫外吸收波长最终确定为:VB1 260nm,VB3280nm,VC 230nm,VB5 210nm,VB9 210nm,VB12 210nm,VB2 210nm;VB6的荧光检测波长为Ex290nm/Em 395 nm。
3.如权利要求1所述的同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法,其特征在于:步骤二待测液的配制过程中,使用0.45μm的滤膜进行过滤。
4.如权利要求1所述的同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法,其特征在于:步骤一中样品标准液的配制按照以下参数进行制备,
然后,分别吸取0.6ml VB1标准液,0.2ml VB2标准液,0.2ml VB3标准液,0.4ml VB5标准液,0.4ml VB9标准液,0.1ml VB6标准液,0.1ml VC标准液,0.1ml VB12标准液置于5ml离心管中,加入1.9ml 0.85% H3PO4,配成混合标样,再将配制好的混合标样溶液用0.85% H3PO4四倍稀释成4个不同浓度的混合标样。
5.如权利要求1所述的同时测定食品或保健品当中多种水溶性维生素含量的方法,其特征在于:所述食品或保健品为复合维生素片,所述步骤二中待测液的制备过程中,先将复合维生素片研磨成粉末,然后加入提取溶剂,继而再进行后续处理。
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Simultaneous determination of water- and fat-soluble vitamins in pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection;Borivoj Klejdus et al;《Analytica Chimica Acta》;20040409;第520卷;57-67 * |
婴儿配方奶粉中8种水溶性维生素的高效液相色谱同时测定;刘娜 等;《分析测试学报》;20080430;第27卷(第4期);408-411 * |
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CN104730190A (zh) | 2015-06-24 |
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