CN111693615B - 同时测定烟酸、维生素b1、b6和泛酸的分析方法 - Google Patents

同时测定烟酸、维生素b1、b6和泛酸的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种同时高效测定复杂组分中烟酸、维生素B1、维生素B6和泛酸的液相色谱分析方法。该方法是以0.1M磷酸二氢钾、0.01M磷酸氢二钾混合溶液‑乙腈为流动相进行梯度洗脱，可避免其他组分的干扰，在28分钟内准确灵敏地检测出烟酸、维生素B1、维生素B6和泛酸的含量。该方法专属性强、精密度高、稳定性较好、准确度高，操作简单，试剂与耗材价廉易得。适用于含有烟酸、维生素B1、维生素B6和泛酸的片剂、粉末、胶囊等剂型的药品、食品。该四种成分的质量控制，可有效地节约检测成本和时间。

Description

同时测定烟酸、维生素B1、B6和泛酸的分析方法
技术领域
本发明运用一种高效快速同时测定复杂组分中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸含量的液相色谱分析方法。具体地，通过对样品前处理和色谱条件的优化，简单，方便且准确快速检测出复杂组分中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸的含量。本发明属于医药食品领域。
背景技术
烟酸(又称维生素B3)、维生素B1、维生素B6、泛酸(又称维生素B5)都是水溶性维生素，是人体组织必不可少的营养素，是参与人体体内代谢不可缺少的物质。缺乏维生素B1可引起多种神经炎症；缺乏烟酸可产生糙皮病；缺乏泛酸会导致生长不良，发生皮炎，肾脏损伤，贫血等；缺乏维生素B6会导致营养代谢病。
烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸是人体必需维生素，因此如果能有一种简单，方便且准确快速检测出复杂组分中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸的含量的方法，对于上述维生素的研究会更有优势，但是现实中我们发现：(1)烟酸、维生素B1、泛酸、维生素B6的最大紫外吸收波长不一样，存在样品中某个成分可能无法被灵敏地检测出来其含量；(2)烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸在进行液相色谱梯度洗脱时，四个主成分峰会存在重叠，无法完全分离的问题；(3)多种维生素矿物质片在样本处理过程中成分之间可能会发生相互反应而使烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸某一成分降解，导致检测含量偏低。
发明内容
为克服上述问题，本发明提供一种提取率高、稳定性好、准确度高、重复性好的专属烟酸、维生素B1、维生素B6和泛酸同时检测的高效液相色谱方法，所述方法包括以下步骤：
一种同时测定片剂复杂组分中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸含量的高效液相色谱分析方法，其特征在于：供试品的提取溶剂为低浓度酸性溶剂，提取方法为超声提取；流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的混合比例为100～70:0～30，梯度洗脱；紫外检测波长设定为200nm～210nm。
在本发明中，所述用于供试品提取溶剂为选自草酸、醋酸或盐酸中的一种，优选盐酸。在本发明中，盐酸的浓度为0.005～0.02mol/L，优选0.008-0.015mol/L，更加优选0.01mol/L。
在本发明中，作为流动相A的磷酸盐缓释液为0.1M磷酸二氢钾和0.01M磷酸氢二钾的混合溶液。混合溶液的pH为3.0～5.0，优选3.0～4.0，更优选4.0。
在本发明中，进样盘温度为10～20℃，优选温度为10℃。
在一个实施方案中，进行上述色谱分析的色谱仪器及条件为：
检测仪器：高效液相色谱仪(Thermo Fisher，U3000)，配备紫外检测器；
色谱条件：色谱柱：Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18150mmX4.6mm，5μm；检测波长：200～210nm；流速：0.8～1.5ml/min；柱温：25～30℃，最佳柱温：30℃；运行时间：28min。流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈；洗脱方式：梯度洗脱，如表1；
表1洗脱梯度
时间(min) A(％)(磷酸盐缓冲液) B(％)(乙腈)
0.00 99.5 0.5
6.00 99.5 0.5
6.01 96 4
16.00 96 4
16.01 75 25
24.00 75 25
24.01 99.5 0.5
28.00 99.5 0.5
本发明中，采用高效液相色谱对多种维生素矿物质片溶液中的烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸进行定量检测，需要对该方法进行专属性、准确度等多方面的确认，具体为：
专属性：配制多种维生素矿物质片溶液和不含烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸的空白辅料溶液，分别进样，结果显示空白溶剂、空白辅料对供试品溶液的主峰出峰无干扰，且能与相邻峰有效地分离，说明本发明提供的方法能够准确测定多种维生素矿物质片功效成分烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸的含量。
准确度：采用本发明的高效液相色谱方法对多种维生素矿物质片溶液中的烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸进行检测，结果显示四个主成分回收率在合格标准范围内，准确度良好。
线性：采用本发明的高效液相色谱方法对多种维生素矿物质片中的烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸对照品溶液进行检测，在线性范围10％～160％内，结果显示其四个主成分线性相关系数不小于0.998，表明检测结果与烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸的浓度具有良好的线性关系。
本发明中，采用高效液相色谱对不同规格样品配制成的样品溶液中的烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸进行定量检测，实施例会说明。
本发明中，采用高效液相色谱对不同片剂样品配制成的样品溶液中的烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸进行定量检测，实施例会说明。
本发明中，采用高效液相色谱对胶囊样品配制成的样品溶液中的烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸进行定量检测，实施例会说明。
本发明中，高效液相色谱会采用不同的吸收波长对烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸进行定量检测，实施例会说明。
附图说明
图1示供试品溶液的HPLC检测的色谱图；
图2、3、4示实施例1的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
图5示实施例2的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
图6示实施例3的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
图7、8示实施例4的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
具体实施方式
下面通过实施例对发明作进一步详细的说明，分别以片剂、片剂不同规格、胶囊、不同的吸收波长为例。
试剂：：乙腈(SINENCE，批号180/A0683)，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾(天津市大茂化学试剂厂，AR)，磷酸(天津市富宇精细化工有限公司，AR)，盐酸(泸试，AR)，烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸对照品(中国食品药品检定研究院)，样品(深圳奥萨医药有限公司提供)
实施例1：
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的A1111-A2131-A3333号牌多种维生素矿物质片(含有维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、烟酸、泛酸、维生素B6、生物素、维生素C、维生素D、叶酸、维生素B12、铁、锌、硒、镁、铜、钙、铬、钾等20种成分)样品中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸含量的测定。实施例1的具体步骤如下：
第一步：提取溶剂，量取盐酸，缓缓稀释到装有超纯水的瓶里，摇匀，即得0.01mol/L盐酸溶液。
第二步：对照品溶液的配制，精密称取烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸对照品，于一定规格容量瓶，加入提取溶剂适量，超声使溶解，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液；稀释到需要浓度的对照品溶液，即可。
第三步：样品溶液配制，取本品20片，研细，精密称取适量，置于一定规格量瓶中，加入提取溶剂适量，超声使溶解，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。经0.2～0.45μm滤膜过滤。A1111-A2131-A3333牌号多种维生素矿物质片各配制两份。
第四步：液相色谱条件的具体内容如下：
色谱柱：Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18150mmX4.6mm，5μm
流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈(梯度洗脱如表1)
检测波长：210nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样体积：10ul
运行时间：28min
检测色谱图如2、3、4图，检测结果如表2、3、4、5
表2检测结果
Figure BDA0002223457330000041
表3检测结果
Figure BDA0002223457330000051
表4检测结果
Figure BDA0002223457330000052
表5检测结果
Figure BDA0002223457330000053
实施例2：
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的B0003号牌多种维生素矿物质片样品中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸含量的测定。具体步骤同实施例1。
第一步：提取溶剂，量取盐酸，缓缓稀释到装有超纯水的瓶里，摇匀，即得0.01mol/L盐酸溶液。
第二步：对照品溶液的配制，精密称取烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸对照品，于一定规格容量瓶，加入提取溶剂适量，超声使溶解，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液；稀释到需要浓度的对照品溶液，即可。
第三步：样品溶液配制，取本品20片，研细，精密称取适量，置于一定规格量瓶中，加入提取溶剂适量，超声使溶解，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。经0.2～0.45μm滤膜过滤。B0003牌号多种维生素矿物质片配制两份。
第四步：液相色谱条件的具体内容如下：
色谱柱：Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18150mmX4.6mm，5μm
流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈(梯度洗脱如表1)
检测波长：210nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样体积：10ul
运行时间：28min
样品检测色谱图如图5，检测结果如表6。
表6检测结果
Figure BDA0002223457330000061
实施例3：
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的多种维生素胶囊样品中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸含量的测定。具体步骤同实施例1。
第一步：提取溶剂，量取盐酸，缓缓稀释到装有超纯水的瓶里，摇匀，即得0.01mol/L盐酸溶液。
第二步：对照品溶液的配制，精密称取烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸对照品，于一定规格容量瓶，加入提取溶剂适量，超声使溶解，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液；稀释到需要浓度的对照品溶液，即可。
第三步：样品溶液配制，本品胶囊20粒，除去胶囊壳倒出内容物，精密称取内容物适量，置于一定规格量瓶中，加入提取溶剂适量，超声使溶解，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。经0.2～0.45μm滤膜过滤。
第四步：液相色谱条件的具体内容如下：
色谱柱：Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18150mmX4.6mm，5μm
流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈(梯度洗脱如表1)
检测波长：210nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样体积：10ul
运行时间：28min
样品检测色谱图如图6，检测结果如表7。
表7检测结果
Figure BDA0002223457330000071
实施例1～3显示，本发明对含有多种维生素矿物质片、部分维生素B族片、多种维生素矿物质片胶囊样品进行检测0.01mol/L盐酸溶液作为提取溶剂，可以使得多维矿物质片溶液中的烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸保持稳定且不易分解；该高效液相分析方法可以使得烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸这四个成分完全分离，且在不同规格的样品条件下，四个成分都可以准确灵敏地被检测出来，符合样品检测要求。
实施例4：
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的A1111号牌多种维生素矿物质片样品中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸含量的测定-吸收波长的选择。
吸收波长：210nm/220nm；
其他具体步骤同第一实施例。样品检测色谱图如图7、8。
色谱条件中分别采用210nm和220nm的波长来检测烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸的含量，结果显示，在220nm的波长下，样品溶液浓度相同且样品溶液进样量大一倍的条件下，紫外检测这四种成分的灵敏度仍远远不及210nm的波长；尤其泛酸在210nm波长下，灵敏度显著提高。因此，决定选择210nm的波长来检测烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸的含量。
以上所述的具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案以及有益效果作了一系列的详细说明。但该说明仅仅是针对本发明的具体实施例而已，凡没有脱离本发明技术基础、原则和精神而作的等效实施例或变更，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种采用单波长同时高效测定片剂复杂组分中烟酸、维生素B1、维生素B6、泛酸含量的高效液相色谱分析方法，其特征在于，供试品为多种维生素矿物质片，供试品的提取溶剂为低浓度酸性溶剂，提取方法为超声提取；色谱柱为Agilent-ZORBAX Eclipse PlusC18150mmX4.6mm，5μm；流动相A为磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓释液为0.1M磷酸二氢钾和0.01M磷酸氢二钾的混合溶液，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B梯度洗脱如下：
时间(min) A(％)(磷酸盐缓冲液) B(％)(乙腈) 0.00 99.5 0.5 6.00 99.5 0.5 6.01 96 4 16.00 96 4 16.01 75 25 24.00 75 25 24.01 99.5 0.5 28.00 99.5 0.5
紫外检测波长设定为200nm～210nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于供试品提取的 溶剂为草酸、醋酸或盐酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为0.005～0.02mol/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为0.008-0.015mol/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为0.01mol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合溶液的pH为3.0～5.0。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述混合溶液的pH为3.0～4.0。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合溶液的pH为4.0。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进样盘温度为10～20℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，进样盘温度为10℃。
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