CN104678031A - 高效液相色谱法检测苍术苷和/或羧基苍术苷的方法 - Google Patents

Abstract

高效液相色谱法检测苍术苷和/或羧基苍术苷的方法，以苍术苷和/或羧基苍术苷溶液为对照品，在以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相和含磷酸盐水溶液的流动相为色谱条件下检测，其中的流动相是体积比为(75-50):(25-50)的磷酸盐水溶液-乙腈或磷酸盐水溶液-甲醇，检测波长为200±10nm，所述的磷酸盐水溶液为含有0.03-0.5%四丁基氢氧化铵和pH值为2.5-5.0的水溶液。该方法分离效果更佳，简便快捷，重复性好，为含苍术苷和/或羧基苍术苷的苍耳子及其中成药的质量控制提供了高效的检测方法。

Description

高效液相色谱法检测苍术苷和/或羧基苍术苷的方法

技术领域

本发明涉及一种以高效液相色谱法检测苍术苷和/或羧基苍术苷含量的方法。

背景技术

现代化学和毒理研究表明，苍术苷(ATR，atractyloside)和羧基苍术苷(CAT，carboxyatractyloside)及其衍生物为有毒中药苍耳子的毒性物质基础，ATR引起不良反应的重要机制之一是其对线粒体膜外氧化磷酸化的抑制作用，从而导致呼吸抑制、低氧血症、组织缺氧（耗氧降低），恶心、呕吐、抽搐、昏迷甚至死亡。CAT的毒性机制与ATR相似，它抑制细胞质中ADP/ATP的转运，从而阻止氧化磷酸化过程，进而引起各种不良反应，这与苍耳子中毒表现一致，因此被认为是苍耳子的主要毒性成分。故建立苍耳子及其中成药中羧基苍术苷和/或苍术苷的含量测定方法尤为重要。

目前已有报道的对羧基苍术苷、苍术苷的含量测定方法，有HPLC - UV法、GC - MS法、LC - MS法和HPLC - ELSD法等。其中GC-MS、LC-MS、HPLC-ELSD对设备条件要求较高，仪器价格昂贵、运行成本高，方法普适性较差，作为中药质量检测包括药典方法和生产企业等均较少应用；HPLC-UV则是目前包括中国药典、生产企业、检测单位等最常用的方法，该方法设备通用性和普适性均较好。例如，朵睿等人在“HPLC测定苍耳子中羧基苍术苷和苍术苷的含量”（中国中药杂志，2012,37(15)）中报道了以优选pH值5.6-6.4的乙腈-磷酸二氢钠为流动相和检测波长203nm，对羧基苍术苷和苍术苷含量检测的研究；刘玉红等人在“RP-HPLC法测定苍耳子中苍术苷”（中成药，2012,34(11)）中报道了在以pH值 6.0、体积比为20:80的乙腈-磷酸二氢钠为流动相和检测波长203nm条件下，对苍术苷含量检测的研究；韩燕全等人在“UPLC指纹图谱技术结合毒性成分含量优选苍耳子的炮制工艺”（中国中药杂志，2014,39(7)）中报道了在以pH值 6.0、体积比35:65的甲醇-磷酸二氢钠为流动相和检测波长203nm条件下，对羧基苍术苷和苍术苷含量检测的研究；安靖等人在“苍耳子炮制前后羧基苍术苷和苍术苷的含量比较”中报道了以pH值 6.2的乙腈-磷酸二氢钠为流动相和检测波长200nm条件下，对羧基苍术苷和苍术苷含量检测的研究等。

申请人在对HPLC-UV法测定苍耳子中羧基苍术苷和苍术苷含量的研究中发现，羧基苍术苷和苍术苷水溶性强，并且紫外仅为末端弱吸收，在检测波长约200nm条件下，苍耳子中大量的紫外强吸收的酚酸类成分给HPLC-UV法测定苍术苷类成分的含量带来了很大的干扰，部分苍耳子样品没有完全达到基线分离，影响了测结果的准确性。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的是提供一种可以取得更为理想效果的高效液相色谱法检测苍术苷和/或羧基苍术苷的新方法。

本申请发明人通过深入的实验和研究发现，苍术苷类成分含有磺酸基团的结构特征，选择四丁基铵阳离子作为反离子，采用反相离子对色谱法能够有效消除酚酸类成分的干扰，实现苍术苷类成分的基线分离。基于此，在检测过程中的色谱条件中，除流动相需选用离子对缓冲液外，包括如固定相、检测波长、对照品和供试品溶液等条件在内的其余条件和操作，均可采用目前已有文献报道的同类检测方法一致。即：本发明高效液相色谱法检测苍术苷和/或羧基苍术苷的方法，是以苍术苷和/或羧基苍术苷溶液为对照品，在以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相和含磷酸盐水溶液为流动相的色谱条件下，对含苍术苷和/或羧基苍术苷的被检品溶液中苍术苷和/或羧基苍术苷的含量进行检测，其中的流动相是体积比为(75-50):(25-50)的磷酸盐水溶液-乙腈或磷酸盐水溶液-甲醇，检测波长为200±10nm，所述的磷酸盐水溶液的pH值为2.5-5.0，且含有体积浓度为0.03-0.5%的四丁基氢氧化铵。其中，所述的磷酸盐水溶液可以选择包括磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵在内的多种形式磷酸盐的水溶液；磷酸盐的质量/体积浓度优选为0.1-0.5%。

本发明上述方法中，更好形式的流动相，是体积比为39:61的乙腈-磷酸二氢钠溶液，其中磷酸二氢钠溶液的pH值为3.5，质量/体积浓度为0.15%，且其中还含有体积浓度为0.12%的四丁基氢氧化铵。

本发明上述方法中更优选的检测波长为200±5nm。

试验显示，本发明上述方法中，检测的色谱柱理论板数优选为按苍术苷或羧基苍术苷峰计不低于3000，进样量为5-20μL，更好的进样量为10-20μL。

一般情况下，本发明上述方法中检测用的所述样品溶液可分别由下述方式制备得到：

——取苍术苷和/或羧基苍术苷对照品，精密称定后，用甲醇体积含量为0-50%的甲醇-水溶液配制成对照品溶液；

——取含苍术苷和/或羧基苍术苷的被检品精密称定后，加水用超声提取20-60分钟，取上清液滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

例如，所述对照品溶液的一种典型制备方式为，将羧基苍术苷对照品约15mg和/或苍术苷对照品约10mg精密称定后，分别置于10mL量瓶中，用体积含量20%的甲醇-水溶液溶解并稀释至刻度，混合均匀后再各精密吸取1mL置同一10mL量瓶中加水稀释至刻度，混合均匀即得。

所述的供试品溶液的一种典型制备方式为，将精密称定的苍耳子粉末，特别优选的是过3号筛的苍耳子粉末约1.0g，置具塞锥形瓶中精密加入水20mL后，超声提取，优选为300W和40kHz的超声处理40min后取出，离心分离后取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

根据本发明上述的检测方法，一种优选的检测方法可按下述方式进行：

1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为体积比为39：61的乙腈-质量/体积浓度为0.15%的磷酸二氢钠溶液，其中，磷酸二氢钠溶液中还含有体积浓度为0.12%的四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值至3.5；检测波长为200±5nm；理论板数按苍术苷或羧基苍术苷峰计不低于3000；

2）对照品溶液的制备：取羧基苍术苷对照品约15 mg和/或苍术苷对照品约10 mg，精密称定后分别置于10 mL量瓶中，用体积含量20%的甲醇-水溶液溶解并稀释至刻度，混合均匀，再各精密吸取1 mL于同一10 mL量瓶中加水稀释至刻度，混合均匀即得；

3）供试品溶液的制备：取过3号筛的苍耳子粉末约1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中精密加入水20 mL，经300W和40 kHz超声处理40min后，于12000 r·min^-1离心分离，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；

4）测定：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10-20ul，注入液相色谱仪测定。

实验显示，本发明上述检测苍术苷和/或羧基苍术苷含量的方法，采用反相离子对高效液相色谱法，分析时间短（≤20min），简便快速，且能使各样品均达到基线分离，符合药典定量分析的技术要求，特别是供试品中羧基苍术苷色谱峰的UV光谱与对照品一致，表明不含其它杂质成分干扰，专属性强，且基线平稳，分离效果更佳，简便快捷，重复性好，为含苍术苷和/或羧基苍术苷的苍耳子及其中成药的质量控制提供了高效的检测方法。

以下结合附图所示的实施例，对本发明上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

附图说明

图1是本发明方法检测的对照品及部分样品的HPLC色谱图。图中的1峰为羧基苍术苷，2峰为苍术苷。各图中附带的小图分别为保留时间约11.5的羧基苍术苷（1峰）的UV光谱图。其中，图1-1为对照品色谱图，其余1-2～1-8分别为与表1中对应“样品号”的色谱图。

图2是对比文献（朵睿等，HPLC测定苍耳子中羧基苍术苷和苍术苷的含量，中国中药杂志，2012,37(15)）测定方法检测的对照品及部分样品的HPLC色谱图。图中的1峰为羧基苍术苷，2峰为苍术苷。各图中附带的小图分别为保留时间约6.5的羧基苍术苷（1峰）的UV光谱图。其中，图2-1为对照品色谱图，其余2-2～2-8分别为与表1中对应“样品号”的色谱图。

具体实施方式

    实施例1

苍耳子药材中羧基苍术苷和苍术苷的含量测定：照中国药典高效液相色谱法测定。

1）色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：Agilent Eclipse XDB - C₁₈（250mm×4.6mm，5.0μm）；流动相：乙腈- 0.15(g/mL)%磷酸二氢钠溶液（其中还含有0.12(v)%四丁基氢氧化铵，磷酸调pH至3.5）（39：61）；检测波长：203 nm；理论板数按苍术苷或羧基苍术苷峰计应不低于3000。

2）对照品溶液的制备：精密称取羧基苍术苷对照品14.96mg和/或苍术苷对照品10.08mg，分别置于10mL量瓶中，加20%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再各精密吸取1mL置于同一10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制得每1mL含羧基苍术苷和/或苍术苷分别为0.1496 mg、0.1008 mg的对照品溶液。

3）供试品溶液的制备：取苍耳子粉末（过3号筛）约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声（300W，40kHz）处理40min，取出，离心（12000 r·min^-1，6min），取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

4）测定法：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例2

苍耳子提取物中苍术苷的含量测定：照中国药典高效液相色谱法测定。

1）色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：Supelco Discover - C₁₈（150mm×4.6mm，5.0μm）；流动相：乙腈- 0.1(g/mL)%磷酸二氢铵溶液（含0.03(v)%四丁基氢氧化铵，磷酸调pH至5.0）（25：75）；检测波长：190nm；理论板数按苍术苷峰计应不低于3000。

2）对照品溶液的制备：取苍术苷对照品适量，精密称定，加20%甲醇溶解并稀释成每1mL中含苍术苷0.15mg的溶液，摇匀，即得。

3）供试品溶液的制备：取苍耳子提取物约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，超声（300W，40kHz）处理20min，滤过，取续滤液，即得。

4）测定法：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例3

苍耳子配方颗粒中苍术苷的含量测定：照中国药典高效液相色谱法测定。

1）色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：Phenomenex - C₁₈（250mm×4.6mm，5.0μm）；流动相：乙腈-0.5(g/mL)%磷酸二氢钾溶液（含0.5(v)%四丁基氢氧化铵，磷酸调pH至2.5）（50：50）；检测波长：210nm；理论板数按苍术苷峰计应不低于3000。

2）对照品溶液的制备：取苍术苷对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3）供试品溶液的制备：取苍耳子配方颗粒（过3号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50mL，超声（300W，40kHz）处理60min，滤过，取续滤液，即得。

4）测定法：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例4

复方苍耳子胶囊中苍术苷的含量测定：照中国药典高效液相色谱法测定。

1）色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C₁₈（250mm×4.6mm，5.0μm）；流动相：甲醇- 0.20(g/mL)%磷酸二氢钠溶液（含0.24(v)%四丁基氢氧化铵，磷酸调pH至3.0）（48：52）；检测波长：200nm；理论板数按苍术苷峰计应不低于3000。

2）对照品溶液的制备：取苍术苷对照品约10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加20%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1mL置于10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

3）供试品溶液的制备：取复方苍耳子胶囊内容物（过3号筛）约0.3g，置于10mL量瓶中，精密称定，精密加入水10mL，超声（300W，40kHz）处理30min，取出，滤过，取续滤液，即得。

4）测定法：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

以下的相关试验结果进一步证明了本发明方法所具有的显著效果。

采用本发明的含量检测方法与对比文献（朵睿等，HPLC测定苍耳子中羧基苍术苷和苍术苷的含量，中国中药杂志，2012,37(15)）的检测方法，对不同来源苍耳子中羧基苍术苷和苍术苷的含量测定结果对比如下:

一、本发明实施例１的测定方法：

1．色谱条件  色谱柱：Agilent Eclipse XDB - C₁₈（250mm×4.6mm，5.0μm）；流动相：乙腈-0.15%磷酸二氢钠溶液（含0.12%四丁基氢氧化铵，磷酸调pH至3.5）（39：61），等度洗脱，流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：203nm；进样量：10μL。在此色谱条件下，所测成分20min内出峰完毕，分离度、峰形均良好，符合定量分析要求，色谱图见图1。

溶液的制备

2.1对照品溶液的制备  精密称取羧基苍术苷、苍术苷对照品适量，分别置于10mL量瓶中，加20%甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度分别为1.496mg·mL^-1、1.008mg·mL^-1的对照品储备液，再各精密吸取1mL置于同一10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制得每1mL含羧基苍术苷、苍术苷分别为0.1496mg、0.1008mg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备  精密称取苍耳子粉末（过3号筛）约1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声（300W，40kHz）处理40min，取出，离心（12000r·min^-1，6min），取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3.线性关系考察  精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标，实际进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得到羧基苍术苷回归方程为y = 387.67x - 2.8968，r = 0.9999，线性范围为0.15~3.7μg；苍术苷的回归方程为y = 454.14x - 2.0492，r = 1，线性范围为0.10 ~ 2.5μg。结果表明：两成分在各自进样量范围内线性关系良好。

4.检测限与定量限  将“2.1”项下混合对照品溶液，用水逐级稀释，进样测定，按3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10）信噪比测得羧基苍术苷和苍术苷的检测限分别为4.7 ng和6.2ng，定量限分别为15.8ng和21.1ng。

5. 精密度实验  取“2.1”项下混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算羧基苍术苷、苍术苷峰面积的RSD分别为0.26%、0.15%。表明仪器精密度良好。

6. 稳定性实验  精密吸取同一供试品溶液，于室温0、2、4、6、12、24 h进样测定，羧基苍术苷峰面积的RSD为0.39%；苍术苷峰面积的RSD为0.53%。表明供试品溶液在24h内稳定。

7. 重复性试验  取同一批次苍耳子粉末约1.0g，共6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件进行分析，羧基苍术苷、苍术苷的平均含量分别为1.694 mg·g^-1、1.128 mg·g^-1；RSD分别为1.4%、1.9%。说明该方法的重复性良好。

8. 回收率实验  取“重复性试验”项下已知含量的苍耳子样品约0.5 g，共6份，精密称定，准确加入“2.1”项下两种对照品储备液各0.5 mL，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件进样分析，测定含量，计算回收率。结果羧基苍术苷、苍术苷平均回收率分别为101.4%、101.6%；RSD分别为1.7%、1.2%。

9. 耐用性的考察  比较了Agilent Eclipse XDB（250mm×4.6mm，5.0μm）、Phenomenex（250mm×4.6mm，5.0μm）、Supelco Discover（150mm×4.6mm，5.0μm）3种不同品牌的C₁₈色谱柱对羧基苍术苷、苍术苷的分离效果，结果显示均能实现基线分离，说明该方法耐用性较好。

10.样品测定  将不同来源的22批苍耳子按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，结果见表1。

二、对比文献含量测定方法:

1. 色谱条件  色谱柱为Agilent ZORBAX SB-phenyl（4.6mm×250mm，5μm）柱；流动相为乙腈-0.01mol·L^-1磷酸二氢钠溶液（pH=6），梯度洗脱（表2）；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：203nm；柱温：35℃。对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图2。

2. 对照品溶液和供试品溶液的制备  分别同上述“2.1”、“2.2”项下方法。

3.色谱柱筛选  比较了C₁₈柱Phenomenex LUNA C₁₈( 2 )（4.6 mm×250mm，5μm），Agilent Eplise XDB-C₁₈柱（4.6mm×250mm，5μm），亲水性C₁₈柱Phenomenex Gemini C₁₈ 110A（4.6mm×250mm，5μm），苯基柱Agilent ZORBAX SB-phenyl（4.6mm×250mm，5μm）的分离效果，结果以苯基柱分离效果最佳，峰形为对称，而C₁₈柱分离效果和峰形对称性欠佳。

由图1和图2的对比可见，基于两种均为经过优化后的检测方法，本发明的高效液相色谱法测定苍耳子中羧基苍术苷和苍术苷含量的方法（图1），与对比文献报道的方法（图2）相比的显著特点是：

1）本发明方法的各样品均达到基线分离，供试品中羧基苍术苷和苍术苷与相应对照品的UV光谱完全相同，表明没有其它杂质成分干扰，符合药典定量分析的要求；对比文献方法的部分样品未达到基线分离，分离效果差，特别是部分样品中羧基苍术苷与相应对照品的光谱不同，表明色谱峰不纯，含有其它杂质成分干扰，且苍术苷附近的干扰峰也较多，未完全达到基线分离；

2）本发明方法为等度洗脱，分析时间短（≤20min），使用方便，简便快速；对比文献方法为梯度洗脱，分析时间长（＞20min），对仪器设备和实验技能要求较高。因此等度洗脱通常优于梯度洗脱，应首选等度洗脱。

本发明上述方法通过采用离子对色谱法，使苍耳子中紫外强吸收的酚酸类成分都集中在10min内流出，而苍术苷类成分则在10 min以后出峰，从而有效消除了酚酸类成分的干扰，实现基线分离，专属性强，且基线平稳，简便快捷，重现性好，为羧基苍术苷和/或苍术苷的含量测定提供更好的技术方法。

Claims (10)

1.高效液相色谱法检测苍术苷和/或羧基苍术苷的方法，以苍术苷和/或羧基苍术苷溶液为对照品，在以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相和含磷酸盐水溶液为流动相的色谱条件下，对含苍术苷和/或羧基苍术苷的被检品溶液中苍术苷和/或羧基苍术苷的含量进行检测，其特征是流动相是体积比为(75-50):(25-50)的磷酸盐水溶液-乙腈或磷酸盐水溶液-甲醇，检测波长为200±10nm，所述的磷酸盐水溶液的pH值为2.5-5.0，且含有体积浓度0.03-0.5%的四丁基氢氧化铵。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵的水溶液，磷酸盐的质量/体积浓度为0.1-0.5%。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的流动相为体积比为39:61的乙腈-磷酸二氢钠溶液，其中磷酸二氢钠溶液的pH值为3.5，质量/体积浓度为0.15%，且其中还含有体积浓度为0.12%的四丁基氢氧化铵。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的检测波长为200±5nm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是色谱柱的理论板数按苍术苷或羧基苍术苷峰计不低于3000，进样量为5-20μL。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是所述进样量为10-20μL。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是检测用的样品溶液分别经下述方式得到：

——取苍术苷和/或羧基苍术苷对照品，精密称定后，用甲醇体积含量为0-50%的甲醇-水溶液配制成对照品溶液；

——取含苍术苷和/或羧基苍术苷的被检品精密称定后，加水超声提取20-60分钟，取上清液滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征是所述的对照品溶液由羧基苍术苷对照品约15 mg和/或苍术苷对照品约10 mg精密称定后，分别置于10 mL量瓶中，用体积含量20%甲醇-水溶液溶解并稀释至刻度，混合均匀后再各精密吸取1 mL置同一10 mL量瓶中加水稀释至刻度，混合均匀即得。

9.如权利要求7所述的方法，其特征是所述的供试品溶液由精密称定的苍耳子粉末，优选为过3号筛的苍耳子粉末约1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入水20 mL后，超声提取，优选为300 W和40 kHz的超声处理40min后取出，离心分离后取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

10.如权利要求1至9之一所述的方法，其特征是按下述方式进行：

1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为体积比为39：61的乙腈-质量/体积浓度0.15%的磷酸二氢钠溶液，其中，磷酸二氢钠溶液中还含有体积浓度为0.12%的四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值至3.5；检测波长为200±5nm；理论板数按苍术苷或羧基苍术苷峰计不低于3000；

2）对照品溶液的制备：取羧基苍术苷对照品约15 mg和/或苍术苷对照品约10 mg，精密称定后分别置于10 mL量瓶中，用体积含量20%的甲醇-水溶液溶解并稀释至刻度，混合均匀，再各精密吸取1 mL于同一10 mL量瓶中加水稀释至刻度，混合均匀即得；

3）供试品溶液的制备：取过3号筛的苍耳子粉末约1.0g精密称定，置具塞锥形瓶中精密加入水20 mL，经300W和40 kHz超声处理40min后，于12000 r·min^-1离心分离，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；

4）测定：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10-20ul，注入液相色谱仪测定。