CN114152686A - 一种包含肉桂的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含肉桂的中药复方的检测方法，该检测方法包括如下步骤：取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方由当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝组成，该对照品为没食子酸、芍药苷、β‑蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，该检测的色谱条件为：采用填料为苯基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液或缓冲盐水溶液，根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。本发明对包含肉桂的中药复方的化学成分进行了全面系统地解析，为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。

Description

一种包含肉桂的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用
技术领域
本申请涉及中药质量鉴定技术领域，特别是涉及一种包含肉桂的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用。
背景技术
随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。中药(包括单味中药和中药复方)指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。
与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整理物质的有效控制，是目前中药标准汤剂及其制剂质量控制的有效手段之一。中药指纹图谱的检测方法有色谱法、光谱法、波谱法等。色谱法主要包括薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳、液质联用等，其中高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏、重现性好的特点，与紫外检测器(UV)、二极管阵列检测器(DAD)、蒸发光散射检测器(ELSD)和质谱检测器(MS)等对种检测器联用，可用于中药中对多种复杂成分的分析检测。
本发明所要求保护的包含肉桂的中药复方由当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝组成。其中川芎的化学成分主要含有挥发油、生物碱、酚性物质、有机酸、苯酞内酯、多糖类及其他等成分，具有解热、镇痛镇静、改善血流变、保护神经细胞、抗炎、降压等多种药效作用，可参与调节多种细胞内外信号通路；当归中分离、鉴定到的化合物主要包括挥发油、有机酸、多糖、氨基酸和黄酮等成分；白芍中主要含有化学成分主要为单萜及其苷类、三萜类、黄酮及其苷类、鞣质化合物类、多糖类、挥发油等；肉桂含有多种化学成分，主要包括挥发油、黄酮类、黄烷醇及其多聚体、萜类、木脂素类、酚酸类、香豆素类、皂苷类、多糖类等成分，此外还含无机元素以及其他化合物；牡丹皮中分离到的成分较多，但主要成分为酚及酚苷类、单萜及其苷类，其他还有三萜、甾醇及其苷类、黄酮、有机酸、香豆素、酚及酚苷类等；莪术中含有两大类成分，即挥发油(1％～2.5％)和姜黄素类；人参主要成分为皂苷类、糖类还有挥发性成分、有机酸及其酯、甾醇及其苷、黄酮类、木质素、无机元素及维生素类等；甘草的主要成分为三萜皂苷类(主要是甘草酸)、黄酮类、香豆素类、生物碱类、多糖类和氨基酸等，三萜皂苷和黄酮类是其主要活性成分；牛膝中的主要化学成分有皂苷类、甾酮类、糖类，也有氨基酸、生物碱及香豆素类，并含有钾盐等多种微量金属元素。
目前，尚未见文献报道对上述复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种包含肉桂的中药复方成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法测得的图谱能较全面的反映上述中药复方中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，获得的指纹图谱能够客观评估样品的质量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供了一种包含肉桂的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方由当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝组成，该对照品为没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，
该检测的色谱条件为：采用填料为苯基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％～10％A；12～30min，10％～17％A；30～41min，17％～19％A；41～66min，19％～32％A；66～85min，32％～40％A；85～95min，40％～75％A，流速为0.4～1.2mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～400nm；
根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。
进一步地，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re。
进一步地，以所测定的中药复方干品计，没食子酸含量不小于0.13％、芍药苷含量不小于0.37％、阿魏酸含量不小于0.033％、甘草酸铵含量不小于0.11％。
进一步地，该中药复方供试品溶液的制备方法包括：在该中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及该中药复方溶液经过振摇提取、超声提取和/或回流提取后，摇匀，过滤得到该中药复方供试品溶液。
进一步地，该中药复方溶液通过以下方法获得：称取0.05g～2.5g的该中药复方，以及添加10～300mL的体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液。
进一步地，该中药复方供试品溶液通过以下方法获得：室温振摇提取20分钟～60分钟，并用体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤。
进一步地，该中药复方供试品溶液通过以下方法获得：超声提取20～60分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤。
进一步地，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为2～125μg/ml的该对照品溶液。
进一步地，该流速为0.6～1.0mL/min，该柱温为20～30℃，该检测波长为200～260nm。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的峰纯度大于995。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于2000。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0。
进一步地，该色谱柱为Agilent 5TC-C18色谱柱、ZORBAX SB-Phenyl色谱柱或Supersil ODS2色谱柱。
进一步地，该色谱柱为ZORBAX SB-Phenyl色谱柱。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.08％的磷酸水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
进一步地，该中药复方中当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝的重量比为1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5。
进一步地，该中药复方中当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝的重量比为1:1:1:1:1:1:2:2:2。
进一步地，该对照品溶液为没食子酸浓度为14.75～27.40μg/ml、芍药苷浓度为64.63～120.03μg/ml、β-蜕皮甾酮浓度为30.01～55.74μg/ml、阿魏酸浓度为2.73～5.08μg/ml、甘草苷浓度为15.69～29.14μg/ml、桂皮醛浓度为14.39～26.73μg/ml、丹皮酚浓度为11.30～20.98μg/ml、甘草酸铵浓度为26.27～48.79μg/ml、人参皂苷Rg1浓度为9.64～17.91μg/ml、人参皂苷Re浓度为9.27～17.22μg/ml的混合溶液。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含肉桂的中药复方的指纹图谱构建方法，其包括如下步骤：
供试品溶液的制备：在中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及该中药复方溶液经过超声提取或回流提取后，过滤得到该供试品溶液，其中该中药复方由当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝组成；
对照品溶液的制备：称取没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，加10％～100％甲醇制成含各成分浓度为2～125μg/ml的该对照品溶液；
根据高效液相检测该供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
高效液相检测的色谱条件为：采用填料为苯基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％～10％A；12～30min，10％～17％A；30～41min，17％～19％A；41～66min，19％～32％A；66～85min，32％～40％A；85～95min，40％～75％A，流速为0.4～1.2mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～400nm。
进一步地，该高效液相检测的该流速为0.6～1.0mL/min，该柱温为20～30℃，该检测波长为200～260nm。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的峰纯度大于995。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于2000。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0。
进一步地，在该检测波长为252nm时，该指纹图谱包括1-20号峰，其中，20号峰为甘草酸铵作为参照峰、4号峰为没食子酸、9号峰为芍药苷、10号峰为β-蜕皮災酮、11号峰为阿魏酸、14号峰为甘草苷、16号峰为桂皮醛、18号峰为丹皮酚，其保留时间分别为82.0～84.0min、8.5～9.5min、29.0～30.5min、36.5～38.0min、40.0～41.5min、45.0～47.5min、65.5～66.5min、70.0～71.5min。
进一步地，在该检测波长为203nm时，该指纹图谱包括人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的色谱峰，其保留时间分别为56.5～58.0min、58.01～59.5min。
进一步地，该中药复方中当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝的重量比为1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5。
进一步地，该中药复方中当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝的重量比为1:1:1:1:1:1:2:2:2。
进一步地，该对照品溶液为没食子酸浓度为14.75～27.40μg/ml、芍药苷浓度为64.63～120.03μg/ml、β-蜕皮甾酮浓度为30.01～55.74μg/ml、阿魏酸浓度为2.73～5.08μg/ml、甘草苷浓度为15.69～29.14μg/ml、桂皮醛浓度为14.39～26.73μg/ml、丹皮酚浓度为11.30～20.98μg/ml、甘草酸铵浓度为26.27～48.79μg/ml、人参皂苷Rg1浓度为9.64～17.91μg/ml、人参皂苷Re浓度为9.27～17.22μg/ml的混合溶液。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.08％的磷酸水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
进一步地，该色谱柱为Agilent 5TC-C18色谱柱、ZORBAX SB-Phenyl色谱柱或Supersil ODS2色谱柱。
进一步地，该色谱柱为ZORBAX SB-Phenyl色谱柱。
进一步地，在该检测波长为252nm时，1号峰来自药材白芍、牡丹皮、川芎、甘草、人参，2号峰来自药材当归、川芎、甘草、牛膝、人参，3号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、川芎、人参、肉桂，4号峰来自药材白芍、牡丹皮；5号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、川芎、人参、肉桂、甘草；6号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、人参、肉桂、甘草；7号峰来自药材白芍、牡丹皮；8号峰来自药材白芍；9号峰来自药材白芍、牡丹皮；10号峰来自药材牛膝；11号峰来自药材当归、川芎；12号峰来自药材当归、川芎；13号峰来自药材白芍、牡丹皮；14号峰来自药材甘草；15号峰来自药材肉桂、甘草；16号峰来自药材肉桂；17号峰来自药材甘草；18号峰来自药材牡丹皮；19号峰来自药材甘草；20号峰来自药材甘草。
进一步地，在该检测波长为203nm时，1号峰人参皂苷Rg1来自药材人参，2号峰人参皂苷Re来自药材人参。
进一步地，该指纹图谱在检测波长252nm下，包括20个共有指纹峰，以甘草酸铵20号色谱峰为参比峰，其他19个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.076±0.005、2号色谱峰0.085±0.005、3号色谱峰0.090±0.005、4号色谱峰0.110±0.005、5号色谱峰0.197±0.005、6号色谱峰0.262±0.005、7号色谱峰0.280±0.005、8号色谱峰0.337±0.005、9号色谱峰0.357±0.005、10号色谱峰0.449±0.005、11号色谱峰0.488±0.005、12号色谱峰0.512±0.005、13号色谱峰0.538±0.005、14号色谱峰0.556±0.005、15号色谱峰0.722±0.005、16号色谱峰0.793±0.005、17号色谱峰0.835±0.005、18号色谱峰0.849±0.005、19号色谱峰0.941±0.005。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含对照品组合物的标准指纹图谱，该对照品组合物包含没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，在检测波长252nm下，该标准指纹图谱中呈现20个色谱峰，与参比峰甘草酸铵的峰保留时间相比，没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛和丹皮酚的色谱峰的相对保留时间分别为：0.110±0.005、0.357±0.005、0.449±0.005、0.488±0.005、0.556±0.005、0.793±0.005、0.849±0.005；在检测波长203nm下，该标准指纹图谱中呈现与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re色谱峰保留时间相同的两个色谱峰。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含对照品组合物的标准指纹图谱，该对照品组合物包含没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，其色谱条件为：采用填料为苯基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％～10％A；12～30min，10％～17％A；30～41min，17％～19％A；41～66min，19％～32％A；66～85min，32％～40％A；85～95min，40％～75％A，流速为0.4～1.2mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～400nm。
进一步地，建立该标准指纹图谱后，按上述检测方法构建包含肉桂的中药复方的指纹图谱，然后将其与该标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。
进一步地，建立该标准指纹图谱后，将上述构建方法所构建的指纹图谱与该标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述检测方法或上述构建方法或上述标准指纹图谱在包含肉桂的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
根据本发明的检测方法能准确获得包含肉桂的中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。而且本发明得到的图谱能较全面的反映包含肉桂的中药复方中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，获得的指纹图谱能够客观评估样品的质量。本发明共鉴定出10个化合物，并经过对照品验证。该结果为阐明包含肉桂的中药复方的药效物质基础奠定了基础，并为质量控制提供参考。
更具体地，相对于现有技术，本发明具有以下优势和效果：
(1)本发明首次应用高效液相色谱紫外检测法，建立的质量检测方法可同时测定包含肉桂的中药复方中指标成分的指纹图谱和含量测定；
(2)本发明在建立包含肉桂的中药复方的指纹图谱过程中，在检测波长252nm下，确认了20个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究；在检测波长203nm下，确认了2个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究；在一定程度上，保证了制剂的化学组成稳定性和使用安全性；
(3)包含肉桂的中药复方中化学成分复杂，要实现特征指纹峰的分离，难度大，本发明在建立起指纹图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题，可同时进行指纹图谱检测和指标成分含量测定的质量控制；
(4)建立包含肉桂的中药复方的指纹图谱，弥补了单一成分的含量反映整体含量的缺陷，能够从整体上控制包含肉桂的中药复方的内在质量，保证了药物的疗效，使经典名方得到了更为全面的质量控制；
(5)以包含肉桂的中药复方中各有效成分指纹图谱作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定包含肉桂的中药复方标准汤剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。为完整、准确评价包含肉桂的中药复方的质量提供了新的方法和手段；
(6)本发明方法既可以作为指纹图谱的检测方法，同时可以作为含量测定的质量控制方法；
(7)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本申请要求保护的范围。
图1是包含肉桂的中药复方供试品溶液3D吸收图。
图2是包含肉桂的中药复方HPLC标准指纹图谱(252nm)。
图3是包含肉桂的中药复方HPLC标准指纹图谱(203nm)。
图4是36批包含肉桂的中药复方HPLC指纹图谱共有模式图(252nm)。
图5是36批包含肉桂的中药复方HPLC指纹图谱共有模式图(203nm)。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
具体试验方法：
供试品溶液的制备：取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％甲醇水溶液为50ml，称定重量，超声提取30分钟，冷至室温，用体积百分比浓度为50％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
或者，取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，精密称定，置于50mL容量瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％甲醇水溶液适量，超声提取30分钟，冷至室温，用体积百分比浓度为50％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
或者，取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，精密称定，置于50mL容量瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％甲醇水溶液适量，振摇提取30分钟，冷至室温，用体积百分比浓度为50％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
参照物溶液的制备：取没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re对照品中的一种或多种适量，用体积百分比浓度为50％甲醇水溶液溶解，制成单一对照品溶液或者混合溶液。其中，所得的没食子酸单一对照品溶液中没食子酸浓度为14.75～27.40μg/ml；所得的芍药苷单一对照品溶液中芍药苷浓度为64.63～120.03μg/ml；所得的β-蜕皮甾酮单一对照品溶液中β-蜕皮甾酮浓度为30.01～55.74μg/ml；所得的阿魏酸单一对照品溶液中阿魏酸浓度为2.73～5.08μg/ml；所得的甘草苷单一对照品溶液中甘草苷浓度为15.69～29.14μg/ml；所得的桂皮醛单一对照品溶液中桂皮醛浓度为14.39～26.73μg/ml；所得的丹皮酚单一对照品溶液中丹皮酚浓度为11.30～20.98μg/ml；所得的甘草酸铵单一对照品溶液中甘草酸铵浓度为26.27～48.79μg/ml；所得的人参皂苷Rg1单一对照品溶液中人参皂苷Rg1浓度为9.64～17.91μg/ml；所得的人参皂苷Re单一对照品溶液中人参皂苷Re浓度为9.27～17.22μg/ml。所得的混合参照物溶液中，没食子酸浓度为14.75～27.40μg/ml、芍药苷浓度为64.63～120.03μg/ml、β-蜕皮甾酮浓度为30.01～55.74μg/ml、阿魏酸浓度为2.73～5.08μg/ml、甘草苷浓度为15.69～29.14μg/ml、桂皮醛浓度为14.39～26.73μg/ml、丹皮酚浓度为11.30～20.98μg/ml、甘草酸铵浓度为26.27～48.79μg/ml、人参皂苷Rg1浓度为9.64～17.91μg/ml、人参皂苷Re浓度为9.27～17.22μg/ml。
对照品溶液的制备：为方便指纹图谱比较并节约检测成本，没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草酸铵含量测定对照品溶液浓度可以同参照物浓度保持一致，无需重新配制，浓度分别为：没食子酸浓度为14.75～27.40μg/ml、芍药苷浓度为64.63～120.03μg/ml、阿魏酸浓度为2.73～5.08μg/ml、甘草酸铵浓度为26.27～48.79μg/ml。
采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和参照物溶液分别进行测试，并记录供试品溶液的指纹图谱和作为对照色谱峰的参照物溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，计算相似度；采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行测试，并分别记录供试品溶液的色谱图中相应峰面积、按照外标法计算包含肉桂的中药复方中没食子酸、芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵的含量。
其中，采用高效液相色谱法HPLC对各种待测溶液分别进行测试，色谱条件如下：
取待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用苯基键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.08％磷酸溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～12min，有机相体积百分比从5％线性改变至10％，12～30min，有机相体积百分比从10％线性改变至17％，30～41min，有机相体积百分比从17％线性改变至19％，41～66min，有机相体积百分比从19％线性改变至32％，66～85min，有机相体积百分比从32％线性改变至40％，85～95min，有机相体积百分比从40％线性改变至75％；柱温：25℃；流速0.8ml/min；检测波长：252nm、203nm。
实施例1：检测波长选择没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re为包含肉桂的中药复方中的10种活性成分，其分子结构、极性和光谱特征均存在明显差异，作为指标控制成分具有较好的代表性。根据这10种成分的紫外光光谱的特征吸收，从包含肉桂的中药复方供试品DAD三维图谱(如图1所示)中提取不同波长下的色谱图进行比较，结果表明，252nm下得到的色谱图基线平稳，并可兼顾各个成分检测灵敏度，因此选为指纹图谱和含量测定的检测波长；203nm下得到的色谱图基线平稳，可兼顾人参中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两个成分，因此可选为指纹图谱的检测波长。
实施例2：在其它条件相同的情况下，比较Agilent 5TC-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Supersil ODS2(4.6mm×250mm,5μm)、Agilent ZORBAXSB-Phenyl(250×4.6mm，5μm)等3款色谱柱的分离效果，结果表明，各色谱柱的出峰数目、峰分离度存在显著差异，其中AgilentZORBAXSB-Phenyl(250×4.6mm，5μm)各项性能指标最优，因此选用Agilent ZORBAXSB-Phenyl(250×4.6mm，5μm)作为进行指纹图谱和含量测定测定柱。
实施例3：以乙腈为有机相，在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较磷酸、冰乙酸、甲酸的水溶液作水相时的分离效果，结果表明，磷酸水溶液做水相时色谱峰峰形和分离度最好，因此选用磷酸水溶液进一步考察酸浓度。
实施例4：流动相酸浓度考察在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较体积百分浓度为0.06％、0.08％、0.1％三种浓度的磷酸水溶液作水相时的分离效果，结果表明，该方法对酸浓度变化的耐受性较好，三种酸浓度下色谱峰形和分离度无明显差异，因此选择0.08％磷酸溶液作为流动相水相。
实施例5：柱温考察在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较20℃、25℃、30℃等不同的色谱柱温度下的分离效果，结果表明，柱温对分离效果有明显影响，20℃、30℃时分离效果较好，25℃时分离效果最佳，因此确定柱温为25℃。
实施例6：流速考察在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min等不同的流速下的分离效果，结果表明，流速对分离效果有明显影响，0.6ml/min、1.0ml/min时分离效果较好，0.8ml/min时分离效果最佳，因此确定流速为0.8ml/min。
实施例7：提取方式考察以各指标成分峰面积及含量测定为评价标准，比较了体积百分比例为50％甲醇水溶液超声提取30分钟和振摇30分钟时的提取效果，包含肉桂的中药复方取样量为0.5g，溶剂用量为50mL，结果表明，振摇提取效率明显优于回流提取，因此选用振摇提取进一步优化提取参数。相关数据见表1和表2。
表1 不同提取方法指纹图谱考察结果(252nm)
Figure BDA0003347717310000131
Figure BDA0003347717310000141
表2 不同提取方法指纹图谱考察结果(203nm)
Figure BDA0003347717310000142
Figure BDA0003347717310000151
实施例8：提取溶剂选择以各指标成分峰面积及含量测定为评价标准，比较了甲醇、50％甲醇、水提取溶剂在振摇提取30分钟时的提取效果，包含肉桂的中药复方取样量为0.5g，溶剂用量为50mL，结果表明，50％甲醇提取效率明显优于甲醇、水，因此可选用50％甲醇作溶剂。也可以用不同浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，但乙醇溶液提取效果相比甲醇溶液要差。相关数据见表3。
表3 提取溶剂种类含量测定考察结果
Figure BDA0003347717310000152
实施例9：提取溶剂用量考察以各指标成分峰面积及含量测定为评价标准，比较了50％甲醇作为提取溶剂不同加入量在振摇提取30分钟时的提取效果，包含肉桂的中药复方取样量为0.5g，溶剂用量为25mL、50mL、100mL，结果表明，加50％甲醇50mL已能将目标成分提取完全，因此确定提取溶剂用量为加50％甲醇50mL。相关数据见表4。
表4 不同提取溶剂用量含量测定考察结果
Figure BDA0003347717310000161
根据上述研究结果，确定最终的样品前处理方法为：取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，精密称定，置50ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液适量，振摇提取30分钟，加50％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例10：精密度评价—包含肉桂的中药复方粉末0.5g，精密称定，溶剂为50％甲醇，按具体试验方法中振摇提取法制备一份供试品溶液，连续进样6次，与第1次比较，其余5次的色谱图相似度均大于0.999，各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值均小于2％，表明该方法精密度良好，符合指纹图谱测定要求。
实施例11：重复性评价—取同一批包含肉桂的中药复方粉末，制备6份供试品溶液，每份取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，溶剂为50％甲醇，按具体实验方法中振摇提取法制备供试品溶液，依次进样，与第1份比较，其余5份的色谱图相似度均大于0.999，各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值均小于2％，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱测定要求。
实施例12：稳定性评价—取实施例10中所得的包含肉桂的中药复方供试品溶液分别于制备后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h后测定，与0h比较，各时间点的色谱图相似度均大于0.999，各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值均小于2％，表明供试品溶液至少在12小时内稳定。
实施例13：专属性考察—分别取空白溶剂、混合对照品溶液(含没食子酸浓度为21.08μg/ml、芍药苷浓度为92.33μg/ml、β-蜕皮甾酮浓度为42.88μg/ml、阿魏酸浓度为3.91μg/ml、甘草苷浓度为22.42μg/ml、桂皮醛浓度为20.56μg/ml、丹皮酚浓度为16.14μg/ml、甘草酸铵浓度为37.53μg/ml、人参皂苷Rg1浓度为13.78μg/ml、人参皂苷Re浓度为13.25μg/ml)、包含肉桂的中药复方供试品溶液(精密称定包含肉桂的中药复方粉末0.5g，置50ml容量瓶中，溶剂为水，按具体试验方法中振摇提取法制备供试品溶液)、包含肉桂的中药复方处方中单味溶液(精密称定包含肉桂的中药复方复方中单味0.5g，置50ml容量瓶中，溶剂为水，按具体试验方法中振摇提取法制备供试品溶液)及阴性样品溶液(精密称定包含肉桂的中药复方阴性粉末0.5g，置50ml容量瓶中，溶剂为水，按具体试验方法中振摇提取法制备供试品溶液)进样，采集DAD三维图谱，对供试品色谱中各对照品对应色谱峰进行归属，并计算理论塔板数、分离度和峰纯度，结果表明，各供试品色谱中对照品对应的色谱峰理论塔板数均大于2000、分离度均大于2.0、峰纯度均大于995，该方法专属性符合指纹图谱测定要求。
实施例14：标准指纹图谱的建立
供试品溶液的制备：取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，精密称定，置50ml容量瓶中，加50％甲醇适量，振摇提取30分钟，并加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。参照物溶液的制备：取没食子酸对照品、芍药苷对照品、β-蜕皮甾酮对照品、阿魏酸对照品、甘草苷对照品、桂皮醛对照品、丹皮酚对照品、甘草酸铵对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液溶解，制成没食子酸浓度为14.75～27.40μg/ml、芍药苷浓度为64.63～120.03μg/ml、β-蜕皮甾酮浓度为30.01～55.74μg/ml、阿魏酸浓度为2.73～5.08μg/ml、甘草苷浓度为15.69～29.14μg/ml、桂皮醛浓度为14.39～26.73μg/ml、丹皮酚浓度为11.30～20.98μg/ml、甘草酸铵浓度为26.27～48.79μg/ml、人参皂苷Rg1浓度为9.64～17.91μg/ml、人参皂苷Re浓度为9.27～17.22μg/ml的混合溶液。
采用高效液相色谱法HPLC对各供试品溶液分别进行测试时，色谱条件为：取待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用苯基键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.05％磷酸溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～12min，有机相体积百分比从5％线性改变至10％，12～30min，有机相体积百分比从10％线性改变至17％，30～41min，有机相体积百分比从17％线性改变至19％，41～66min，有机相体积百分比从19％线性改变至32％，66～85min，有机相体积百分比从32％线性改变至40％，85～95min，有机相体积百分比从40％线性改变至75％；柱温：25℃；流速0.8ml/min；检测波长：252nm、203nm。
选取没食子酸的质量百分含量大于0.13％、芍药苷的质量百分含量大于0.37％、阿魏酸的质量百分含量大于0.033％、甘草酸的质量百分含量大于0.11％的15批包含肉桂的中药复方粉末，自由组合为18批，制备平行样，分别制备供试品溶液，并测定指纹图谱，将测得的36批包含肉桂的中药复方的指纹图谱采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012.130723版软件生成包含肉桂的中药复方HPLC标准指纹图谱，在检测波长252nm下，标定20个共有指纹峰，如图2所示。以甘草酸铵(20号峰，S峰)为参比峰，其他19个共有指纹峰相对保留时间依次为0.076、0.085、0.090、0.110、0.197、(0.262、0.280、0.337、0.357、0.449、0.488、0.512、0.538、0.556、0.722、0.793±0.005、0.835、0.849、0.941，其中4号、16号、20号峰为强峰，其峰面积和占总峰面积的45％。除S峰外，4号峰峰面积超过总峰面积10％，规定其相对峰面积为0.473～0.878；在检测波长203nm下，应包括2个共有指纹峰，应分别呈现与参照物人参皂苷Rg1、人参皂苷Re色谱峰保留时间相同的两个色谱峰，如图3所示。
实施例15：包含肉桂的中药复方指纹图谱共有峰来源归属
精密吸取实施例13的空白溶剂、缺白芍的阴性样品溶液、缺牡丹皮的阴性样品溶液、缺白芍与牡丹皮的阴性样品溶液、缺当归阴性样品溶液、缺川芎阴性样品溶液、缺当归与川芎的阴性样品溶液、缺肉桂的阴性样品溶液、缺人参的阴性样品溶液、缺牛膝的阴性样品溶液、缺甘草的阴性样品溶液、缺莪术的阴性样品溶液、参照物溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按具体试验方法中HPLC色谱法进行测定，记录色谱图。
结果表明，检测波长为252nm时，4号峰为没食子酸、9号峰为芍药苷、10号峰为β-蜕皮甾酮、11号峰为阿魏酸、14号峰为甘草苷、16号峰为桂皮醛、18号峰为丹皮酚、20号峰为甘草酸铵。1号峰来自药材白芍、牡丹皮、川芎、甘草、人参；2号峰来自药材当归、川芎、甘草、牛膝、人参；3号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、川芎、人参、肉桂；4号峰(没食子酸)来自药材白芍、牡丹皮；5号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、川芎、人参、肉桂、甘草；6号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、人参、肉桂、甘草；7号峰来自药材白芍、牡丹皮；8号峰来自药材白芍；9号峰芍药苷来自药材白芍、牡丹皮；10号峰β-蜕皮甾酮来自药材牛膝；11号峰阿魏酸来自药材当归、川芎；12号峰来自药材当归、川芎；13号峰来自白芍、牡丹皮；14号峰甘草苷来自药材甘草；15号峰来自药材肉桂、甘草；16号峰桂皮醛来自肉桂；17号峰来自药材甘草；18号峰丹皮酚来自药材牡丹皮；19号峰来自药材甘草；20号峰甘草酸铵来自药材甘草。在缺白芍、牡丹皮的阴性样品溶液色谱图中，未检出与没食子酸、芍药苷对照品相同保留时间的色谱峰，阴性对照均无干扰；缺当归、川芎阴性样品溶液的色谱图中，未检出与阿魏酸对照品相同保留时间的色谱峰，阴性对照均无干扰；在缺牛膝的阴性样品溶液的色谱图中，未检出与β-蜕皮甾酮对照品相同保留时间的色谱峰，阴性对照均无干扰；在缺牡丹皮阴性样品溶液的色谱图中，未检出与丹皮酚对照品相同保留时间的色谱峰，阴性对照均无干扰；在缺甘草阴性样品溶液的色谱图中，未检出与甘草苷、甘草酸铵对照品相同保留时间的色谱峰，阴性对照均无干扰。空白溶剂水均无干扰。
检测波长为203nm时，1号峰为人参皂苷Rg1、2号峰为人参皂苷Re。1号峰人参皂苷Rg1来自药材人参；2号峰人参皂苷Re来自药材人参；在缺人参阴性样品溶液的色谱图中，未检出与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re对照品相同保留时间的色谱峰，阴性对照均无干扰。空白溶剂水均无干扰。
其中没食子酸(4号峰)、芍药苷(9号峰)及1、3、5、6、7、13号峰为白芍、牡丹皮共有成分。8号峰为白芍专属成分。18号峰(丹皮酚)为牡丹皮专属成分。β-蜕皮甾酮(10号峰)为牛膝专属成分。阿魏酸(11号峰)及2、3、5、11、12号峰为当归、川芎共有成分。甘草苷(14号峰)、甘草酸铵(20号峰)及17、19号峰为甘草专属性成分。桂皮醛(16号峰)为肉桂专属性成分。5号峰为白芍、牡丹皮、当归、川芎、甘草、人参、肉桂共有成分。6号峰为白芍、牡丹皮、当归、甘草、肉桂、人参共有成分。
实施例16：不同产地来源药材制备36批包含肉桂的中药复方指纹图谱测定
取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，精密称定，置50ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液适量，振摇提取30分钟，并加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取待测溶液20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱用苯基键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.08％磷酸溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～12min，有机相体积百分比从5％线性改变至10％，12～30min，有机相体积百分比从10％线性改变至17％，30～41min，有机相体积百分比从17％线性改变至19％，41～66min，有机相体积百分比从19％线性改变至32％，66～85min，有机相体积百分比从32％线性改变至40％，85～95min，有机相体积百分比从40％线性改变至75％；柱温：25℃；流速0.8ml/min；检测波长：252nm、203nm。对36批不同来源包含肉桂的中药复方进行测定，将36批不同来源包含肉桂的中药复方进行测定，将所得指纹图谱与实施例13所得的包含肉桂的中药复方的标准指纹图谱比较，计算相似度，结果见图4和图5。
结果表明：36批包含肉桂的中药复方HPLC指纹图谱的各共有峰相对保留时间RSD均小于2％，说明各批次样品间色谱峰保留时间具有较高的一致性；36批包含肉桂的中药复方HPLC指纹图谱的各共有峰相对峰面积的RSD较大，反映出各批次样品间共有成分含量存在一定的差异。
实施例17：包含肉桂的中药复方HPLC指纹图谱中共有峰的定性鉴别
为了进一步阐明包含肉桂的中药复方标准汤剂的化学组成，对20个共有峰进行定性分析，采用LC-MS联用仪并结合文献，对指纹图谱中的色谱峰进行指认，结果见表5和表6。
表5 包含肉桂的中药复方HPLC指纹图谱特征峰指认结果
Figure BDA0003347717310000201
Figure BDA0003347717310000211
表6 包含肉桂的中药复方HPLC指纹图谱特征峰指认结果
Figure BDA0003347717310000212
实施例18：精密称取没食子酸对照品16.58mg，置20ml量瓶中，加乙腈适量使溶解，并加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含没食子酸(以90.8％计)0.7527mg的储备液；精密称取阿魏酸对照品39.46mg，置20ml量瓶中，加乙腈适量使溶解，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含阿魏酸(以99.0％计)1.9533mg的储备液；精密称取芍药苷对照品16.08mg，置20ml量瓶中，加50％甲醇水溶液适量使溶解，并加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含芍药苷(以95.7％计)0.7694mg的储备液；精密称取甘草酸铵对照品12.61mg，置25ml量瓶中，加50％甲醇水溶液适量使溶解，并加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含甘草酸铵(以93.0％计)0.4691mg的储备液。
混合对照品溶液的配制：分别精密量取没食子酸储备液0.7ml，芍药苷储备液3ml，阿魏酸储备液0.05ml，甘草酸铵储备液2ml，置于25ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含没食子酸21.0756μg、芍药苷92.328μg、阿魏酸3.9066μg、甘草酸铵37.528μg的混合对照品溶液。
实施例19：线性关系考察分别取没食子酸对照品、芍药苷对照品、阿魏酸对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml分别含没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草酸铵(0.00396mg、0.01864mg、0.00094mg、0.00923mg)、(0.00991mg、0.04660mg、0.00234mg、0.02306mg)、(0.01982mg、0.09319mg、0.00468mg、0.04613mg)、(0.03964mg、0.19282mg、0.00938mg、0.09226mg)(0.05947mg、0.28119mg、0.01406mg、0.15684mg)的溶液，精密吸取以上5个不同浓度的没食子酸对照品、芍药苷对照品、阿魏酸对照品、甘草酸铵对照品溶液20μl注入液相色谱仪，按具体试验方法中HPLC色谱法进行测定。测定峰面积，以没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草酸铵的浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数以及线性范围。
没食子酸线性回归方程为：y＝40742x+8.648，R2＝0.999。实验结果表明，没食子酸在0.00396mg/ml～0.05947mg/ml范围内线性关系良好；芍药苷线性回归方程：y＝4841x-5.482，R2＝0.999。实验结果表明，芍药苷在0.01864mg/ml～0.28119mg/ml范围内线性关系良好；阿魏酸线性回归方程：y＝51319x-1.290，R2＝0.999。实验结果表明，阿魏酸在0.00094mg/ml～0.01406mg/ml范围内线性关系良好；甘草酸铵线性回归方程：y＝23811.585x-9.308，R2＝1.000。实验结果表明，甘草酸铵在0.00923mg/ml～0.15684mg/ml范围内线性关系良好。
实施例20：仪器精密度取对照品溶液(含没食子酸21.0756μg/mL、芍药苷92.328μg/mL、阿魏酸3.9066μg/mL、甘草酸铵37.528μg/mL)，采用ZORBAX SB-Phenyl(250×4.6mm，5μm)为分析柱，按具体试验方法中的HPLC方法进行测定，重复测定6次，进样量20μL，以各指标成分色谱峰的峰面积计算RSD值。结果表明，各指标成分RSD值均小于2％，仪器精密度符合规定。
实施例21：重复性评价—取同一批包含肉桂的中药复方粉末，平行制备6份供试品溶液，每份取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，溶剂为50％甲醇，按具体实验方法中振摇提取法制备供试品溶液，依次进样，采用ZORBAX SB-Phenyl(250×4.6mm，5μm)为分析柱，按具体试验方法中的HPLC方法进行测定，并按照外标一点法计算包含肉桂的中药复方中各指标成分含量及其RSD值。结果表明，各指标成分含量的RSD值均小于2％，该方法的重复性良好。
实施例22：中间精密度考察—取同一批包含肉桂的中药复方粉末，每份取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，溶剂为50％甲醇水溶液，按具体实验方法中振摇提取法制备供试品溶液，采用ZORBAX SB-Phenyl(250×4.6mm，5μm)为分析柱，按具体试验方法中的HPLC方法进行测定，并按照外标一点法计算包含肉桂的中药复方中各指标成分含量，考察不同时间、不同人员、不同仪器测定结果的精密度，计算RSD值。结果表明，不同时间、不同人员、不同仪器下所得各指标成分含量测定结果的RSD值均小于2％，该方法的中间精密度符合规定。
实施例23：回收率考察—取同一批包含肉桂的中药复方粉末9份，每份取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，溶剂为50％甲醇水溶液，按高中低三个不同浓度分别精密加入没食子酸对照品溶液(0.6874mg/ml)0.70ml、1.35ml、2.00ml；芍药苷对照品溶液(1.8191mg/ml)1.00ml、2.10ml、3.20ml；阿魏酸对照品溶液(0.1953mg/ml)0.25ml、0.50ml、0.75ml；甘草酸铵对照品溶液(0.9384mg/ml)1.20ml、2.20ml、3.20ml；按具体实验方法中振摇提取法制备供试品溶液，采用ZORBAX SB-Phenyl(250×4.6mm，5μm)为分析柱，按具体试验方法中的HPLC方法进行测定，并按照外标一点法计算包含肉桂的中药复方中各指标成分回收率及其RSD值。结果表明，所得各指标成分回收率RSD值均小于2％，该方法的准确度符合规定。
实施例24：不同产地药材来源制备的36批包含肉桂的中药复方的含量测定
取包含肉桂的中药复方粉末0.5g，精密称定，置50ml容量瓶中，加50％甲醇适量，振摇提取30分钟，并加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取供试品溶液和对照品溶液(含没食子酸21.0756μg/mL、芍药苷92.328μg/mL、阿魏酸3.9066μg/mL、甘草酸铵37.528μg/mL)各20μL，注入高效液相色谱仪，色谱柱用苯基键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相的有机相，以体积百分比浓度为0.05％磷酸溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为：0～12min，有机相体积百分比从5％线性改变至10％，12～30min，有机相体积百分比从10％线性改变至17％，30～41min，有机相体积百分比从17％线性改变至19％，41～66min，有机相体积百分比从19％线性改变至32％，66～85min，有机相体积百分比从32％线性改变至40％，85～95min，有机相体积百分比从40％线性改变至75％；柱温：25℃；流速0.8ml/min；检测波长：252nm。取36批包含肉桂的中药复方，平行制备两份，每份进两针按外标一点法计算包含肉桂的中药复方中没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草酸铵等指标成分的含量，测定结果见表7。
表7 不同来源制备36批包含肉桂的中药复方含量测定结果
Figure BDA0003347717310000241
Figure BDA0003347717310000251
Figure BDA0003347717310000261
实施例25：包含肉桂的中药复方的质量评价
1、各批次物质基准对应实物没食子酸含量实测范围为0.16％～0.24％，均值0.19％，SD为0.02，均值±30％的波动范围为0.13～0.25％，3SD值为：0.13％～0.25％。
2、各批次物质基准对应实物芍药苷实测范围为0.60％～1.10％，均值0.78％，SD为0.14，均值±30％的波动范围为0.54％～1.01％，3SD范围为：0.37％～1.18％。
3、各批次物质基准对应实物阿魏酸实测范围为0.042％～0.071％，均值0.056％，SD为0.01，均值±30％的波动范围为0.039％～0.073％，3SD范围为：0.033％～0.079％。
4、各批次物质基准对应实物甘草酸实测范围为0.11％～1.08％，均值0.54％，SD为0.19，均值±30％的波动范围为0.38％～0.71％，3SD值为：0.00％～1.12％。甘草酸含量测定数据有八批低于含量均值的-30％，分别为0.25％、0.20％、0.11％、0.17％、0.31％、0.34％、0.37％，五批高于含量均值的+30％分别为0.73％、1.08％、0.72％、0.72％、0.86％，但以上十三批没有超出3SD范围，且其转移率也都在3SD范围内。
5、各批次物质基准对应实物按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度均大于0.90；暂定，相似度不得低于0.90。
以上对本申请实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本申请的思想，基于本申请的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本申请保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (7)

1.一种包含肉桂的中药复方的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中所述中药复方由当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝组成，所述对照品为没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，
所述检测的色谱条件为：采用填料为苯基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％～10％A；12～30min，10％～17％A；30～41min，17％～19％A；41～66min，19％～32％A；66～85min，32％～40％A；85～95min，40％～75％A，流速为0.4～1.2mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～400nm；
根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述信息为根据所记录的所述中药复方供试品溶液的色谱图和所述对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算所述中药复方中以下成分中一种或多种的含量：没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re；
优选地，以所测定的中药复方干品计，没食子酸含量不小于0.13％、芍药苷含量不小于0.37％、阿魏酸含量不小于0.033％、甘草酸铵含量不小于0.11％；
优选地，所述中药复方供试品溶液的制备方法包括：在所述中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及所述中药复方溶液经过振摇提取、超声提取和/或回流提取后，摇匀，过滤得到所述中药复方供试品溶液；
优选地，所述中药复方溶液通过以下方法获得：称取0.05g～2.5g的所述中药复方，以及添加10～300mL的体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液；
优选地，所述中药复方供试品溶液通过以下方法获得：室温振摇提取20分钟～60分钟，并用体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤；
优选地，所述中药复方供试品溶液通过以下方法获得：超声提取20～60分钟，冷至室温，并用体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液补足减失的重量或定容至刻度，摇匀后过滤；
优选地，所述对照品溶液的制备方法包括：称取适量的没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为2～125μg/ml的所述对照品溶液；
更优选地，所述流速为0.6～1.0mL/min，所述柱温为20～30℃，所述检测波长为200～260nm；
又优选地，所述对照品对应的色谱峰的峰纯度大于995；
特别优选地，所述对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于2000；
尤其优选地，所述对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0；
又尤其优选地，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18色谱柱、ZORBAX SB-Phenyl色谱柱或Supersil ODS2色谱柱；
最优选地，所述色谱柱为ZORBAX SB-Phenyl色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，
所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.08％的磷酸水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0；
特别优选地，所述中药复方中当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝的重量比为1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5；
尤其优选地，所述中药复方中当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝的重量比为1:1:1:1:1:1:2:2:2；
最优选地，所述对照品溶液为没食子酸浓度为14.75～27.40μg/ml、芍药苷浓度为64.63～120.03μg/ml、β-蜕皮甾酮浓度为30.01～55.74μg/ml、阿魏酸浓度为2.73～5.08μg/ml、甘草苷浓度为15.69～29.14μg/ml、桂皮醛浓度为14.39～26.73μg/ml、丹皮酚浓度为11.30～20.98μg/ml、甘草酸铵浓度为26.27～48.79μg/ml、人参皂苷Rg1浓度为9.64～17.91μg/ml、人参皂苷Re浓度为9.27～17.22μg/ml的混合溶液。
4.一种包含肉桂的中药复方的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：在中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及所述中药复方溶液经过超声提取或回流提取后，过滤得到所述供试品溶液，其中所述中药复方由当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝组成；
对照品溶液的制备：称取没食子酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸铵、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，加10％～100％甲醇制成含各成分浓度为2～125μg/ml的所述对照品溶液；
根据高效液相检测所述供试品溶液和所述对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
高效液相检测的色谱条件为：采用填料为苯基键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％～10％A；12～30min，10％～17％A；30～41min，17％～19％A；41～66min，19％～32％A；66～85min，32％～40％A；85～95min，40％～75％A，流速为0.4～1.2mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～400nm。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
所述高效液相检测的所述流速为0.6～1.0mL/min，所述柱温为20～30℃，所述检测波长为200～260nm；
优选地，所述对照品对应的色谱峰的峰纯度大于995；
优选地，所述对照品对应的色谱峰的理论塔板数大于2000；
优选地，所述对照品对应的色谱峰的分离度大于2.0；
更优选地，在所述检测波长为252nm时，所述指纹图谱包括1-20号峰，其中，20号峰为甘草酸铵作为参照峰、4号峰为没食子酸、9号峰为芍药苷、10号峰为β-蜕皮災酮、11号峰为阿魏酸、14号峰为甘草苷、16号峰为桂皮醛、18号峰为丹皮酚，其保留时间分别为82.0～84.0min、8.5～9.5min、29.0～30.5min、36.5～38.0min、40.0～41.5min、45.0～47.5min、65.5～66.5min、70.0～71.5min；
更优选地，在所述检测波长为203nm时，所述指纹图谱包括人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的色谱峰，其保留时间分别为56.5～58.0min、58.01～59.5min；
特别优选地，所述中药复方中当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝的重量比为1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5；
尤其优选地，所述中药复方中当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草和牛膝的重量比为1:1:1:1:1:1:2:2:2；
最优选地，所述对照品溶液为没食子酸浓度为14.75～27.40μg/ml、芍药苷浓度为64.63～120.03μg/ml、β-蜕皮甾酮浓度为30.01～55.74μg/ml、阿魏酸浓度为2.73～5.08μg/ml、甘草苷浓度为15.69～29.14μg/ml、桂皮醛浓度为14.39～26.73μg/ml、丹皮酚浓度为11.30～20.98μg/ml、甘草酸铵浓度为26.27～48.79μg/ml、人参皂苷Rg1浓度为9.64～17.91μg/ml、人参皂苷Re浓度为9.27～17.22μg/ml的混合溶液。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，
所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.04％～0.12％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.04％～0.12％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.08％的磷酸水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；
更优选地，所述缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0；
又优选地，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18色谱柱、ZORBAX SB-Phenyl色谱柱或Supersil ODS2色谱柱；
又优选地，所述色谱柱为ZORBAX SB-Phenyl色谱柱；
特别优选地，在所述检测波长为252nm时，1号峰来自药材白芍、牡丹皮、川芎、甘草、人参，2号峰来自药材当归、川芎、甘草、牛膝、人参，3号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、川芎、人参、肉桂，4号峰来自药材白芍、牡丹皮；5号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、川芎、人参、肉桂、甘草；6号峰来自药材白芍、牡丹皮、当归、人参、肉桂、甘草；7号峰来自药材白芍、牡丹皮；8号峰来自药材白芍；9号峰来自药材白芍、牡丹皮；10号峰来自药材牛膝；11号峰来自药材当归、川芎；12号峰来自药材当归、川芎；13号峰来自药材白芍、牡丹皮；14号峰来自药材甘草；15号峰来自药材肉桂、甘草；16号峰来自药材肉桂；17号峰来自药材甘草；18号峰来自药材牡丹皮；19号峰来自药材甘草；20号峰来自药材甘草；
特别优选地，在所述检测波长为203nm时，1号峰人参皂苷Rg1来自药材人参，2号峰人参皂苷Re来自药材人参；
最优选地，所述指纹图谱在检测波长252nm下，包括20个共有指纹峰，以甘草酸铵20号色谱峰为参比峰，其他19个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.076±0.005、2号色谱峰0.085±0.005、3号色谱峰0.090±0.005、4号色谱峰0.110±0.005、5号色谱峰0.197±0.005、6号色谱峰0.262±0.005、7号色谱峰0.280±0.005、8号色谱峰0.337±0.005、9号色谱峰0.357±0.005、10号色谱峰0.449±0.005、11号色谱峰0.488±0.005、12号色谱峰0.512±0.005、13号色谱峰0.538±0.005、14号色谱峰0.556±0.005、15号色谱峰0.722±0.005、16号色谱峰0.793±0.005、17号色谱峰0.835±0.005、18号色谱峰0.849±0.005、19号色谱峰0.941±0.005。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法或根据权利要求4至6中任一项所述的构建方法在包含肉桂的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
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