CN112034052A - 一种测定复杂组分中维生素b2的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

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黄小梅
李勇
陈平
田敏卿
姜城子
徐希平
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Shenzhen Aosa Pharmed Co ltd
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    • G01N30/06—Preparation

Abstract

本发明提供一种高效测定复杂组分中维生素B2的液相色谱分析方法，是以0.1M磷酸二氢钾、0.01M磷酸氢二钾混合溶液‑乙腈为流动相进行等度洗脱，可避免其他组分的干扰，在20分钟内准确灵敏地检测出维生素B2的含量。该方法专属性强、精密度高、稳定性较好、准确度高，操作简单，试剂与耗材价廉易得。适用于含维生素B2组合物的片剂、粉末、胶囊等剂型中复杂组分中维生素B2含量检测，检测质量控制，可有效地节约检测成本和时间。

Description

一种测定复杂组分中维生素B2的高效液相色谱分析方法
技术领域
本发明涉及一种高效快速测定复杂组分中维生素B2含量的液相色谱分析方法。具体通过对样品前处理和色谱条件的优化，使得实验简单，方便且准确快速检测出复杂组分中维生素B2的含量。
背景技术
维生素B2(分子式为C17H20N4O6)是一种水溶性维生素，又叫核黄素，在生长代谢中，具有非常重要的作用，是肌体组织代谢和修复的必须营养素。微溶于水，在中性或酸性溶液中加热是稳定的。维生素B2的结构如下：
Figure BDA0002082258900000011
目前检测维生素B2的色谱分析方法中，样品前处理采用的提取溶剂是酸性离子对溶液，需要用到的试剂和溶剂较多，操作复杂，过程繁琐。为了克服这问题，本发明采用10-30％低浓度有机溶剂溶液作为提取溶剂，不仅操作简单，节约试剂，而且还能完全将维生素B2提取出来。
目前检测维生素B2的方法中，色谱条件也是较为复杂，所用的流动相溶液中加入了离子对和三乙胺等一些有危险的试剂。操作不仅复杂，增加过程危险性，而且洗脱时间较长或采用梯度较为繁琐。因此，很有必要研究一种高效准确快速测定复杂组分中维生素B2的液相色谱方法。
由于多种维生素矿物质片中含有多种成分，某种成分可能会对维生素B2造成降解，故有必要研究出一种能专属检测维生素B2，且其与杂质峰能很好分离开的高效液相色谱分析方法。
发明内容
为克服上述问题，本发明提供一种提取率高，稳定性好，准确度高，重复性好的专属维生素B2的高效液相色谱方法，所述方法包括以下步骤：
一种用于测定片剂、粉剂、胶囊剂型产品中维生素B2含量的高效液相色谱分析方法，供试品的提取溶剂为低浓度有机溶剂，提取方法为水浴超声提取；流动相A 为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的混合比例为98～85:2～15，等度洗脱；紫外检测波长设定为260～275nm。
在本发明中，用于供试品提取的溶剂选自乙腈、甲醇或乙醇中的一种，优选乙腈。其中，提取溶剂的浓度选自5％-60％，优选10-30％，更加优选20％。
在本发明中，提取方法水浴超声的温度选自25～80℃，优选30～60℃，更加优选40～50℃。
在本发明中，流动相A的磷酸盐缓释液为0.1M磷酸二氢钾和0.01M磷酸氢二钾的混合溶液。混合溶液的pH选自3.00～5.00，优选3.00～4.00，更优选3.5。
在一个实施方案中，进行上述色谱分析的色谱仪器及条件为：
检测仪器：高效液相色谱仪，配备紫外检测器；
色谱条件：
色谱柱：Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18150mm*4.6mm，5μm；流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈；检测波长：260～275nm；流速：0.8～1.5ml/min；柱温：25～30℃，最佳柱温：25℃；运行时间：20min。
本发明中，采用高效液相色谱对多种维生素矿物质片溶液中的维生素B2进行定量检测，需要对该方法进行专属性、准确度等多方面的确认，具体为：
专属性：配制多种维生素矿物质片溶液和不含维生素B2的空白辅料溶液，分别进样，结果显示表明空白溶剂、空白辅料对供试品溶液的主峰出峰无干扰，且能与相邻峰有效的分离开，说明本发明提供的方法能够准确测定多种维生素矿物质片功效成分维生素B2的含量。
准确度：采用本发明的高效液相色谱方法对多种维生素矿物质片溶液中的维生素B2进行检测，结果显示表明其回收率在合格标准范围，准确度良好。
线性：采用本发明的高效液相色谱方法对多种维生素矿物质片中的维生素B2对照品溶液进行检测，在线性范围40％～160％内，结果显示其主成分线性相关系数不小于0.998，表明检测结果与维生素B2的浓度具有良好的线性关系。
本发明中，采用高效液相色谱对不同剂型样品配制成的样品溶液中的维生素B2进行定量检测。
附图说明
图1示供试品溶液的HPLC检测的色谱图；
图2示实施例1的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
图3示实施例2的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
图4示实施例3的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
图5空白辅料示实施例4的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
图6供试品示实施例4的色谱条件下HPLC检测的色谱图；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明，分别以片剂、胶囊、流动相比例的选择为例。
试剂：乙腈(SINENCE，批号180/A0683)，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾(天津市大茂化学试剂厂，AR)，磷酸(天津市富宇精细化工有限公司，AR)，维生素B2对照品(中国食品药品检定研究院)，样品(深圳芙莱特营养与健康有限公司提供)
实施例1：
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的A1111号牌多种维生素矿物质片(含有维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、烟酸、泛酸、维生素B6、生物素、维生素 C、维生素D、叶酸、维生素B12、铁、锌、硒、镁、铜、钙、铬、钾等20种成分) 样品中维生素B2含量的测定。第一实施例的具体步骤如下：
第一步：提取溶剂，量取200ml的乙腈，缓缓加入到800ml的超纯水中，摇匀。
第二步：对照品溶液的配制，取维生素B2对照品，精密称定，加入提取溶剂适量，温水浴超声振摇，冷却至室温，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；稀释到需要浓度的对照品溶液，即可。
第三步：样品溶液配制，取本品20片，研细，精密称取适量，置于100ml量瓶中，加入一定量提取溶剂溶解，温水浴超声振摇，冷却至室温，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
第四步：液相色谱条件的具体内容如下：
色谱柱：Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18150mmX4.6mm，5μm
流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈(98：2)
检测波长：270nm
流速：1.2ml/min
柱温：30℃
进样体积：10ul
运行时间：20min
检测色谱图如图2，检测结果如表1
表1检测结果
牌号类型 物质名称 保留时间/min 理论塔板数 拖尾因子 含量％
A1111 维生素B<sub>2</sub> 12.660 9852 1.05 95.5
实施例2：
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的B0003号牌多种维生素片(含有维生素B1、维生素B2、烟酸、泛酸、维生素B6、生物素、叶酸、维生素B12等8种成分)样品中维生素B2含量的测定。具体步骤：
第一步：提取溶剂，量取200ml的乙腈，缓缓加入到800ml的超纯水中，摇匀。
第二步：对照品溶液的配制，取维生素B2对照品，精密称定，加入提取溶剂适量，温水浴超声振摇，冷却至室温，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；稀释到需要浓度的对照品溶液，即可。
第三步：样品溶液配制，取本品20片，研细，精密称取适量，置于100ml量瓶中，加入一定量提取溶剂溶解，温水浴超声振摇，冷却至室温，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
第四步：液相色谱条件的具体内容如下：
色谱柱：Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18150mmX4.6mm，5μm
流动相：磷酸盐缓冲液-甲醇(85：15)
检测波长：260nm
流速：1.2ml/min
柱温：25℃
进样体积：10ul
运行时间：20min
样品检测色谱图如图3，检测结果如表2。
表2检测结果
Figure BDA0002082258900000041
Figure BDA0002082258900000051
实施例3：
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的多种维生素矿物质胶囊(含维生素A、维生素 E、维生素B1、维生素B2、烟酸、泛酸、维生素B6、生物素、维生素C、维生素D、叶酸、维生素B12、铁、锌、硒、镁、铜、钙、铬、钾等20种成分)样品中维生素 B2含量的测定。具体步骤如下：
第一步：提取溶剂，量取200ml的乙腈，缓缓加入到800ml的超纯水中，摇匀。
第二步：对照品溶液的配制，取维生素B2对照品，精密称定，加入提取溶剂适量，温水浴超声振摇，冷却至室温，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；稀释到需要浓度的对照品溶液，即可。
第三步：样品溶液配制，取本品胶囊20粒，除去胶囊壳倒出内容物，精密称取内容物适量，置于100ml量瓶中，加入一定量提取溶剂溶解，温水浴超声振摇，冷却至室温，加提取溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
第四步：液相色谱条件的具体内容如下：
色谱柱：Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18150mmX4.6mm，5μm
流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈(90：10)
检测波长：275nm
流速：0.8ml/min
柱温：30℃
进样体积：10ul
运行时间：20min
样品检测色谱图如图4，检测结果如表3。
表3检测结果
类型 物质名称 保留时间/min 理论塔板数 拖尾因子 含量％
胶囊 维生素B<sub>2</sub> 12.767 9972 1.05 97.2
实施例1～3显示，本发明对含有多种维生素矿物质片、部分维生素B族片、多种维生素矿物质胶囊样品进行检测，维生素B2均能在13min左右出峰，峰型好，与其他成分分离度大，说明该方法适用于不同剂型的复杂组分中维生素B2的检测。
实施例4：
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的A1111号牌多种维生素矿物质片样品中维生素B2含量的测定-流动相比例的选择。
流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈(80：20)
其他具体步骤同第一实施例。样品检测色谱图如图5(空白辅料色谱图)、图6(供试品A1111号牌多种维生素矿物质片色谱图)，检测结果如表4。
表4检测结果
Figure BDA0002082258900000061
在该流动相的比例洗脱下，维生素B2的洗脱出峰时间前移到6分多钟，但看图6，主峰型不好，拖尾因子较大，而且结合图5(空白辅料)与图6可以看出，辅料对主峰出峰有干扰，主峰与相邻峰的分离度达不到要求。因此，选择流动相的比例确定在磷酸盐：乙腈(98～85：2～15)
以上所述的具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案以及有益效果作了一系列的详细说明。但该说明仅仅是针对本发明的具体实施例而已，凡没有脱离本发明技术基础、原则和精神而作的等效实施例或变更，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于高效测定复杂组分中维生素B2含量的高效液相色谱分析方法，其特征在于，供试品的提取溶剂为低浓度有机溶剂，提取方法为水浴超声提取；流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的混合比例为98～85:2～15，等度洗脱；紫外检测波长为260～275nm。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述用于供试品的提取溶剂选自乙腈、甲醇或乙醇中的一种，优选乙腈。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述提取溶剂的浓度选自5％-60％，优选10-30％，更加优选20％。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述提取方法水浴超声的温度选自25～80℃，优选30～60℃，更加优选40～50℃。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，作为流动相A的磷酸盐缓释液选自0.1M磷酸二氢钾和0.01M磷酸氢二钾的混合溶液。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述混合溶液的pH值选自3.00～5.00，优选3.00～4.00，更加优选3.5。
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