WO2013176454A1 - 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법 - Google Patents

액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2013176454A1
WO2013176454A1 PCT/KR2013/004429 KR2013004429W WO2013176454A1 WO 2013176454 A1 WO2013176454 A1 WO 2013176454A1 KR 2013004429 W KR2013004429 W KR 2013004429W WO 2013176454 A1 WO2013176454 A1 WO 2013176454A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vitamins
vitamin
liquid chromatography
column
acid
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/004429
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정소희
조혜영
이상원
권돈선
Original Assignee
한국콜마주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국콜마주식회사 filed Critical 한국콜마주식회사
Publication of WO2013176454A1 publication Critical patent/WO2013176454A1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for the simultaneous analysis of vitamins using liquid chromatography.
  • Vitamins are relatively small organic compounds with a molecular weight of 1,000 or less, which are required in small amounts for normal animal life and production activities.
  • the vitamin is 1) essential components of coenzyme and enzyme supplementary molecular groups, related to the metabolism of nutrients, 2) important role in physiological phenomena such as vision, skeletal formation, breeding, and 3) to help the efficient use of various nutrients, 4) It suppresses various symptoms such as skin disease, anemia and neurosis, and 5) improves productivity by improving growth rate and feed efficiency.
  • vitamins are essential nutrients for the normal growth, development and health of the human body, but since they are hardly synthesized in the body, they should be consumed only through food.
  • processed foods and instant foods that modern people enjoy are high in calories but low in vitamin content, so modern people who normally eat them are likely to lack vitamins.
  • due to the nature of vitamins that are easily destroyed, even if they have normal eating habits they are difficult to consume due to the destruction of vitamins in the process of cooking, etc.
  • the consumption of vitamins in the body increases due to environmental pollution, fatigue, and stress, In order to stay healthy, extra vitamin intake is essential.
  • the organic solution includes acetonitrile, methanol, acid and ion pair reagents,
  • the aqueous solution includes water, acid and ion pair reagents,
  • the ion pair reagent provides a method for the simultaneous analysis of vitamins using liquid chromatography, characterized in that one kind selected from the group consisting of sodium alkane sulfonate having 7 to 9 carbon atoms.
  • the present invention is a method of simultaneously analyzing two or more vitamins
  • the organic solution includes one selected from the group consisting of alcohols having 3 to 5 carbon atoms, one selected from the group consisting of methanol and ethanol, and acetonitrile,
  • the aqueous solution provides a method for simultaneous analysis of vitamins using liquid chromatography, which is water.
  • Simultaneous analysis method of vitamins using the liquid chromatography of the present invention according to the above problem solving means is useful for rapidly separating the various vitamin components, simultaneously analyzing the vitamin components in a sample containing a plurality of vitamin components.
  • Example 1 is a graph showing the chromatogram of Example 1.
  • Example 5 is a graph showing the chromatogram of Example 2.
  • Example 6 is a graph showing the chromatogram of Example 3.
  • the organic solution includes acetonitrile, methanol, acid and ion pair reagents,
  • the aqueous solution includes water, acid and ion pair reagents,
  • the ion pair reagent provides a method for the simultaneous analysis of vitamins using liquid chromatography, characterized in that one kind selected from the group consisting of sodium alkane sulfonate having 7 to 9 carbon atoms.
  • Vitamins are an important active ingredient in enzymes, which in small amounts dominate animal nutrition, regulate normal physiology and help complete metabolism.
  • the vitamin is divided into a fat-soluble vitamin and a water-soluble vitamin, and the vitamin shows a polarity difference depending on the chemical structure.
  • various kinds of vitamin components cause a difference in affinity for the stationary phase in the chromatography column, so that the column passage time, that is, the retention time, varies depending on the type of vitamin.
  • the vitamin components passed through the column are detected through a peak due to the increase in absorbance on the ultraviolet absorbance photometer (UV) in order with the retention time.
  • Detected vitamins are identified by comparison of retention time with standard substances (qualitative analysis), and the amount of each type of vitamin contained in the sample is calculated by the height or area of the peak (quantitative analysis).
  • the vitamin is preferably at least one selected from the group consisting of water-soluble vitamins and fat-soluble vitamins, specifically water-soluble ascorbic acid (vitamin C), thiamine (thiamine, vitamin B1), riboflavin (riboflavin, vitamin B2), Niacin (collectively, niacin, vitamin B3, nicotinic acid and nicotinamide), pantothenic acid (vitamin B5), pyridoxine (vitamin B6), biotin (vitamin B7), and folic acid (Folic acid, folic acid, vitamin B9 or vitamin M), cyanocobalamin and fursultiamine and fat-soluble riboflavinbutyrate (vitamin B2 active), retinol (vitamin A), retinol palmi Tate (retinol palmitate, vitamin A active form), cholecalciferol (vitamin D), alpha tocopherol (vitamin E), alpha tocopherol acetate Alpha tocopherol acetate (
  • the vitamin is a vitamin including ascorbic acid, pantothenic acid, nicotinamide, pyridoxine, biotin, riboflavin, folic acid, and thiamine, or phylloquinone, riboflavinbutyrate, cholecalciferol, retinol, retinol palmitate, beta carotene Vitamins, including, but not limited to, ubidecarenone and alphatocopherol acetate.
  • the solvent in the sample solution containing the vitamin may be water, methanol, isopropanol, hexane or petroleum ether, but is not limited thereto.
  • the solution may be prepared by an extraction process using the solvent from one or more products selected from the group consisting of tablets, liquids, and capsules.
  • Vitamin components are organic compounds having an amine group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amide group, and the like, and show polar differences depending on chemical structures.
  • the present inventors have found that most of the vitamins are separated well when using a nonpolar column rather than a polar column as a stationary phase, and completed the present invention.
  • the column used in step (B) is to reduce the length and diameter of the column in order to minimize the analysis time, and to reduce the size of the packed particles in the column in order to ensure separation, the mobile phase solution or the sample solution passing through the column It should not contain insoluble particulates or microorganisms that could be trapped in the column to increase pressure or affect the analysis. Therefore, it is preferable that it is a nonpolar column filled with octadecylsilane (C18), dodecylsilane (C12), or octasilane (C8) having a nonpolarity in the stationary phase, and more preferably, the separation between components having similar chemical properties is reduced.
  • nonpolar column packed with octadecylsilane (C18) having a strong nonpolar property is a nonpolar column filled with octadecylsilane (C18) having a strong nonpolar property.
  • the nonpolar column filled with octadecylsilane (C18) is filled with a substance having 18 molecular chains of carbon which is nonpolar in the column.
  • the polar component is eluted quickly because it does not bind with the nonpolar column functional group. It elutes relatively slowly in combination with nonpolar functional groups.
  • the column has a length of 3 to 30 cm, preferably 3 to 15 cm, an inner diameter of 1.8 to 5 mm, and a diameter of particles packed in the column is preferably 1.5 to 5 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the column that satisfies the above specifications is excellent in the speed and selectivity, it is possible to increase the simultaneous analysis efficiency of the vitamin.
  • the mobile phase of the liquid chromatography uses a mixed solution containing an organic solution and an aqueous solution, each organic solution and the aqueous solution includes an acid and ion-pair reagent .
  • the organic solution is a mixed solution of acetonitrile and methanol, more preferably the mixed solution contains acetonitrile and methanol in a volume ratio of 2: 1 to 6: 1.
  • the separation of vitamin components having similar polarity is excellent, and it is effective to simultaneously analyze a plurality of vitamin components.
  • the flow rate of the liquid chromatography mobile phase is preferably 0.4 to 1.5 mL / min in order to maximize the analysis efficiency and minimize the analysis time.
  • composition of the mobile phase solution was such that acid was used to lower the pH, while proper separation of the vitamins occurred using an appropriate concentration of ion-pair reagent.
  • the acid is preferably one selected from the group consisting of phosphoric acid, trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid and heptafluorobutyric acid, and more preferably 0.1% to 0.5% by weight phosphoric acid and trifluoroacetic acid.
  • the acid maintains the pH of the mobile phase at 2 to 3, thereby unifying the charge states of the same molecule molecules to be analyzed as one, thereby reducing the difference in the moving speed of the same molecules in the column and narrowing and lengthening the peak shape. It prevents peak distortion and increases the separation between peaks.
  • the ion pair reagent is one selected from the group consisting of sodium alkane sulfonate having 7 to 9 carbon atoms, preferably sodium 1-heptanesulfonate and sodium 1-octane sulfonate. More preferably, sodium 1-heptanesulfonate is preferably 0.1% to 0.2% by weight. If the carbon number of the ion-pair reagent exceeds 9 there is a disadvantage that the separation time is long.
  • the ion pair reagent is one of anionic surfactants and has a nonpolar carbon molecular chain and a polar functional group (sulfonic acid anion) in its molecule.
  • the non-polar carbon molecular chain of the ion-pair reagent has a nonpolar bond with the nonpolar stationary phase, and the polar functional group with the anion forms an electrostatic attraction with the positively charged ions of the material to be analyzed and consequently retains in the column of positively charged components. It helps to increase the separation between peaks and to secure the symmetry of peaks by lengthening the time.
  • the step (C) is made by a concentration gradient method
  • the volume ratio of the organic solution and the aqueous solution is 0 ⁇ 45:55 ⁇ 100, preferably may be made of a third step or more.
  • the volume ratio of the organic solution and the aqueous solution is 0-15: 85-100 in the first step, 5-15: 85-95 in the second step, 10-55: 45-90 in the third step, and further, the column
  • 0 to 100: 0 to 100 is preferable for the washing and stabilization of the column for the next sample analysis.
  • a concentration gradient method can be used.
  • the time for each step may be applied without particular limitation, and preferably the time of the third step is longer than the time of the first, second and fourth steps.
  • the total elution time of the present invention is 5 minutes
  • the first stage is the first minute
  • the second stage is 1 to 2 minutes
  • the third stage is 2 to 4 minutes
  • the fourth stage is 4 minutes later.
  • the total elution time is 15 minutes
  • the first stage is 3 minutes
  • the second stage is 3 to 6 minutes
  • the third stage is 6 minutes to 13 minutes
  • the fourth stage is 13 minutes later.
  • the total elution time is 30 minutes
  • the first stage is 7 minutes
  • the second stage is 7 minutes to 13 minutes
  • the third stage is 13 minutes to 27 minutes
  • the fourth stage is 27 minutes.
  • the elution time is 45 minutes
  • the first step is the first 11 minutes
  • the second step is 11 to 19 minutes
  • the third step is 19 to 40 minutes
  • the fourth step May be expressed as a time after 41 minutes, but is not limited there
  • the present invention is a method of simultaneously analyzing two or more vitamins
  • the organic solution includes one selected from the group consisting of alcohols having 3 to 5 carbon atoms, one selected from the group consisting of methanol and ethanol, and acetonitrile, and the aqueous solution simultaneously analyzes vitamins using liquid chromatography, which is water. Provide a method.
  • the vitamin is preferably a fat soluble vitamin.
  • the fat-soluble vitamin component has almost no charged polar functional groups and is non-polar, so it is not necessary to adjust the pH, so pure water can be used without addition of acid or salt.
  • one further selected from the group consisting of alcohols having 3 to 5 carbon atoms is preferably used.
  • One kind selected from the group consisting of alcohols having 3 to 5 carbon atoms is a solvent which is not commonly used in liquid chromatography, but was used for analysis of vitamins in the present invention.
  • Elution power of the nonpolar component is isopropanol> methanol> acetonitrile in order to adjust the solvent mixing ratio accordingly.
  • the step (C) is made by a concentration gradient method, water: acetonitrile: methanol and ethanol selected from the group consisting of one: the volume ratio of one selected from the group consisting of alcohol having 3 to 5 carbon atoms is 2 to 15 : 25 to 35:15 to 65: 0 to 50.
  • the volume ratio of the solvent is from 2 to 15:25 to 35:15 to 65: 0 to 50 in the first step, and further 0 to 10 in the second step to wash the column : 0 to 35:15 to 55:40 to 55, and in the third step, it is preferably 0 to 15: 0 to 35:45 to 65: 0 to 55 in order to stabilize the column for the next sample analysis.
  • a concentration gradient method can be used.
  • the time for each step may be applied without particular limitation, and preferably the time of the first step is longer than the time of the second and third steps.
  • the first step may be represented by the first 5 minutes, the second step by 5 minutes to 6 minutes, the third step by 6 minutes, and the total elution time is 14
  • the first stage can be expressed as the first 10 minutes, the second stage as 10 minutes to 12 minutes, and the third stage can be expressed as a time after 12 minutes, and the first stage when the total elution time is 30 minutes.
  • the first 20 minutes, the second stage 20 minutes to 24 minutes, the third stage can be expressed as a time after 24 minutes, when the total elution time is 45 minutes, the first stage is the first 30 minutes, the second stage 30 minutes to 36 minutes, the third step may be expressed as a time after 36 minutes, but is not limited thereto.
  • the rest is as described above.
  • the relative standard deviation (RSD) of chromatography is within 2.0%, and the separation degree has an excellent effect of 1.5 or more.
  • the vitamin content of the multivitamin product in the form of medicines, health functional foods and cosmetics can be measured to check the quality and the vitamin content of the food raw materials.
  • Liquid chromatography as an analyzer was performed using Waters UPLC, and an ultraviolet absorbance photometer (UV 200 nm) was used as a detector, and the instrument operation and data processing were analyzed using Empower II software.
  • the flow rate of the mobile phase was 0.6 mL / min, the sample injection amount was 1 ⁇ L, and the column temperature was adjusted to 35 ° C.
  • Vitamin ingredients Concentration (mg / mL) Nicotinic acid amide 0.2 Pyridoxine hydrochloride 0.1 Thiamine Nitrate 0.2 Calcium Pantothenate 0.2 Ascorbic acid 0.2 Folic acid 0.08 Biotin 0.1 Riboflavin 0.1
  • Example. 1 Add phosphoric acid and ion pair reagents to methanol, acetonitrile and water as mobile phases
  • the organic solvent in the mobile phase was mixed with 0.3 parts by weight of phosphoric acid and 0.1 parts by weight of sodium 1-heptanesulfonate with respect to 100 parts by weight of acetonitrile and methanol mixed at a volume ratio of 4: 1.
  • Using 0.3 parts by weight, mixed with 0.1 parts by weight of 1-heptanesulfonic acid sodium, and mixed in a volume ratio over time as shown in Table 2 and flowing to the column and analyzed results are shown in FIG.
  • acetonitrile has a higher nonpolarity compared to methanol, so the elution is good, thereby shortening the retention time of the components in the column. This strong elution may lead to incomplete separation of folic acid and biotin.
  • Table 2 using 0.1 parts by weight of sodium 1-heptanesulfonate based on 100 parts by weight of methanol as a mobile phase organic solvent and 0.1 parts by weight of sodium 1-heptanesulfonate based on 100 parts by weight of water As shown in FIG. 4, the mixture is mixed in a volume ratio according to time and flowed into a column.
  • the retention time of the column in the vitamin component is increased, and the separation occurs to some extent, but the peak shape is not suitable for the analysis because the acid phosphoric acid is not added.
  • Example 1 Except that trifluoroacetic acid was used instead of phosphoric acid, the organic solution and the aqueous solution of Example 1 were used as a mobile phase, mixed in a volume ratio with time as shown in Table 2, and flowed into a column.
  • Example 1 As in Example 1 using phosphoric acid, it was confirmed that eight water-soluble vitamin components were properly separated in a short time.
  • Example 1 Except for using sodium 1-octane sulfonate as the ion-pair reagent, the organic solution and the aqueous solution of Example 1 as a mobile phase was mixed in a volume ratio over time as shown in Table 2 and flowed into the column and analyzed results Same as 6.
  • Example 1 Except for using sodium 1-pentanesulfonate as the ion-pair reagent, the organic solution and the aqueous solution of Example 1 as a mobile phase was mixed in a volume ratio over time as shown in Table 2 and flowed into the column and analyzed results Same as 7.
  • Example 1 Except for using sodium 1-hexanesulfonic acid as the ion-pair reagent, the organic solution and the aqueous solution of Example 1 as a mobile phase was mixed in a volume ratio over time as shown in Table 2 and flowed into the column and analyzed results Same as 8.
  • Water chromatography for water chromatography was performed using Waters UPLC, and an ultraviolet absorbance spectrophotometer (UV 200 nm) was used as a detector, and the instrument operation and data processing were analyzed using Empower II software.
  • the flow rate of the mobile phase was 0.6 mL / min, the sample injection amount was 1 ⁇ L, and the column temperature was adjusted to 35 ° C.
  • Ascorbic acid calcium pantothenate, nicotinic acid amide, pyridoxine hydrochloride, biotin, riboflavin, folic acid, thiamine, and fursultiamine were eluted as shown in Table 4 below, and the chromatogram is shown in FIG. 9.
  • the following experiment was performed to simultaneously analyze the fat-soluble vitamin components present in the sample using the organic solvent and water in the mobile phase.
  • Liquid chromatography as an analyzer was performed using Waters UPLC, and an ultraviolet absorbance photometer (UV 200 nm) was used as a detector, and the instrument operation and data processing were analyzed using Empower II software.
  • the flow rate of the mobile phase was 0.8 mL / min, the sample injection amount was 2 ⁇ L, and the column temperature was adjusted to 40 ° C.
  • vitamins were eluted in the order of cholecalciferol, ergocalciferol, alpha tocopherol acetate, phylloquinone, retinol palmitate, ubidecarenone, and the chromatogram is shown in FIG. 10.
  • the analysis was carried out by concentration gradient method using 0.05M aqueous ammonium acetate solution and methanol as mobile phase.
  • the volume ratio of the aqueous 0.05 M ammonium acetate solution and methanol was 92.5: 7.5 up to 0.29 minutes, 84:16 up to 0.31 minutes, and 70:30 up to 3 minutes.
  • the liquid chromatography as an analyzer was analyzed using Waters UPLC, and an ultraviolet absorbance photometer (UV 200 nm) was used as a detector, and the instrument operation and data processing were performed using Empower II software.
  • the flow rate of the mobile phase was 0.6 mL / min, the sample injection amount was 1 ⁇ L, and the column temperature was adjusted to 35 ° C.
  • the analysis was done by concentration gradient method using methanol, 0.1 M aqueous phosphoric acid solution and water.
  • the volume ratio of the methanol: 0.1 M phosphoric acid aqueous solution: water was 10: 90: 0 until the initial ⁇ 1.13 minutes, 40: 60: 0 for 1.29-2.26 minutes, and 40: 0: 60 for 2.42-3.22 minutes.
  • the liquid chromatography was analyzed using Waters UPLC, and the ultraviolet absorbance spectrometer (UV 200nm) was used as a detector, and the instrument operation and data processing were analyzed using Empower II software.
  • the flow rate of the mobile phase was 0.6 mL / min, the sample injection amount was 1 ⁇ L, and the column temperature was adjusted to 35 ° C.
  • Samples to be analyzed are complex vitamins (bluevitamins, manufactured by Kolmar) including ascorbic acid, calcium pantothenate, nicotinic acid amide, pyridoxine hydrochloride, thiamine hydrochloride, folic acid, biotin, cyanocobalamin, riboflavinbutyrate, cholecalciferol and tocopherol acetate It was set as.
  • the vitamin composition contained in the multivitamin complex 1 is shown in Table 10 below.
  • Vitamin ingredients Content in 1 tablet (1287 mg) Sample solution Water Soluble Vitamin Nicotinic acid amide 50 mg A Pyridoxine hydrochloride 5mg Thiamine Nitrate 60mg Ascorbic acid 600 mg Calcium Pantothenate 20mg Biotin 0.2mg B Folic acid 0.4mg Cyanocobalamin 0.024mg C Fat-soluble vitamins Riboflavin Butyrate 5mg D Alpha Tocopherol Acetate 20mg Cholecalciferol 0.00625mg E
  • Sample solutions A, B, C, D and E were prepared for one tablet of multivitamin of Table 10 above. That is, after dissolving the sample using water and methanol solvent, it was sonicated for 30 minutes at room temperature (25 °C). Thereafter, the solution was filtered through a 0.2 ⁇ m PVDF membrane filter to obtain a sample solution. 1 ⁇ L of the sample solution was injected into a nonpolar column (Acquity UPLC BEH C18, Waters, Inc.) filled with octadecylsilane (C18) having a column length of 5 cm, a column inner diameter of 2.1 mm, and a particle diameter of the column of 1.7 ⁇ m. It was.
  • a nonpolar column Acquity UPLC BEH C18, Waters, Inc.
  • Example 2 The same mobile phase as in Example 1 was used, as shown in Table 2 to adjust the volume ratio of the organic solution and the aqueous solution over time.
  • the fat-soluble vitamins contained in the complex vitamins do not have a large nonpolar component and many kinds, the same mobile phase as in Example 1 was used. .
  • Compound vitamins including ascorbic acid, calcium pantothenate, nicotinic acid amide, pyridoxine hydrochloride, thiamine hydrochloride, folic acid, biotin, cyanocobalamin, riboflavin, cholecalciferol, phylloquinone, tocopherol acetate, retinol and beta carotene Manufacture) was used as a sample to be analyzed.
  • the vitamin composition contained in the multivitamin complex 1 is shown in Table 15 below.
  • Vitamin ingredients Content in 1 tablet (1310 mg) Sample solution Water Soluble Vitamin Nicotinic acid amide 18mg A Pyridoxine hydrochloride 2.4mg Thiamine Nitrate 1.7mg Ascorbic acid 60mg Calcium Pantothenate 6.5mg Riboflavin 1.6mg Biotin 0.15mg B Folic acid 0.2mg Cyanocobalamin 0.001mg C Fat-soluble vitamins Retinol 0.6mg D Alpha Tocopherol Acetate 14.9mg Beta-carotene 1.2mg Phylloquinone 0.036 mg Cholecalciferol 0.005mg E
  • Sample solutions A, B, C, D and E were prepared for 1 tablet of the combined vitamins in Table 15 above. That is, after dissolving the sample using water, hexane and methanol solvent, it was sonicated for 30 minutes at room temperature (25 °C). Thereafter, a 0.2 ⁇ m PVDF membrane filter was filtered to obtain a sample solution. 1 ⁇ L of the sample solution was injected into a nonpolar column (Acquity UPLC BEH C18, Waters, Inc.) filled with octadecylsilane (C18) having a column length of 5 cm, a column inner diameter of 2.1 mm, and a particle diameter of the column of 1.7 ⁇ m. It was.
  • a nonpolar column Acquity UPLC BEH C18, Waters, Inc.
  • Example 2 The same mobile phase as in Example 1 was used, as shown in Table 2 to adjust the volume ratio of the organic solution and the aqueous solution over time.
  • the fat-soluble vitamin contained in the complex vitamin was used the same mobile phase as in Preparation Example 3, the volume ratio of the organic solution and the aqueous solution over time was used as shown in Table 6.
  • Vitamin ingredients Content in 1 tablet (1630 mg) Sample solution Water Soluble Vitamin Nicotinic acid amide 10mg A Pyridoxine hydrochloride 6mg Thiamine Nitrate 5mg Ascorbic acid 200 mg Calcium Pantothenate 17.2mg Riboflavin 12mg Biotin 0.1mg B Folic acid 0.4mg Cyanocobalamin 0.0049mg C Fat-soluble vitamins Retinol palmitate 2.35mg D Alpha Tocopherol Acetate 30mg Ubidecharenon 10mg Cholecalciferol 0.025mg Gamma-Orizanol 5mg Phylloquinone 0.055mg E
  • Sample solutions A, B, C, D and E were prepared for 1 tablet of the combined vitamins of Table 19. That is, after dissolving the sample using water, hexane and isopropanol solvent, it was sonicated for 30 minutes at room temperature (25 °C). Thereafter, the solution was filtered through a 0.2 ⁇ m PVDF membrane filter to obtain a sample solution. 1 ⁇ L of the sample solution was injected into a nonpolar column (Acquity UPLC BEH C18, Waters, Inc.) filled with octadecylsilane (C18) having a column length of 5 cm, a column inner diameter of 2.1 mm, and a particle diameter of the column of 1.7 ⁇ m. It was.
  • a nonpolar column Acquity UPLC BEH C18, Waters, Inc.
  • Example 2 The same mobile phase as in Example 1 was used, as shown in Table 2 to adjust the volume ratio of the organic solution and the aqueous solution over time.
  • the fat-soluble vitamin contained in the complex vitamin was used the same mobile phase as in Preparation Example 3, the volume ratio of the organic solution and the aqueous solution over time was used as shown in Table 6.
  • Liquid chromatographic analysis results of the sample solutions A, B, D and E of the vitamin of the complex vitamin of Experimental Example 3 are as Tables 20 to 23 below, and the chromatogram results are shown in FIGS. 19 to 22.
  • the present invention is a method for analyzing two or more vitamins at the same time using liquid chromatography, the present invention can quickly separate various kinds of vitamin components, high separation degree in the analysis of samples containing a large number of vitamin components useful.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 액체 크로마토그래피를 이용한 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서, (A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계; (B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및 (C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 거쳐 다양한 종류의 비타민 성분들을 신속하게 분리할 수 있으며, 분리도가 높아 다수의 비타민 성분을 포함하는 시료 분석에 유용하다.

Description

액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법
본 발명은 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법에 관한 것이다.
비타민은 동물의 정상적인 생명현상과 생산활동을 위해 소량으로 요구되는 분자량 1,000 이하의 상대적으로 작은 크기의 유기화합물이다. 상기 비타민은 1) 조효소 및 효소 보결 분자단의 필수적인 구성요소로서 영양소의 대사작용에 관계, 2) 시력, 골격형성, 번식 등의 생리현상에 중요한 역할, 3) 여러 영양소의 효율적인 이용을 돕는 역할, 4) 피부병, 빈혈, 신경증 등 여러 증상을 억제, 5) 성장률과 사료효율을 개선하여 생산성을 증진 등 다양한 역할을 수행한다.
앞서 살펴본 바와 같이 비타민은 인체의 정상적인 성장, 발달 및 건강 유지에 필수적인 영양소이지만, 체내에서는 거의 합성되지 않으므로 반드시 식품을 통해서만 섭취해야 한다. 그러나 현대인이 즐겨먹는 가공식품이나 인스턴트 식품은 자체 내 열량은 높지만 비타민 함량은 낮으므로 평소 이를 즐겨먹는 현대인의 경우 비타민이 부족하기 쉽다. 또한 쉽게 파괴되는 비타민의 성질로 인해 정상적인 식습관을 가지고 있더라도 조리 등의 과정에서 비타민이 파괴되어 섭취가 어려우며, 산업사회가 발달 할수록 수반되는 환경오염, 피로, 스트레스 등으로 인하여 체내 비타민의 소모량이 늘어나 신체의 건강한 상태를 유지하기 위해서는 별도의 비타민 섭취가 필수적인 상황이다.
이러한 비타민의 중요성으로 인하여 오래 전부터 종합 비타민이라고 하는 두 종 이상의 비타민을 함유하는 다양한 제품이 의약품, 건강기능식품, 화장품 등의 형태로 연구개발, 제조, 수입, 유통되어 왔으며 최근 들어 그 종류와 함량 그리고 첨가되는 비타민의 종류는 점점 더 증가하고 있는 추세이다.
올바른 연구개발과 제조를 위해서는 신속하고 정확한 비타민 분석이 필수적이지만, 대한민국 공개특허 제1998-0048347호 등에서 개시하고 있는 종래의 비타민 분석방법들은 개별적인 비타민 성분에 대한 분석방법만을 제공하고 있기 때문에 종합 비타민 제품 내에 포함되어 있는 다양한 비타민들에 대한 동시적이면서도 신속한 분석에 어려움이 있었다.
본 발명에 따른 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법은, 액체 크로마토그래피(LC)의 고정상 및 이동상을 조절함에 따라, 종합비타민 등 다수의 비타민 성분을 포함하는 제품의 비타민 성분들을 동시에 분석하고, 신속하게 분석 결과를 얻을 수 있는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 의하면, 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서,
(A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;
(B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및
(C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,
상기 유기용액은 아세토니트릴, 메탄올, 산 및 이온쌍 시약을 포함하고,
상기 수용액은 물, 산 및 이온쌍 시약을 포함하며,
상기 이온쌍 시약은 탄소수 7 내지 9인 알칸 설폰산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서,
(A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;
(B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및
(C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,
상기 유기용액은 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 및 아세토니트릴을 포함하고,
상기 수용액은 물인 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공한다.
상기의 과제 해결 수단에 따른 본 발명의 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법은 다양한 종류의 비타민 성분들을 신속하게 분리하여, 다수의 비타민 성분을 포함하는 시료에서 비타민 성분을 동시에 분석하는데 유용하다.
또한, 종합 비타민 제품 등 다수의 비타민 성분을 포함하는 제품의 연구개발이나 제조의 품질관리 시 함량분석을 통해 연구개발 및 제품 생산의 경제적 시간적 효율을 증대시킬 수 있다.
도 1은 실시예 1의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 2는 비교예 1의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 3은 비교예 2의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 4는 비교예 3의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 2의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 3의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 7은 비교예 4의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 8은 비교예 5의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 9는 제조예 2의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 10은 제조예 3의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 11은 비교예 6의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 12는 비교예 7의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 13은 실험예 1의 표 12의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 14는 실험예 1의 표 13의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 15는 실험예 1의 표 14의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 16은 실험예 2의 표 16의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 17은 실험예 2의 표 17의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 18은 실험예 2의 표 18의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 19는 실험예 3의 표 20의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 20은 실험예 3의 표 21의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 21은 실험예 3의 표 22의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
도 22는 실험예 3의 표 23의 크로마토그램을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명에 따른 2종 이상의 비타민의 동시 분석 방법을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다.
(A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;
(B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및
(C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,
상기 유기용액은 아세토니트릴, 메탄올, 산 및 이온쌍 시약을 포함하고,
상기 수용액은 물, 산 및 이온쌍 시약을 포함하며,
상기 이온쌍 시약은 탄소수 7 내지 9인 알칸 설폰산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공한다.
비타민은 효소의 중요한 활성성분으로 미량으로 동물의 영양을 지배하고 정상적인 생리 기능을 조절하며 완전한 물질 대사를 돕는다. 상기 비타민은 지용성 비타민과 수용성 비타민으로 나뉘며, 상기 비타민은 화학적 구조에 따라, 극성의 차이를 나타낸다. 이로 인해서 다양한 종류의 비타민 성분은 크로마토그래피 컬럼 내의 고정상에 대한 친화력의 차이를 야기하여, 컬럼 통과시간, 즉 머무름 시간(retention time)이 상기 비타민의 종류에 따라 다르게 나타난다.
상기 컬럼을 통과한 비타민 성분들은 머무름 시간에 따라 차례대로 자외부흡광광도계(UV) 상에서 흡광도의 증가로 인한 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 비타민은 표준물질과의 머무름 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 각 종류별 비타민의 양이 계산된다(정량분석).
상기 비타민은 수용성 비타민 및 지용성 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하고, 구체적으로 수용성인 아스코르브산(ascorbic acid, 비타민 C), 티아민(thiamine, 비타민 B1), 리보플라빈(riboflavin, 비타민 B2), 니아신(niacin, 비타민 B3, 니코틴산(nicotinic acid)과 니코틴산아미드(nicotinamide)를 총칭한다.), 판토텐산(pantothenic acid, 비타민 B5), 피리독신(pyridoxine, 비타민 B6), 비오틴(biotin, 비타민 B7), 폴산(엽산, folic acid, 비타민 B9 또는 비타민 M), 시아노코발라민(cyanocobalamin) 및 푸르설티아민(fursultiamine)과 지용성인 리보플라빈부티레이트(riboflavinbutyrate, 비타민 B2 활성형), 레티놀(retinol, 비타민 A), 레티놀팔미테이트(retinol palmitate, 비타민 A 활성형), 콜레칼시페롤(cholecalciferol, 비타민 D), 알파 토코페롤(alpha tocopherol, 비타민 E), 알파 토코페롤아세테이트(alpha tocopherol acetate, 비타민 E 활성형), 에르고칼시페롤(ergocalciferol), 베타카로틴(beta-carotene), 감마오리자놀(γ-oryzanol), 유비데카레논(ubidecarenone, CoQ-10) 및 필로퀴논(phylloquinone, 비타민 K)으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 비타민은 아스코르브산, 판토텐산, 니코틴산아미드, 피리독신, 비오틴, 리보플라빈, 폴산, 및 티아민을 포함하는 비타민, 또는 필로퀴논, 리보플라빈부티레이트, 콜레칼시페롤, 레티놀, 레티놀팔미테이트, 베타카로틴, 유비데카레논 및 알파토코페롤아세테이트를 포함하는 비타민이 좋지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 비타민을 포함하는 시료 용액에서 용매는 물, 메탄올, 이소프로판올, 헥산 또는 석유에테르 등일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 용액은 정제(tablet), 액체(liquid) 및 캡슐(capsule)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제품으로부터 상기 용매를 사용한 추출공정으로 제조될 수 있다.
비타민 성분들은 아민기, 히드록실기, 카르복실기, 아미드기 등을 갖는 유기화합물로서, 화학적 구조에 따라 극성 차이를 보이게 된다. 그러나 본 발명자들은 상기 비타민들의 대부분이 고정상으로 극성 컬럼 보다는 비극성 컬럼을 사용하는 경우 분리가 잘 된다라는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
상기 (B) 단계에서 사용되는 컬럼은 분석 시간을 최소로 하기 위하여 컬럼의 길이와 내경을 줄이고, 분리도를 확보하기 위하여 컬럼 내 충전 입자의 크기를 줄인 것으로, 컬럼을 통과하는 이동상 용액이나 시료 용액은 컬럼에 걸려 압력을 높이거나 분석에 영향을 줄 수 있는 불용성 미립자나 미생물을 함유하지 않아야 한다. 따라서, 고정상으로 비극성을 갖는 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8)으로 충전된 비극성 컬럼인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 화학적 성질이 비슷한 성분끼리 겹쳐져서 분리도가 감소되는 것을 방지하기 위하여, 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼인 것이 좋다. 상기 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼은 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18개 분자 사슬 작용기를 갖는 물질이 충전되어 있는 것으로 극성성분은 비극성의 컬럼 작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용리되고 비극성 성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용리된다.
상기 컬럼은 길이가 3 내지 30cm이고, 바람직하게는 3 내지 15cm이며, 내경이 1.8 내지 5mm이고, 상기 컬럼에 충전된 입자의 직경이 1.5 내지 5㎛인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상술한 규격을 만족하는 컬럼은 신속성 및 선택성이 우수하여, 비타민의 동시 분석 효율을 높일 수 있다.
상기 (C) 단계에서, 수용성 비타민 또는 지용성 비타민 성분의 분석시, 액체 크로마토그래피의 이동상으로는 유기용액 및 수용액을 포함하는 혼합용액을 사용하며, 각각의 유기용액과 수용액은 산과 이온쌍 시약을 포함한다. 상기 유기용액은 아세토니트릴 및 메탄올의 혼합용액이며, 보다 바람직하게는 상기 혼합용액은 아세토니트릴 및 메탄올을 2:1 내지 6:1의 부피비로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 혼합용액을 사용하는 경우, 극성도가 비슷한 비타민 성분들에 대한 분리가 우수하여, 다수의 비타민 성분을 동시에 분석하는데 효과적이다.
상기 (C) 단계에서 수용성 비타민 또는 지용성 비타민 성분의 분석시, 액체 크로마토그래피 이동상의 유속은 분석효율을 최대화하고 분석시간을 최소화하기 위하여 0.4 내지 1.5mL/min로 하는 것이 바람직하다.
상기 이동상 용액의 조성은 산을 사용하여 pH를 낮추면서 적절한 농도의 이온쌍 시약을 사용하여 비타민의 적절한 분리가 일어나도록 하였다.
상기 산은 인산, 트리플루오로아세트산, 아세트산, 포름산 및 헵타플루오로부티르산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 0.5 중량% 인산 및 트리플루오로아세트산인 것이 좋다. 상기 산은 이동상의 pH를 2 내지 3으로 유지시키므로 분석하려는 동일 성분 분자들의 전하 상태를 하나로 통일시켜주어 동일 분자들의 컬럼 내 이동속도 차이를 줄여주고 피크모양을 좁고 길게 만드는 작용을 하므로, 비분리 현상과 피크 일그러짐을 방지하고 피크간 분리도를 높이는 역할을 한다.
상기 이온쌍 시약은 탄소수 7 내지 9인 알칸 설폰산 나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 사용하고, 바람직하게는 1-헵탄설폰산 나트륨 및 1-옥탄설폰산 나트륨을 사용한다. 또한, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 0.2 중량%인 1-헵탄설폰산나트륨인 것이 좋다. 상기 이온쌍 시약의 탄소수가 9를 초과하면 분리시간이 길어지는 단점이 있다. 상기 이온쌍 시약은 음이온 계면활성제의 하나로 분자 내에 비극성 탄소 분자 사슬과 극성 작용기(설폰산 음이온)를 가지고 있다. 이온쌍 시약의 비극성 탄소 분자 사슬은 비극성의 고정상과 비극성결합을 하고 음이온을 갖는 극성 작용기는 분석하려는 물질 중 양전하를 띠는 이온과 정전기적 인력을 형성하여 결과적으로 양전하를 띠는 성분의 컬럼 내 유지시간을 길게 해주어 피크간 분리도를 높이고 피크의 대칭성을 확보할 수 있도록 보조하는 역할을 한다.
상기 비타민이 수용성 비타민인 경우, 상기 (C) 단계는 농도구배 방법으로 이루어지고, 상기 유기용액 및 수용액의 부피비는 0~45:55~100이며, 바람직하게는 제 3단계 이상으로 이루어질 수 있다. 상기 유기용액 및 수용액의 부피비는 제1 단계에서 0~15:85~100이고, 제2 단계에서는 5~15:85~95이고, 제3 단계에서는 10~55:45~90이고, 추가로 컬럼의 세척 및 다음 시료 분석을 위한 컬럼의 안정화를 위하여 제4 단계에서는 0~100:0~100인 것이 바람직하다. 각각의 단계에서 농도구배 방법을 사용할 수 있다.
상기 각 단계별 시간은 특별한 제한 없이 적용 가능하며, 바람직하게는 제 3단계의 시간을 제 1단계, 제 2단계 및 제 4단계의 시간보다 길게 한다. 본 발명의 전체 용리 시간을 5분으로 할 경우에 제 1 단계는 최초 1분, 제 2 단계는 1분에서 2분, 제 3 단계는 2분에서 4분, 제 4 단계는 4분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 15분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 3분, 제 2단계는 3분에서 6분, 제 3단계는 6분에서 13분, 제 4 단계는 13분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 30분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 7분, 제 2단계는 7분에서 13분, 제 3단계는 13분에서 27분, 제 4단계는 27분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 45분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 11분, 제 2단계는 11분에서 19분, 제 3단계는 19분에서 40분, 제 4단계는 41분 이후 시간으로 표현될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로,
(A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;
(B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체 크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및
(C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,
상기 유기용액은 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 및 아세토니트릴을 포함하고, 상기 수용액은 물인 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법을 제공한다.
상기 비타민은 바람직하게는 지용성 비타민이다.
지용성 비타민 성분은 전하를 띠는 극성 작용기를 거의 가지고 있지 않고 비극성이므로 pH를 조절할 필요가 없어 산이나 염 등의 첨가 없이 순수한 물만 사용할 수 있다. 비극성이 큰 지용성 비타민 성분을 용리시키기 위해 유기용매로 아세토니트릴, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이외에도 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 추가로 사용하며, 바람직하게는 아세토니트릴, 메탄올 및 이소프로판올을 사용한다. 상기 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종은 액체 크로마토그래피에서 흔히 사용하지 않는 용매이지만 본 발명에서는 비타민의 분석을 위하여 사용되었다. 비극성 성분의 용리력은 이소프로판올>메탄올>아세토니트릴 순이므로 이에 맞게 시간에 따른 용매 혼합비율을 조절한다.
상기 (C) 단계는 농도구배 방법으로 이루어지고, 물 : 아세토니트릴 : 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 : 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 부피비는 2~15:25~35:15~65:0~50 이다. 바람직하게는 1 단계 이상으로 이루어질 수 있으며, 용매의 부피비는 제 1단계에서 2~15:25~35:15~65:0~50 이고, 추가로 컬럼의 세척을 위하여 제 2단계에서 0~10:0~35:15~55:40~55 이고, 다음 시료 분석을 위한 컬럼의 안정화를 위하여 제 3단계에서 0~15:0~35:45~65:0~55인 것이 바람직하다. 각각의 단계에서 농도구배 방법을 사용할 수 있다.
상기 각 단계별 시간은 특별한 제한 없이 적용 가능하며, 바람직하게는제 1단계의 시간을 제 2단계 및 제 3단계의 시간보다 길게 한다. 본 발명의 전체 용리 시간을 7분으로 할 경우에 제 1 단계는 최초 5분, 제 2 단계는 5분에서 6분, 제 3 단계는 6분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 14분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 10분, 제 2단계는 10분에서 12분, 제 3단계는 12분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 30분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 20분, 제 2단계는 20분에서 24분, 제 3단계는 24분 이후 시간으로 표현될 수 있고, 전체 용리 시간을 45분으로 할 경우에 제 1단계는 최초 30분, 제 2단계는 30분에서 36분, 제 3단계는 36분 이후 시간으로 표현될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
기타 나머지 사항은 전술한 것과 같다.
본 발명의 분리 방법에 의하면 크로마토그래피의 상대표준편차(RSD)가 2.0% 이내이고, 분리도는 1.5 이상인 우수한 효과가 있다.
상기 비타민의 동시 분석 방법을 통하여, 의약품, 건강기능식품 및 화장품 형태인 종합비타민 제품의 비타민 함량을 측정하여 품질을 확인할 수 있고 식품 원료의 비타민 함량을 측정할 수 있다.
이하 본 발명의 구성을 아래의 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하지만 본 발명은 이들 예에 의해서만 반드시 한정되는 것은 아니다.
<제조예. 1> 수용성 비타민 분석을 위한 이동상의 최적 조건 선정
8종의 수용성 비타민을 포함하는 비타민 혼합용액을 하기 표 1과 같은 조성으로 제조한 후, 이것을 시료용액으로 하여 이동상의 최적 조건을 하기 표 2와 같이 선정하였다.
분석기기인 액체 크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계(UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower II 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.6mL/분이고, 시료 주입량은 1μL이며, 컬럼 온도는 35℃로 조절하였다.
표 1
비타민 성분 농도(mg/mL)
니코틴산아미드 0.2
피리독신염산염 0.1
티아민질산염 0.2
판토텐산칼슘 0.2
아스코르브산 0.2
폴산 0.08
비오틴 0.1
리보플라빈 0.1
표 2
시간(분) 유기용액(%) 수용액(%)
0 0 100
1.3 13 87
2.3 13 87
3.7 23 77
4.7 100 0
4.8 0 100
15 0 100
<실시예. 1> 이동상으로 메탄올, 아세토니트릴 및 물에 인산 및 이온쌍 시약을 첨가
이동상의 유기용매로 부피비 4:1로 혼합된 아세토니트릴 및 메탄올 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부, 1-헵탄설폰산나트륨 0.1 중량부를 혼합한 것을 사용하고, 수용액으로 물 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부, 1-헵탄설폰산 나트륨 0.1 중량부를 혼합한 것을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석한 결과는 도 1과 같다.
<비교예. 1> 이동상으로 메탄올 및 물에 인산을 첨가
이동상의 유기용매로 메탄올 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부를 혼합한 것을 사용하고 수용액으로 물 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부를 혼합한 것을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석한 결과는 도 2와 같다. 인산을 첨가하여 pH를 낮고 일정하게 유지시킨 만큼 분리도가 향상된 모습을 보이나, 낮은 pH에서 양이온을 띠는 비타민 성분들(니코틴산아미드, 피리독신)은 강한 극성으로 인해 컬럼 내 유지시간이 짧고 빠르게 용리되어 분리되지 않는 현상을 볼 수 있다.
<비교예. 2> 이동상으로 아세토니트릴 및 물에 인산을 첨가한 경우
이동상의 유기용매로 아세토니트릴 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부를 혼합한 것을 사용하고 수용액으로 물 100 중량부에 대하여 인산 0.3 중량부를 혼합한 것을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석한 결과는 도 3과 같다.
비교예 1과 마찬가지로 pH를 낮고 일정하게 유지시킨 만큼 분리도가 향상된 모습을 보이나, 낮은 pH에서 양이온을 띠는 비타민 성분들(니코틴산아미드, 피리독신)은 강한 극성으로 인해 컬럼 내 유지시간이 짧고 빠르게 용리되어 분리되지 않는 현상을 볼 수 있다.
또한 아세토니트릴은 메탄올에 비해 비극성이 더 크므로 용리력이 좋아 성분들의 컬럼 내 유지시간을 더 짧게 만든다. 이러한 강한 용리력으로 인해 폴산과 비오틴의 불완전한 분리현상을 볼 수 있다.
<비교예. 3> 이동상으로 메탄올 및 물에 이온쌍 시약을 첨가한 경우
이동상의 유기용매로 메탄올 100 중량부에 대하여 1-헵탄설폰산 나트륨 0.1 중량부를 혼합한 것을 사용하고 수용액으로 물 100 중량부에 대하여 1-헵탄설폰산 나트륨 0.1 중량부를 혼합한 것을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석한 결과는 도 4와 같다.
이온쌍 시약을 첨가한 만큼 비타민 성분의 컬럼 내 유지시간이 길어져 어느 정도 분리가 일어나는 효과는 있으나 산인 인산을 넣지 않아 피크모양이 분석에 적절하지 않음을 알 수 있다.
<실시예. 2> 산으로 트리플루오로아세트산을 사용한 경우
인산 대신 트리플루오로아세트산을 사용한 것을 제외하고는 이동상으로 실시예 1의 유기용액과 수용액을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘러주며 분석한 결과는 도 5와 같다.
인산을 사용한 실시예 1과 마찬가지로 8개의 수용성 비타민 성분이 빠른 시간 내에 적절히 분리된 것을 확인 할 수 있었다.
<다른 종류의 이온쌍 시약을 사용>
<실시예. 3> 이온쌍 시약으로 1-옥탄설폰산 나트륨을 사용한 경우
이온쌍 시약으로 1-옥탄설폰산 나트륨을 사용한 것을 제외하고는 이동상으로 실시예 1의 유기용액과 수용액을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘러주며 분석한 결과는 도 6과 같다.
전체적인 분석 양상은 양호하나 분석시간이 더 소요됨을 알 수 있었다.
<비교예. 4> 이온쌍 시약으로 1-펜탄설폰산 나트륨을 사용한 경우
이온쌍 시약으로 1-펜탄설폰산 나트륨을 사용한 것을 제외하고는 이동상으로 실시예 1의 유기용액과 수용액을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘러주며 분석한 결과는 도 7과 같다.
전체적인 분석 양상은 양호하나 판토텐산칼슘과 니코틴산아미드의 분리도가 적절치 않았다.
<비교예. 5> 이온쌍 시약으로 1-헥산설폰산 나트륨을 사용한 경우
이온쌍 시약으로 1-헥산설폰산 나트륨을 사용한 것을 제외하고는 이동상으로 실시예 1의 유기용액과 수용액을 사용하여 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘러주며 분석한 결과는 도 8과 같다.
티아민, 폴산, 비오틴의 분리도가 적절치 않았다.
<제조예. 2> 수용성 비타민 성분의 동시 분석
상기 실시예 1의 이동상을 상기 표 2와 같이 시간에 따른 부피비로 혼합하여 시료 내에 존재하는 수용성 비타민 성분들을 동시에 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
하기 표 3과 같이 수용성 비타민들을 물에 녹여 혼합용액을 제조하여 이를 시료용액으로서 분석하였을 때 비타민 성분들이 적절히 분리 분석되는 것을 확인할 수 있었다.
표 3
비타민 성분 농도(mg/mL)
니코틴산아미드 0.2
피리독신염산염 0.1
티아민질산염 0.2
판토텐산칼슘 0.2
아스코르브산 0.6
폴산 0.8
비오틴 0.2
리보플라빈 0.2
푸르설티아민 0.2
석기기인 액체 크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계(UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower II 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.6mL/분이고, 시료 주입량은 1μL이며, 컬럼 온도는 35℃로 조절하였다.
하기 표 4와 같이 아스코르브산, 판토텐산칼슘, 니코틴산아미드, 피리독신염산염, 비오틴, 리보플라빈, 폴산, 티아민, 푸르설티아민 순서로 비타민이 용리되었으며, 크로마토그램을 도 9에 나타내었다.
표 4
머무름시간(분) 비타민 성분
0.25 아스코르브산
1.19 판토텐산칼슘
1.43 니코틴산아미드
2.15 피리독신 염산염
2.33 비오틴
2.41 리보플라빈
2.71 폴산
3.56 티아민
4.54 푸르설티아민
<제조예. 3> 지용성 비타민 성분의 동시 분석
이동상의 유기용매 및 물을 이용하여 시료 내에 존재하는 지용성 비타민 성분들을 동시에 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
하기 표 5와 같이 지용성 비타민 성분들을 이소프로판올에 녹여 혼합용액을 제조하여 이를 시료용액으로 분석하였으며, 하기 표 6과 같이 이동상의 유기용액과 물을 시간에 따른 부피비로 혼합하여 컬럼에 흘려주며 분석하였을 때 비타민 성분들이 적절히 분리 분석되는 것을 확인할 수 있었다.
표 5 지용성 비타민 혼합용액 조성
비타민 성분 농도(mg/mL)
에르고칼시페롤 0.05
콜레칼시페롤 0.01
알파토코페롤아세테이트 0.2
필로퀴논 0.02
레티놀팔미테이트 0.05
유비데카레논 0.1
표 6
시간(분) 물(%) 아세토니트릴(%) 메탄올(%) 이소프로판올(%)
0 10 30 60 0
5 5 30 20 45
5.4 5 30 20 45
5.5 0 0 50 50
6.5 0 0 50 50
6.6 10 30 60 0
분석기기인 액체 크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계(UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower II 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.8mL/분이고, 시료 주입량은 2μL이며, 컬럼 온도는 40℃로 조절하였다.
하기 표 7과 같이 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 알파토코페롤아세테이트, 필로퀴논, 레티놀팔미테이트, 유비데카레논 순서로 비타민이 용리되었으며, 크로마토그램을 도 10에 나타내었다.
표 7
머무름시간(분) 비타민 성분
1.48 콜레칼시페롤
1.98 에르고칼시페롤
2.31 알파토코페롤아세테이트
2.51 필로퀴논
3.93 레티놀팔미테이트
5.37 유비데카레논
9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 분석 방법에 의하여 시료에 포함된 비타민의 성분을 분석하는 경우, 다양한 종류의 비타민 성분의 종류와 함량을 신속하게 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
<다른 종류의 이동상을 사용한 수용성 비타민의 동시 분석>
<비교예. 6> 이동상으로 0.05M 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올을 사용한 경우
상기 표 1과 같이 8종의 수용성 비타민을 포함하는 비타민 혼합용액을 제조한 후, 이것을 시료용액으로 사용하였다.
분석은 0.05M 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올을 이동상으로 사용하여 농도구배 방법으로 이루어졌다. 상기 0.05M 암모늄아세테이트 수용액과 메탄올의 부피비는 0.29분까지는 92.5:7.5, 0.31분까지는 84:16, 3분까지는 70:30의 부피비를 사용하였다.
분석기기인 액체 크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계 (UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower Ⅱ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.6mL/분이고, 시료 주입량은 1μL이며, 컬럼 온도는 35℃로 조절하였다.
분석 결과는 하기 표 8과 같으며 크로마토그램을 도 11에 나타내었다. 티아민과 피리독신이 분리되지 않았고, 니코틴산 아미드와 폴산도 적절한 분리도를 보이지 않았다.
표 8
머무름시간(분) 비타민 성분
0.27 아스코르브산
0.422 판토텐산칼슘
0.422 티아민 질산염
0.480 피리독신 염산염
0.508 폴산
0.558 니코틴산아미드
0.814 비오틴
2.418 리보플라빈
<비교예. 7> 이동상으로 메탄올, 0.1M 인산 수용액 및 물을 사용한 경우
상기 표 1과 같이 8종의 수용성 비타민을 포함하는 비타민 혼합용액을 제조한 후, 이것을 시료용액으로 사용하였다.
분석은 메탄올, 0.1M 인산 수용액 및 물을 사용하여 농도구배 방법으로 이루어졌다. 상기 메탄올 : 0.1M 인산 수용액 : 물의 부피비는 초기 ~ 1.13분까지는 10:90:0, 1.29 ~ 2.26분은 40:60:0, 2.42 ~ 3.22분은 40:0:60의 부피비를 사용하였다.
분석기기인 액체크로마토그래피는 워터스사의 UPLC를 사용하였고 검출기로 자외부흡광광도계 (UV 200nm)를, 기기 운용 및 데이터 처리는 Empower Ⅱ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이동상의 유속은 0.6mL/분이고, 시료 주입량은 1μL이며, 컬럼 온도는 35℃로 조절하였다.
분석 결과는 하기 표 9와 같으며, 크로마토그램을 도 12에 나타내었다. 판토텐산 칼슘과 티아민이 분리되지 않았고, 피리독신, 폴산 및 니코틴산 아미드도 적절한 분리도를 보이지 않았다.
표 9
머무름시간(분) 비타민 성분
0.241 아스코르브산
0.412 판토텐산칼슘
0.515 티아민 질산염
0.515 피리독신 염산염
0.600 니코틴산아미드
0.671 폴산
0.900 비오틴
2.809 리보플라빈
<실험예. 1> 복합비타민제의 분석(정제)
아스코르브산, 판토텐산칼슘, 니코틴산아미드, 피리독신염산염, 티아민염산염, 폴산, 비오틴, 시아노코발라민, 리보플라빈부티레이트, 콜레칼시페롤 및 토코페롤아세테이트을 포함하는 복합비타민제(푸른비타정, 한국콜마 제조)를 분석대상 시료로 하였다. 복합비타민제 1정에 함유되어 있는 비타민 조성은 하기 표 10과 같다.
표 10
비타민 성분 1정(1287mg) 중 함량 시료 용액
수용성비타민 니코틴산아미드 50mg A
피리독신염산염 5mg
티아민질산염 60mg
아스코르브산 600mg
판토텐산칼슘 20mg
비오틴 0.2mg B
폴산 0.4mg
시아노코발라민 0.024mg C
지용성비타민 리보플라빈부티레이트 5mg D
알파토코페롤아세테이트 20mg
콜레칼시페롤 0.00625mg E
상기 표 10의 복합비타민제 1정에 대해 시료 용액 A, B, C, D 및 E를 준비하였다. 즉, 물과 메탄올 용매를 사용하여 시료를 녹인 후 상온(25℃)에서 30분간 초음파 처리하였다. 그 후 0.2μm PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시료 용액을 얻었다. 상기 시료 용액을 컬럼 길이는 5cm, 컬럼 내경은 2.1mm이고, 컬럼에 충전된 입자의 직경은 1.7μm인 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼(Acquity UPLC BEH C18, 워터스사)에 1μL 주입하였다.
실시예 1과 동일한 이동상을 사용하였으며, 상기 표 2와 같이 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비를 조절하였다. 또한, 상기 복합비타민제에 포함된 지용성 비타민은 비극성이 큰 성분이 없고, 종류가 많지 않으므로 상기 실시예 1과 동일한 이동상을 사용하였으며, 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비는 하기 표 11과 같이 사용하였다.
표 11
시간(분) 유기용액(%) 수용액(%)
0 65 35
1 65 35
2 100 0
5 100 0
5.1 65 35
10 65 35
실험예 1의 복합비타민제의 비타민의 시료 용액 A, B 및 D의 액체 크로마토그래피 분석 결과는 하기 표 12 내지 14와 같으며, 크로마토그램을 도 13 내지 15에 도시하였다.
표 12
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
0.25 아스코르브산 612
1.21 판토텐산칼슘 21
1.45 니코틴산아미드 53
2.14 피리독신 5.1
3.54 티아민 61
표 13
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
2.79 비오틴 0.21
4.07 폴산 0.42
표 14
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
1.03 리보플라빈부티레이트 5.2
3.83 알파토코페롤아세테이트 21
<실험예. 2> 복합비타민제의 분석(정제)
아스코르브산, 판토텐산칼슘, 니코틴산아미드, 피리독신염산염, 티아민염산염, 폴산, 비오틴, 시아노코발라민, 리보플라빈, 콜레칼시페롤, 필로퀴논, 토코페롤아세테이트, 레티놀 및 베타카로틴을 포함하는 복합비타민제(센트룸정, 와이어스 제조)를 분석대상 시료로 하였다. 복합비타민제 1정에 함유되어 있는 비타민 조성은 하기 표 15와 같다.
표 15
비타민 성분 1정(1310mg) 중 함량 시료 용액
수용성비타민 니코틴산아미드 18mg A
피리독신염산염 2.4mg
티아민질산염 1.7mg
아스코르브산 60mg
판토텐산칼슘 6.5mg
리보플라빈 1.6mg
비오틴 0.15mg B
폴산 0.2mg
시아노코발라민 0.001mg C
지용성비타민 레티놀 0.6mg D
알파토코페롤아세테이트 14.9mg
베타카로틴 1.2mg
필로퀴논 0.036mg
콜레칼시페롤 0.005mg E
상기 표 15의 복합비타민제 1정에 대해 시료 용액 A, B, C, D 및 E를 준비하였다. 즉, 물,헥산 및 메탄올 용매를 사용하여 시료를 녹인 후 상온(25℃)에서 30분간 초음파 처리하였다. 그 후 0.2μm PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시료 용액을 얻었다. 상기 시료 용액을 컬럼 길이는 5cm, 컬럼 내경은 2.1mm이고, 컬럼에 충전된 입자의 직경은 1.7μm인 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼(Acquity UPLC BEH C18, 워터스사)에 1μL 주입하였다.
실시예 1과 동일한 이동상을 사용하였으며, 상기 표 2와 같이 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비를 조절하였다. 또한, 상기 복합비타민제에 포함된 지용성 비타민은 상기 제조예 3과 동일한 이동상을 사용하였으며, 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비는 상기 표 6과 같이 사용하였다.
실험예 2의 복합비타민제의 비타민의 시료 용액 A, B 및 D의 액체 크로마토그래피 분석 결과는 하기 표 16 내지 18과 같으며, 크로마토그램 결과를 도 16 내지 18에 도시하였다.
표 16
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
0.25 아스코르브산 63
1.21 판토텐산칼슘 6.8
1.45 니코틴산아미드 20
2.14 피리독신 2.7
2.40 리보플라빈 1.7
3.59 티아민 1.7
표 17
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
5.12 비오틴 0.15
7.27 폴산 0.21
표 18
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
0.40 레티놀 0.65
1.67 알파토코페롤아세테이트 15.0
1.89 필로퀴논 0.038
3.73 베타카로틴 1.3
<실험예 3> 복합비타민제의 분석(연질캡슐)
아스코르브산, 판토텐산칼슘, 니코틴산아미드, 피리독신염산염, 티아민염산염, 폴산, 비오틴, 시아노코발라민, 리보플라빈, 콜레칼시페롤, 필로퀴논, 감마오리자놀, 토코페롤아세테이트, 레티놀팔미테이트 및 유비데카레논을 포함하는 복합비타민제(큐엔타민, 알피코프 제조)를 분석대상 시료로 하였다. 복합비타민제 1정에 함유되어 있는 비타민 조성은 하기 표 19와 같다.
표 19
비타민 성분 1정(1630mg) 중 함량 시료 용액
수용성비타민 니코틴산아미드 10mg A
피리독신염산염 6mg
티아민질산염 5mg
아스코르브산 200mg
판토텐산칼슘 17.2mg
리보플라빈 12mg
비오틴 0.1mg B
폴산 0.4mg
시아노코발라민 0.0049mg C
지용성비타민 레티놀팔미테이트 2.35mg D
알파토코페롤아세테이트 30mg
유비데카레논 10mg
콜레칼시페롤 0.025mg
감마오리자놀 5mg
필로퀴논 0.055mg E
상기 표 19의 복합비타민제 1정에 대해 시료 용액 A, B, C, D 및 E를 준비하였다. 즉, 물, 헥산 및 이소프로판올 용매를 사용하여 시료를 녹인 후 상온(25℃)에서 30분간 초음파 처리하였다. 그 후 0.2μm PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시료 용액을 얻었다. 상기 시료 용액을 컬럼 길이는 5cm, 컬럼 내경은 2.1mm이고, 컬럼에 충전된 입자의 직경은 1.7μm인 옥타데실실란(C18)으로 충전된 비극성 컬럼(Acquity UPLC BEH C18, 워터스사)에 1μL 주입하였다.
실시예 1과 동일한 이동상을 사용하였으며, 상기 표 2와 같이 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비를 조절하였다. 또한, 상기 복합비타민제에 포함된 지용성 비타민은 상기 제조예 3과 동일한 이동상을 사용하였으며, 시간에 따른 유기용액 및 수용액의 부피비는 상기 표 6과 같이 사용하였다.
실험예 3의 복합비타민제의 비타민의 시료 용액 A, B, D 및 E의 액체 크로마토그래피 분석 결과는 하기 표 20 내지 23과 같으며, 크로마토그램 결과를 도 19 내지 22에 도시하였다.
표 20
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
0.25 아스코르브산 220
1.20 판토텐산칼슘 18
1.44 니코틴산아미드 11
2.13 피리독신 6.5
2.40 리보플라빈 13
3.57 티아민 5.3
표 21
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
5.02 비오틴 0.11
7.21 폴산 0.43
표 22
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
1.58 콜레칼시페롤 0.027
2.45 알파토코페롤아세테이트 34
2.78, 2.93, 3.19 감마오리자놀 5.4
4.05 레티놀팔미테이트 2.48
5.57 유비데카레논 11.2
표 23
머무름시간(분) 비타민 성분 분석결과(mg/1정)
1.94 필로퀴논 0.061
본 발명은 액체 크로마토그래피를 이용한 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서, 본 발명을 이용하면 다양한 종류의 비타민 성분들을 신속하게 분리할 수 있으며, 분리도가 높아 다수의 비타민 성분을 포함하는 시료 분석에 유용하다.

Claims (9)

  1. 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서,
    (A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;
    (B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및
    (C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,
    상기 유기용액은 아세토니트릴, 메탄올, 산 및 이온쌍 시약을 포함하고,
    상기 수용액은 물, 산 및 이온쌍 시약을 포함하며,
    상기 이온쌍 시약은 탄소수 7 내지 9인 알칸 설폰산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 포함하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 비타민은 수용성 비타민 또는 지용성 비타민이고,
    상기 유기용액은 아세토니트릴 및 메탄올을 2:1 내지 6:1의 부피비로 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 비타민은 수용성 비타민이고,
    상기 (C) 단계는 농도구배 방법으로 이루어지고,
    상기 유기용액 및 수용액의 부피비는 0~45:55~100인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 산은 인산 및 트리플루오로아세트산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
  5. 2종 이상의 비타민을 동시에 분석하는 방법으로서,
    (A) 2종 이상의 비타민을 포함하는 시료 용액을 준비하는 단계;
    (B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체크로마토그래피의 컬럼에 상기 시료 용액을 주입하는 단계; 및
    (C) 이동상으로서 유기용액 및 수용액을 흘려주는 단계를 포함하고,
    상기 유기용액은 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종, 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 및 아세토니트릴을 포함하고,
    상기 수용액은 물인 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 비타민은 지용성 비타민이고,
    상기 (C) 단계는 농도구배 방법으로 이루어지고,
    물 : 아세토니트릴 : 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 : 탄소수 3 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 부피비는 2~15:25~35:15~65:0~50 인것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
  7. 청구항 1 또는 청구항 5에 있어서,
    상기 비극성 컬럼은 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8)이 충전된 비극성 컬럼인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
  8. 청구항 1 또는 청구항 5에 있어서,
    상기 비타민은 아스코르브산, 티아민, 리보플라빈, 리보플라빈부티레이트, 니아신(니코틴산 및 니코틴산아미드), 판토텐산, 피리독신, 비오틴, 폴산, 레티놀, 푸르설티아민, 레티놀팔미테이트, 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 알파 토코페롤, 알파 토코페롤아세테이트, 베타카로틴, 시아노코발라민, 감마오리자놀, 유비데카레논 및 필로퀴논으로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 비타민인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
  9. 청구항 1 또는 청구항 5에 있어서,
    상기 컬럼은 길이가 3 내지 30cm, 내경이 1.8 내지 5mm이고,
    상기 컬럼에 충전된 입자의 직경이 1.5 내지 5㎛인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법.
PCT/KR2013/004429 2012-05-21 2013-05-21 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법 WO2013176454A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120053838 2012-05-21
KR10-2012-0053838 2012-05-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013176454A1 true WO2013176454A1 (ko) 2013-11-28

Family

ID=49624078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/004429 WO2013176454A1 (ko) 2012-05-21 2013-05-21 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101513872B1 (ko)
WO (1) WO2013176454A1 (ko)

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105136941A (zh) * 2015-10-22 2015-12-09 汤臣倍健股份有限公司 一种β-胡萝卜素的检测方法
CN105372374A (zh) * 2015-12-11 2016-03-02 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 奶粉中三种脂溶性维生素a,e和k1的检测方法
CN105510454A (zh) * 2015-11-24 2016-04-20 威海百合生物技术股份有限公司 一种快速检测保健品中维生素e的方法
CN106383191A (zh) * 2016-08-23 2017-02-08 国家烟草质量监督检验中心 一种尿液中d‑泛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法
CN106442790A (zh) * 2016-10-09 2017-02-22 汤臣倍健股份有限公司 一种b族维生素的检测方法
CN106814150A (zh) * 2017-01-23 2017-06-09 杭州佰辰医学检验所有限公司 一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素k1的方法
CN106908536A (zh) * 2017-02-28 2017-06-30 淮安市第人民医院 一种测定普庆溶液中多种水溶性维生素的方法
CN109060996A (zh) * 2018-09-07 2018-12-21 中国农业科学院生物技术研究所 玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法
CN109060991A (zh) * 2018-08-31 2018-12-21 深圳保时健生物工程有限公司 一种食品中维生素b6的含量测定方法
CN111141840A (zh) * 2019-12-18 2020-05-12 西安交通大学 一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法
CN112067722A (zh) * 2020-09-17 2020-12-11 天津天狮生物发展有限公司 增加骨密度营养高钙粉中维生素d2含量测定方法
CN112229933A (zh) * 2020-10-23 2021-01-15 南京玉鹤鸣医学营养科技股份有限公司 利用二维液相色谱测定维生素种类的方法
CN112730665A (zh) * 2020-12-22 2021-04-30 江苏艾兰得营养品有限公司 超高效液相色谱法测定维生素a含量的色谱方法
CN113156035A (zh) * 2021-04-14 2021-07-23 广州白云山汉方现代药业有限公司 一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素a含量测定的方法
CN113376285A (zh) * 2021-06-11 2021-09-10 贵州省产品质量检验检测院 测定婴幼儿食品和乳品中维生素b12添加量液相色谱法
CN113640395A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 深圳波顿香料有限公司 电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法
CN114371243A (zh) * 2021-12-28 2022-04-19 湖南中晟全肽生化有限公司 一种d-生物素的HPLC检测方法
CN114487193A (zh) * 2022-01-26 2022-05-13 北京振东光明药物研究院有限公司 一种同时测定多种水溶性维生素的方法
CN115112805A (zh) * 2022-07-30 2022-09-27 瑞普高科(天津)生物技术有限公司 一种烟酰胺含量的检测方法及其应用
CN115308329A (zh) * 2022-08-10 2022-11-08 中国海洋大学 同时测定6种维生素a族化合物的高效液相色谱检测方法
CN115308346A (zh) * 2022-09-02 2022-11-08 汤臣倍健股份有限公司 血液中多种维生素的提取及含量检测方法
CN117269375A (zh) * 2023-11-22 2023-12-22 湖南科锐斯医药科技有限公司 一种测定维生素a醋酸酯粉中有关物质的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108344821A (zh) * 2017-01-25 2018-07-31 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 生物样品中维生素a的液相串联质谱分析方法
CN107664672B (zh) * 2017-09-19 2020-05-29 山东世通检测评价技术服务有限公司 一种同步测定乳粉中l-抗坏血酸、d-抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的方法
CN110763788A (zh) * 2018-07-26 2020-02-07 深圳华大生命科学研究院 一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法
CN111380966A (zh) * 2018-12-28 2020-07-07 南京艾德凯腾生物医药有限责任公司 一种测定维生素k1原料药有关物质的方法
CN111693615B (zh) * 2019-09-30 2022-07-12 深圳奥萨制药有限公司 同时测定烟酸、维生素b1、b6和泛酸的分析方法
CN113687009A (zh) * 2021-05-31 2021-11-23 金川集团股份有限公司 一种烯丙基磺酸钠的高效液相色谱检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005085843A1 (ja) * 2004-03-03 2005-09-15 Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories, Inc. 唾液分析による脂溶性ビタミン及び／又は脂溶性フードファクターの検査方法
KR20070094050A (ko) * 2006-03-16 2007-09-20 재단법인서울대학교산학협력재단 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 가스가마이신 분석방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005085843A1 (ja) * 2004-03-03 2005-09-15 Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories, Inc. 唾液分析による脂溶性ビタミン及び／又は脂溶性フードファクターの検査方法
KR20070094050A (ko) * 2006-03-16 2007-09-20 재단법인서울대학교산학협력재단 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 가스가마이신 분석방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI, H. B. ET AL.: "Simultaneous Determination of Twelve Water- and Fat-soluble Vitamins by High-Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection", CHROMATOGRAPHIA 2001, vol. 54, no. 3/4, August 2001 (2001-08-01) *
MORENO, P. ET AL.: "Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 2000, pages 207 - 215 *

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105136941B (zh) * 2015-10-22 2017-01-25 汤臣倍健股份有限公司 一种β‑胡萝卜素的检测方法
CN105136941A (zh) * 2015-10-22 2015-12-09 汤臣倍健股份有限公司 一种β-胡萝卜素的检测方法
CN105510454A (zh) * 2015-11-24 2016-04-20 威海百合生物技术股份有限公司 一种快速检测保健品中维生素e的方法
CN105372374A (zh) * 2015-12-11 2016-03-02 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 奶粉中三种脂溶性维生素a,e和k1的检测方法
CN106383191A (zh) * 2016-08-23 2017-02-08 国家烟草质量监督检验中心 一种尿液中d‑泛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法
CN106442790A (zh) * 2016-10-09 2017-02-22 汤臣倍健股份有限公司 一种b族维生素的检测方法
CN106814150B (zh) * 2017-01-23 2020-07-07 杭州佰辰医学检验所有限公司 一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素k1的方法
CN106814150A (zh) * 2017-01-23 2017-06-09 杭州佰辰医学检验所有限公司 一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素k1的方法
CN106908536A (zh) * 2017-02-28 2017-06-30 淮安市第人民医院 一种测定普庆溶液中多种水溶性维生素的方法
CN109060991A (zh) * 2018-08-31 2018-12-21 深圳保时健生物工程有限公司 一种食品中维生素b6的含量测定方法
CN109060996A (zh) * 2018-09-07 2018-12-21 中国农业科学院生物技术研究所 玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法
CN109060996B (zh) * 2018-09-07 2021-06-11 中国农业科学院生物技术研究所 玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法
CN111141840A (zh) * 2019-12-18 2020-05-12 西安交通大学 一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法
CN111141840B (zh) * 2019-12-18 2021-06-29 西安交通大学 一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法
US11460451B2 (en) 2019-12-18 2022-10-04 Xi'an Jiaotong University Method for simultaneously determining fat-soluble vitamins and carotenoids in serum
CN113640395A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 深圳波顿香料有限公司 电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法
CN112067722A (zh) * 2020-09-17 2020-12-11 天津天狮生物发展有限公司 增加骨密度营养高钙粉中维生素d2含量测定方法
CN112229933A (zh) * 2020-10-23 2021-01-15 南京玉鹤鸣医学营养科技股份有限公司 利用二维液相色谱测定维生素种类的方法
CN112730665A (zh) * 2020-12-22 2021-04-30 江苏艾兰得营养品有限公司 超高效液相色谱法测定维生素a含量的色谱方法
CN113156035A (zh) * 2021-04-14 2021-07-23 广州白云山汉方现代药业有限公司 一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素a含量测定的方法
CN113376285A (zh) * 2021-06-11 2021-09-10 贵州省产品质量检验检测院 测定婴幼儿食品和乳品中维生素b12添加量液相色谱法
CN114371243A (zh) * 2021-12-28 2022-04-19 湖南中晟全肽生化有限公司 一种d-生物素的HPLC检测方法
CN114487193A (zh) * 2022-01-26 2022-05-13 北京振东光明药物研究院有限公司 一种同时测定多种水溶性维生素的方法
CN114487193B (zh) * 2022-01-26 2024-05-03 北京振东光明药物研究院有限公司 一种同时测定多种水溶性维生素的方法
CN115112805A (zh) * 2022-07-30 2022-09-27 瑞普高科(天津)生物技术有限公司 一种烟酰胺含量的检测方法及其应用
CN115308329A (zh) * 2022-08-10 2022-11-08 中国海洋大学 同时测定6种维生素a族化合物的高效液相色谱检测方法
CN115308329B (zh) * 2022-08-10 2023-10-27 中国海洋大学 同时测定6种维生素a族化合物的高效液相色谱检测方法
CN115308346A (zh) * 2022-09-02 2022-11-08 汤臣倍健股份有限公司 血液中多种维生素的提取及含量检测方法
CN117269375A (zh) * 2023-11-22 2023-12-22 湖南科锐斯医药科技有限公司 一种测定维生素a醋酸酯粉中有关物质的方法
CN117269375B (zh) * 2023-11-22 2024-02-13 湖南科锐斯医药科技有限公司 一种测定维生素a醋酸酯粉中有关物质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101513872B1 (ko) 2015-04-21
KR20130129865A (ko) 2013-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013176454A1 (ko) 액체 크로마토그래피를 이용한 비타민의 동시 분석 방법
WO2011062354A2 (ko) 인삼으로부터 신규 당지질단백질 진토닌을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 신규 당지질단백질 진토닌
WO2010134676A1 (en) Composition comprising the purified extract of bee venom for preventing and treating degenerative brain diseases
Fernández-López et al. Application of high-performance liquid chromatography to the characterization of the betalain pigments in prickly pear fruits
Gagnon et al. Conformational plasticity of IgG during protein A affinity chromatography
Jerz et al. Separation of betalains from berries of Phytolacca americana by ion-pair high-speed counter-current chromatography
Jin et al. Lepidiline C and D: Two new imidazole alkaloids from Lepidium meyenii Walpers (Brassicaceae) roots
WO2016068457A1 (ko) 탁산을 포함하는 경구 투여용 약학 조성물
WO2005113101A8 (de) Verfahren zur herstellung von chemischen und pharmazeutischen produkten mit integrierter mehrsäulen-chromatographie
WO2012173458A2 (ko) 식물 세포 내에 안정화된 활성 물질 및 그 제조방법
WO2015072678A1 (ko) 옥수수수염 유래 메이신을 포함하는 유효물질의 고수율 추출방법
WO2016052894A1 (ko) 효소 복합물을 이용한 식물 효소분해물의 제조방법
WO2013119034A1 (en) An apparatus for continuous separation of valine and a method for continuous separation of valine using the same
He et al. On-line coupling of hydrophobic interaction column with reverse phase column-charged aerosol detector/mass spectrometer to characterize polysorbates in therapeutic protein formulations
CZ293243B6 (cs) Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů
WO2020050462A1 (ko) 결명 새싹 유래 나프토파이론 유도체를 포함하는 신경세포 보호용 조성물
Abidi et al. Capillary electrochromatographic evaluation of vitamin E-active oil constituents: tocopherols and tocotrienols
WO2014003232A1 (ko) 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물
Okinyo-Owiti et al. Simulated moving bed purification of flaxseed oil orbitides: unprecedented separation of cyclolinopeptides C and E
Iwata et al. Determination of vitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D3 in sera by column-switching high performance liquid chromatography with fluorescence detection
Michel et al. Isolation and determination of carbendazim residue from wheat grain by matrix solid‐phase dispersion and HPLC
Dai et al. A one-step sample pretreatment and loading method for complex sample separation with supercritical fluid chromatography
Murgia et al. Amino acid sequence and function of a new α-toxin from the Amazonian scorpion Tityus cambridgei
WO2021040465A1 (ko) 수용성 고분자 셀룰로오스 및 계면활성제를 포함하는 분진 침강용 버블 제조용 조성물
WO2015105359A1 (ko) 참기름 및 이의 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13794185

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13794185

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1