CN113156035A - 一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素a含量测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品包括特殊医学用途配方食品的质量标准及其检测技术领域，公开了一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，以乙腈‑异丙醇混合溶剂为流动相A，乙腈为流动相B，在反相分析柱中进行梯度洗脱，测定全反式维生素A含量，解决现有技术对全反式维生素A的测定存在步骤繁琐、耗时长、精度低、效果差等问题。
Description
技术领域
本发明属于食品包括特殊医学用途配方食品的质量标准及其检测技术领域，具体涉及一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法。
背景技术
特殊医学用途配方食品近几年随着国家相应政策陆续出台，成为食品行业的新业态，带给消费者及患者更多的选择，不限于选择国外进口产品。这类产品的品质有无差异，成为消费者关心和选择的重点。维生素A作为维生素类营养素之一，被广泛应用到配方食品中。维生素A具有多种生理功能，摄入适量的维生素A对视力、生长、上皮组织及骨骼的发育、精子的生成和胎儿的生长发育都是必需的。维生素A的性质不稳定，不利于运输和产品的加工。目前市场上提供维生素A的原料，是以维生素A醋酸酯或维生素A棕榈酸酯的形式，添加符合食品质量规格要求的食用淀粉、糊精、抗氧化剂等辅料加工而成的食品添加剂进行销售和贮运，因维生素A棕榈酸酯的稳定性较维生素A醋酸酯好，故受到大多数产品开发者的青睐。市售的维生素A棕榈酸酯主要通过化学合成的方法制得，涉及复杂的反应过程及苛刻的反应条件，容易产生异构体，主要以全反式构型存在及少量顺式异构体，全反式结构具备活性。按GB29922食品安全国家标准特殊医学用途配方食品通则的规定，维生素A活性以RE(视黄醇当量)表示，即1μg RE相当于1μg全反式视黄醇(维生素A)，维生素A只包括预先形成的视黄醇，在计算和声称维生素A活性时不包括任何的类胡萝卜素组分。目前，研究市售维生素A棕榈酸酯中全反式维生素A棕榈酸酯和顺式异构体含量测定的文献较少，只有采用正相色谱系统将全反式维生素A棕榈酸酯和顺式异构体达到完全分离的实例，采用反相色谱系统的法定标准如GB5009.82中规定的色谱条件，不适用于分离全反式维生素A和顺式异构体，全反式维生素A和顺式异构体达不到基线分离，而且，GB5009.82中试样前处理操作，从皂化、提取(有液-液萃取或固-液淋洗)、洗涤、浓缩、定容、最后测定，步骤繁琐，耗时长，造成成份损失，未能准确测定目前新开发的产品中全反式维生素A的含量。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术对全反式维生素A的测定存在步骤繁琐、耗时长、准确度低、分离效果差等问题，提供了一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，以乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相A，乙腈为流动相B，在反相分析柱中进行梯度洗脱，测定全反式维生素A含量。
目前市面上几乎所有含维生素A的产品中均有不定量的全反式维生素A，例如广州白云山汉方现代药业有限公司自主研发的全营养乳，是适用于10岁以上人群的一款特殊医学用途全营养配方食品。该产品中全反式维生素A的来源，是市售的维生素A棕榈酸酯，其全反式维生素A的含量测定面临未能准确可靠地检测。
HPLC法中正相色谱流动相洗脱液是采用非极性溶剂，对仪器的管道、在线过滤装置要求高，成本相应较高，此外，经实践证实正相色谱在流动相洗脱过程中，对流动相的变化具较高的敏感性，色谱基线噪音较大，不利于有效成分的检测；正相色谱使用的固定相为极性硅胶或者是极性基团改性的硅胶，使用过程容易变形或者基团脱离受损，加上在使用过程受污染，不适宜采用极性的洗脱液冲洗，导致难于恢复原来的分辨能力，使用寿命短，费用相对高，不利于推广应用。
本申请发明人通过查阅文献资料，整理分析并经过大量的实验，开发了一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，发现当以乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相A，乙腈为流动相B，在反相分析柱中进行梯度洗脱时，能够精准地测定全反式维生素A含量。本发明解决了全反式维生素A检测不准确的问题，为同类别的特殊医学配方食品如全营养粉等产品，或普通食品中有效活性成分的含量，提供一种有效准确的检测方法，为这类产品制订质量标准提供有用的参考依据。
优选的，以体积比为7～9:1～3的乙腈-异丙醇混合溶剂为所述流动相A，乙腈为所述流动相B，进行所述梯度洗脱；所述反相分析柱为常规C18分析柱。
本发明中反相液相色谱条件，固定相为常规的C18分析柱，流动相系统简单易得，只需两种常用色谱试剂所构成，克服了正相色谱系统的局限性。实验表明，以体积比为7～9:1～3的乙腈-异丙醇混合溶剂为所述流动相A，乙腈为所述流动相B，进行所述梯度洗脱时，能使全反式维生素A得到有效的分离。
优选的，以体积比为8:2的乙腈-异丙醇混合溶剂为所述流动相A，乙腈为所述流动相B，进行所述梯度洗脱。
实验进一步表明，流动相A选择为以体积比为8：2的乙腈-异丙醇混合溶剂时，全反式维生素A的分离能得到显著的提升，认为是较优的选择。
优选的，所述梯度洗脱的具体操作为：在0～2min，所述流动相A与所述流动相B的初始体积比为0:100；在2～42min，所述流动相A与所述流动相B的体积比由0:100，线性匀速变化至30:70；42～52min，所述流动相A与所述流动相B的体积比保持30:70；52～54min，所述流动相A与所述流动相B的体积比由30:70，线性匀速变化至0:100；54～62min，所述流动相A与所述流动相B的体积比保持0:100。
优选的，所述梯度洗脱的检测波长为325nm，流速为2.0mL/min，进样体积为20μL，柱温为20～33℃。
优选的，所述梯度洗脱前进行试样溶液制备，具体为：称取试样，置于具塞试管中，加入正已烷，第一次涡旋振荡提取，加入无水乙醇，第二次涡旋振荡提取，混合均匀，取出，打开塞子放气，立即密塞，静置至完全分层；吸取上清液，进行氮吹干，留下遗留物，加入异丙醇溶解所述遗留物，得到试样溶液。
分两步涡旋振荡目的是借助外力使样品混匀，促使溶剂穿透溶质中达到提取的目的，同时促使溶解于水的成分或者蛋白质成分沉淀到水层，最终使目标成分完全转入正已烷层。在振荡过程中，有机溶剂会形成少量的气排出。
本发明中样品前处理方法，采用涡旋振荡器提取技术，提取样品中的有效成分，简便快速，耗时短，经济适用，可操作性强，既克服人为操作可能造成的误差，又节约时间成本，普及性好。
优选的，吸取所述上清液的量为所述正已烷加入量的四分之一，所述氮吹干的温度条件为40℃以下，所述异丙醇的加入量与所述试样的体积质量比为2ml：10g。
优选的，所述试样与所述正已烷的质量体积比为10g：15～25ml；所述试样与所述无水乙醇的质量体积比为10g：15～30ml；振荡为涡旋振荡器振荡，速度为1800～2200r/min，第一次涡旋振荡提取的时间为4～6min，第二次涡旋振荡提取的时间为2～4min。
优选的，所述梯度洗脱后，记录色谱图，根据全反式维生素A棕榈酸酯对照品的保留时间进行定性，由标准曲线求得试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，按下式计算出反式维生素A含量：
式中：
X——试样中反式维生素A含量，单位为微克每百克(μg/100g)；
ρ——试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V——样品稀释倍数；
m——试样质量，单位为克(g)；
100——换算百分率系数；
0.5455——转换因子(全反式维生素A分子量与全反式维生素A棕榈酸酯分子量的比值)。
优选的，所述标准曲线由标准曲线液在相同条件下梯度洗脱获得，所述标准曲线液的制备包括：
A、精密称取全反式维生素A棕榈酸酯对照品10mg，用异丙醇溶解定容至50mL，得浓度为200μg/mL的标准储备液；
B、精密吸取所述标准储备液1.0mL，加异丙醇稀释至20mL，制得浓度为10μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅴ；
C、精密吸取所述标准曲线液Ⅴ2.0mL，加异丙醇稀释至5mL，制得浓度为4μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅳ；
D、精密吸取所述标准曲线液Ⅴ2.0mL，加异丙醇稀释至10mL，制得浓度为2μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅲ；
E、精密吸取所述标准曲线液Ⅴ2.0mL，加异丙醇稀释至20mL，制得浓度为1μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅱ；
F、精密吸取所述标准曲线液Ⅴ2.0mL，加异丙醇稀释至50mL，制得浓度为0.4μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅰ。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
(1)本发明中建立的样品前处理方法，在特殊医学用途配方食品系列产品中首次采用了涡旋振荡器提取有效成分，利用其电子控制振荡力度和速度，边振荡边旋涡使样品中包合的有效成分在短时间内释放出来，有效地被有机溶剂充分提取分离，达到准确检测的目的，既可以避免人手力度和速度上的差异，也排除了人手振荡可能造成提取不均匀不完全的差异，在提取时间及效果的控制方面能得到一致性。
(2)本发明采用的分析色谱柱为常规C18柱，相对于上世纪90年代开发成功的，应用在类胡萝卜素及其异构体的分离的C30柱，成本低，推广应用性强。
(3)本发明的液相色谱条件，可靠有效，相对于正相色谱成本低，推广应用性强；
(4)本发明的液相色谱条件，也适用于特殊医学用途食品的其他类别剂型产品，如全营养粉中全反式维生素A的含量检测；
(5)本发明能为特殊医学用途食品系列产品的质量控制、质量标准的制定提供有利的数据支持，对特殊医学用途食品系列产品的工艺开发起到重要的指导作用；
(6)本发明具有方便、快捷、精密度高、重现性好等优点，可准确可靠的检测全反式维生素A的含量，对特殊医学用途食品系列产品的质量控制起到重要的指导性作用。
附图说明
图1为为HPLC专属性试验色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，包括以下步骤：
1、试样溶液制备：精密称取试样10g，置100mL具塞试管中，精密加入正已烷20mL，以2000r/min的速度于涡旋振荡器上提取5min，加入无水乙醇20mL，于涡旋振荡器同等条件下提取2min，混合均匀，取出，打开塞子放气，立即密塞，静置至完全分层；精密吸取上清液5.0ml，在不超过40℃条件下氮吹干，精密加入异丙醇2.0mL溶解遗留物，得到试样溶液。
2、高效液相色谱条件
流动相：以体积比为9:1的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～2min，流动相A与流动相B的初始体积比为0:100，2～42min，随后由初始比线性匀速变化至30:70；42～52min，流动相A与流动相B的体积比保持30:70；52～54min，流动相A与流动相B的体积比由30:70，线性匀速变化至0:100；54～62min，流动相A与流动相B的体积比保持0:100；
色谱柱：5HC-C18(2)分析柱(Agilent，规格4.6×250mm)
检测波长：325nm；
流速：2.0mL/min；
进样体积：20μL
柱温：27℃；
3、标准溶液的制备
(1)对照品储备液的制备：
精密称取全反式维生素A棕榈酸酯对照品10mg，用异丙醇溶解定容至50mL，得浓度为200μg/mL的标准储备液。
(2)标准曲线溶液的配制
精密吸取对照品储备液1.0mL，加异丙醇稀释至20mL，制得浓度为10μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅴ。
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至5mL，制得浓度为4μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅳ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至10mL，制得浓度为2μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅲ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至20mL，制得浓度为1μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅱ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至50mL，制得浓度为0.4μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅰ；
4、记录色谱图，根据全反式维生素A棕榈酸酯对照品的保留时间进行定性，由标准曲线求得试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，按下式计算出反式维生素A含量。
式中：
X——试样中反式维生素A含量，单位为微克每百克(μg/100g)；
ρ——试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V——样品稀释倍数；
m——试样质量，单位为克(g)；
100——换算百分率系数；
0.5455——转换因子(全反式维生素A分子量与全反式维生素A棕榈酸酯分子量的比值)
实施例2
一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，包括以下步骤：
1、试样溶液的制备：精密称取试样10g，置100mL具塞试管中，精密加入正已烷20mL，以2000r/min的速度于涡旋振荡器上提取5min，加入无水乙醇20mL，于涡旋振荡器同等条件下提取2min，混合均匀，取出，打开塞子放气，立即密塞，静置至完全分层；精密吸取上清液5.0ml，在不超过40℃条件下氮吹干，精密加入异丙醇2.0mL溶解遗留物，得到试样溶液。
2、高效液相色谱条件
流动相：以体积比为8:2的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～2min，流动相A与流动相B的初始体积比为0:100，2～42min，随后由初始比线性匀速变化至30:70；42～52min，流动相A与流动相B的体积比保持30:70；52～54min，流动相A与流动相B的体积比由30:70，线性匀速变化至0:100；54～62min，流动相A与流动相B的体积比保持0:100；
色谱柱：5HC-C18(2)分析柱(Agilent，规格4.6×250mm)
检测波长：325nm；
流速：2.0mL/min；
进样体积：20μL
柱温：27℃；
3、标准溶液的制备
(1)对照品储备液的制备：
精密称取全反式维生素A棕榈酸酯对照品10mg，用异丙醇溶解定容至50mL，得浓度为200μg/mL的标准储备液。
(2)标准曲线溶液的配制
精密吸取对照品储备液1.0mL，加异丙醇稀释至20mL，制得浓度为10μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅴ。
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至5mL，制得浓度为4μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅳ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至10mL，制得浓度为2μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅲ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至20mL，制得浓度为1μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅱ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至50mL，制得浓度为0.4μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅰ；
4、记录色谱图，根据全反式维生素A棕榈酸酯对照品的保留时间进行定性，由标准曲线求得试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，按下式计算出反式维生素A含量。
式中：
X——试样中反式维生素A含量，单位为微克每百克(μg/100g)；
ρ——试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V——样品稀释倍数；
m——试样质量，单位为克(g)；
100——换算百分率系数；
0.5455——转换因子(全反式维生素A分子量与全反式维生素A棕榈酸酯分子量的比值)。
实施例3
一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，包括以下步骤：
1、试样溶液的制备：精密称取试样10g，置100mL具塞试管中，精密加入正已烷20mL，以2000r/min的速度于涡旋振荡器上提取5min，加入无水乙醇20mL，于涡旋振荡器同等条件下提取2min，混合均匀，取出，打开塞子放气，立即密塞，静置至完全分层；精密吸取上清液5.0ml，在不超过40℃条件下氮吹干，精密加入异丙醇2.0mL溶解遗留物，得到试样溶液。
2、高效液相色谱条件
流动相：以体积比为7:3的乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～2min，流动相A与流动相B的初始体积比为0:100，2～42min，随后由初始比线性匀速变化至30:70；42～52min，流动相A与流动相B的体积比保持30:70；52～54min，流动相A与流动相B的体积比由30:70，线性匀速变化至0:100；54～62min，流动相A与流动相B的体积比保持0:100；
色谱柱：5HC-C18(2)分析柱(Agilent，规格4.6×250mm)
检测波长：325nm；
流速：2.0mL/min；
进样体积：20μL
柱温：27℃；
3、标准溶液的制备
(1)对照品储备液的制备：
精密称取全反式维生素A棕榈酸酯对照品10mg，用异丙醇溶解定容至50mL，得浓度为200μg/mL的标准储备液。
(2)标准曲线溶液的配制
精密吸取对照品储备液1.0mL，加异丙醇稀释至20mL，制得浓度为10μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅴ。
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至5mL，制得浓度为4μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅳ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至10mL，制得浓度为2μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅲ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至20mL，制得浓度为1μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅱ；
精密吸取标准曲线Ⅴ溶液2.0mL，以异丙醇稀释至50mL，制得浓度为0.4μg/mL的对照液；作为标准曲线液Ⅰ；
4、记录色谱图，根据全反式维生素A棕榈酸酯对照品的保留时间进行定性，由标准曲线求得试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，按下式计算出反式维生素A含量。
式中：
X——试样中反式维生素A含量，单位为微克每百克(μg/100g)；
ρ——试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V——样品稀释倍数；
m——试样质量，单位为克(g)；
100——换算百分率系数；
0.5455——转换因子(全反式维生素A分子量与全反式维生素A棕榈酸酯分子量的比值)
实施例4
液相色谱条件的选择
HPLC法中正相色谱流动相洗脱液是采用非极性溶剂，对仪器的管道、在线过滤装置要求高，成本相应较高，此外，经实践证实正相色谱在流动相洗脱过程中，对流动相的变化具较高的敏感性，色谱基线噪音较大，不利于有效成分的检测；正相色谱使用的固定相为极性硅胶或者是极性基团改性的硅胶，使用过程容易变形或者基团脱离受损，加上在使用过程受污染，不适宜采用极性的洗脱液冲洗，导致难于恢复原来的分辨能力，使用寿命短，费用相对高，不利于推广应用，这是正相色谱不足之处，再考虑产品处方含多组分的营养成分，一般不建议采用正相色谱进行检测营养成分的含量。所以开发反相色谱条件，比较适合对处方多组分的食品进行成分的检测。
已有的文献中，多数是运用反相HPLC法测定维生素A棕榈酸酯的含量，实质上是测定了全反式维生素A棕榈酸酯及其异构体两种成分的总和，并未针对全反式维生素A棕榈酸酯及其异构体两种构型进行分离研究；测定维生素A棕榈酸酯的流动相有甲醇、甲醇-水、乙腈、乙腈-甲醇、乙腈-水；本申请发明人除了按各文献的描述进行实验，还经过大量的摸索实验，采用全反式维生素A棕榈酸酯与其相邻色谱峰(顺式异构体)的分离度做为评价分离性能指标，进行比较各色谱条件的优劣，统计列表见表1，分离度被认可标准为大于或等于1.5。
表1
由实验结果可知，本发明运用的反相HPLC，对特殊医学用途配方食品中全反式维生素A进行含量测定的方法，能够使维生素A两种异构体达到完全分离，是目前首次开发的较优测定方法。其中，以体积比为7～9:1～3的乙腈-异丙醇混合溶剂为所述流动相A，乙腈为所述流动相B，进行所述梯度洗脱时，能使全反式维生素A得到有效的分离。而当流动相A选择为以体积比为8：2的乙腈-异丙醇混合溶剂时，全反式维生素A的分离能得到显著的提升，认为是较优的选择。
实施例5
试样前处理条件的确定
经查阅文献，可知含维生素A的产品一般有配方简单的药品，配方较简单的保健食品，配方复杂的普通食品及特殊医学用途配方食品。针对不同配方的产品，测定其中维生素A的含量时，采用的样品前处理方法，如药品类，直接加水溶解稀释后用有机溶剂萃取目标成分可达到目的；对于微胶囊型包埋微生素A的保健食品，用适宜浓度的氨水溶液破坏微胶囊结构，再用有机溶剂萃取目标成分；对配方复杂的普通食品或特殊医学用途配方食品，如粉剂、乳及乳制品等，较多研究者参考GB5009.82皂化、提取(有液-液萃取或固-液淋洗)、洗涤、浓缩、定容、最后测定，整个操作过程繁琐，耗时长，得到的目标成分损失较大，测定结果偏低，测定重现性差，RSD为3.6％，结果见表2；另外，加上测定的色谱条件具局限性，不排除测定的结果包含了维生素A的两种构型的成分总和，而未完全按GB29922中规定的以全反式维生素A作为活性成分报出其含量数据，除非产品配方中使用的原料所含维生素A均为全反式维生素A，但目前市售的原料均含有维生素A两种异构体，并且产品在贮存过程中，会出现维生素A两种异构体并存的情况。本申请发明人经大量的实验，将结果进行比较分析，最终开发了本发明，其最优的样品前处理条件以及色谱测定条件同实施例2，测定结果见表2。本发明的前处理条件中，因正已烷纯度比石油醚高，故选择正已烷为提取溶剂，避免溶剂的纯度对目标成分的测定造成干扰。
表2两种方法分别测定同一批样品中全反式维生素A含量结果的比较
实施例6
试样测试浓度的确定
取同一批全营养乳样品，,正己烷加入量分别设置为15mL、20mL、25mL，其他条件同实施例2，进行测定并计算全反式维生素A的含量，结果见表3。
表3样品测试浓度的考察结果
实施例7
涡旋振荡速度的确定
取同一批全营养乳样品，涡旋振荡速度分别设定1800r/min、2000r/min、2200r/min，其他条件同实施例2，进行测定并计算全反式维生素A的含量，结果见表4。
表4样品测试浓度的考察结果
实施例8
涡旋振荡提取时间
取同一批全营养乳样品，加20mL正己烷后，分别设定涡旋振荡提取时间为4min、5min、6min，其他条件同实施例2，进行测定并计算全反式维生素A的含量，结果见表5。
表5不同涡旋振荡提取时间的考察结果
实施例9
加入无水乙醇20mL后，涡旋振荡器混合处理时间的考察
取同一批全营养乳样品，加20mL无水乙醇后，分别设定按不同的涡旋振荡处理时间为2min、3min、4min，其他条件同实施例2，进行测定，结果见表6。
表6加入20mL无水乙醇后不同涡旋振荡混合处理时间的考察结果
实施例10
试样前处理条件中加入无水乙醇体积的确定
取同一批全营养乳样品，称取样品后，无水乙醇加入量分别按10mL、15mL、20mL、30mL，其他条件同实施例2，进行测定并计算全反式维生素A的含量，结果见表7。
表7加入不同体积的无水乙醇考察结果
实施例11
检测方法专属性及系统适应性
分别取空白溶剂、阴性试样溶液、标准曲线液Ⅱ、试样溶液、试样加标溶液五份溶液各进样20μL，其他条件同实施例2，进行测定，测定的专属性色谱图见图1。
测定结果可知，空白溶剂与阴性试样溶液在全反式维生素A棕榈酸酯主峰位置未检出明显的色谱峰，无干扰，说明方法的专属性符合规定；试样溶液中主峰与相邻异构体成分峰之间达到基线分离，分离度为1.9，符合规定，标准曲线液主峰的理论塔板数为17655。
实施例12
检测方法检测限与定量限
精密取标准储备液加异丙醇稀释制成信噪比约为10:1的溶液，作为定量限对照液；制成信噪比约为3:1的溶液，作为检测限对照液，其他条件同实施例2，进行操作，测得全反式维生素A棕榈酸酯的定量限为0.002μg，检测限为0.0007μg。
实施例13
线性关系试验
按实施例2条件进行，测定记录色谱图，以全反式维生素A棕榈酸酯峰面积为纵坐标，以全反式维生素A棕榈酸酯的浓度为横坐标，计算回归方程，从结果可知，全反式维生素A棕榈酸酯的标准线性方程为Y＝0.8138X-0.0967，方程相关系数r2为0.9998，说明该方法在0.4μg/mL～10.4μg/mL浓度范围内呈良好线性关系。结果见表8。
表8
实施例14
精密度试验
分别取同一批全营养乳样品6份，按实施例2条件进行试验，测定，记录色谱图，根据测得的标准曲线计算各样品中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，再计算全反式维生素A的含量、平均含量、相对标准偏差(RSD)，结果见表9，SRD为0.7％，说明精密度良好。
表9精密度试验结果
实施例15
准确度试验
对照品溶液：精密称取全反式维生素A棕榈酸酯10mg，加正己烷溶解并稀释至50mL，得浓度为200μg/mL的溶液，精密吸取1.0mL，加正己烷稀释100倍，得浓度约为2μg/mL的对照品溶液，待用。
分别取同一批全营养乳样品，按低、中、高三个浓度级别，每个浓度取3份样品精密称定，低浓度级别样品加入对照品溶液(2.431μg/mL)4.0mL，中浓度级别样品加入对照品溶液(2.431μg/mL)5.0mL，高浓度级别样品加入对照品溶液(2.431μg/mL)6.0mL，按实施例2条件进行操作，分别加正己烷至其总体积为20.0mL，塞上塞子，置涡旋振荡器上，以2000r/min提取5min，加入无水乙醇20mL，再次以2000r/min振荡混合处理2min，打开塞子放气，立即密塞，静置待分层，精密吸取上清液5.0mL，40℃氮吹至干，加4.0mL异丙醇溶解遗留物，即得。按技术方案的色谱条件测定，记录色谱图，计算实测量。准确度试验结果见表10。
表10准确度试验结果
从试验结果可知，在含量的80％～120％范围内，按低、中、高三个浓度级别进行准确度试验(加样回收)，回收率测定结果为98.4％～109.0％，平均回收率为103.3％(n＝9)，测定RSD为4.4％，不超过5％。说明准确度试验符合要求，测定方法准确可靠。
实施例16
考察不同编号C18分析柱对样品测定的影响
分别取同一批试样各6份，按实施例2条件进行操作，选用同品牌不同编号C18分析柱，分别测定样品中全反式维生素A的含量，测定结果见表11。
表11不同编号C18分析柱的分离度及全反式维生素A的含量测定结果
从试验结果可知，同品牌不同编号的C18分析柱采用本文的测定方法，分离度均大于1.5，符合要求；对同一批样品中全反式维生素A的含量测定结果差异不大，各自的测定RSD分别为0.7％和1.1％；不同分析柱间测定结果差异不明显。
实施例17
考察色谱条件中不同的分析柱柱温对分离度及测定结果的影响
分别取同一批试样各6份，按实施例2条件进行操作，分别在柱温20℃、27℃、33℃时，测定样品中全反式维生素A的含量，并考察各条件下分析柱的分离度，测定结果见表12。
表12不同的分析柱柱温的分离度及全反式维生素A的含量测定结果
从测定结果可知，柱温为20℃时，分离度2.1，柱温为27℃时，分离度1.9，柱温为33℃时，分离度为1.7，随分析柱柱温的升高，分离度出现降低的趋势,主峰的保留时间在36～60min，均可在1小时内洗脱完毕，从分离度及保留时间去考量，柱温27℃时，为最优，分离效果好,保留时间合适。柱温分别于20℃、27℃、33℃测定同一批样品中全反式维生素A的含量，差异不明显，测定的RSD为0.9％。
实施例18
多批样品中全反式维生素A的含量测定
取十批广州白云山汉方现代药业有限公司的全营养乳样品，按实施例2条件进行操作，分别测定样品中全反式维生素A的含量，测定结果见表13。
表13十批全营养乳样品中全反式维生素A的含量测定结果
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 不同批次全营养乳样品编号 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 | A9 | A10 |
| 含量(μg/100g) | 79.90 | 71.95 | 72.84 | 75.97 | 68.47 | 68.81 | 71.97 | 69.62 | 76.53 | 74.12 |
从测定结果可知，10批全营养乳产品中全反式维生素A的含量在68.47～79.90μg/100g，符合GB29922中对10岁以上人群维生素A需求量限度的规定。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，以乙腈-异丙醇混合溶剂为流动相A，乙腈为流动相B，采用反相分析柱进行梯度洗脱，测定全反式维生素A含量。
2.如权利要求1所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，以体积比为7～9∶1～3的乙腈-异丙醇混合溶剂为所述流动相A，乙腈为所述流动相B，进行所述梯度洗脱；所述反相分析柱为常规C18分析柱。
3.如权利要求1所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，以体积比为8∶2的乙腈-异丙醇混合溶剂为所述流动相A，乙腈为所述流动相B，进行所述梯度洗脱。
4.如权利要求1所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体操作为：在0～2min，所述流动相A与所述流动相B的初始体积比为0∶100；在2～42min，所述流动相A与所述流动相B的体积比由0∶100，线性匀速变化至30∶70；42～52min，所述流动相A与所述流动相B的体积比保持30∶70；52～54min，所述流动相A与所述流动相B的体积比由30：70线性匀速变化至0∶100；54～62min，所述流动相A与所述流动相B的体积比保持0∶100。
5.如权利要求1所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的检测波长为325nm，流速为2.0mL/min，进样体积为20μL，柱温为20～33℃。
6.如权利要求1所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，所述梯度洗脱前进行试样溶液制备，具体为：称取试样，置于具塞试管中，加入正已烷，第一次涡旋振荡提取，加入无水乙醇，第二次涡旋振荡提取，混合均匀，取出，打开塞子放气，立即密塞，静置至完全分层；吸取上清液，进行氮吹干，留下遗留物，加入异丙醇溶解所述遗留物，得到试样溶液。
7.如权利要求6所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，吸取所述上清液的量为所述正已烷加入量的四分之一，所述氮吹干的温度条件为40℃以下，所述异丙醇的加入量与所述试样的体积质量比为2ml∶10g。
8.如权利要求7所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，所述试样与所述正已烷的质量体积比为10g∶15～25ml；所述试样与所述无水乙醇的质量体积比为10g∶15～30ml；振荡为涡旋振荡器振荡，速度为1800～2200r/min，第一次涡旋振荡提取的时间为4～6min，第二次涡旋振荡提取的时间为2～4min。
9.如权利要求1所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，所述梯度洗脱后，记录色谱图，根据全反式维生素A棕榈酸酯对照品的保留时间进行定性，由标准曲线求得试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，按下式计算出反式维生素A含量：
式中：
X——试样中反式维生素A含量，单位为微克每百克(μg/100g)；
ρ——试样溶液中全反式维生素A棕榈酸酯的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V——样品稀释倍数；
m——试样质量，单位为克(g)；
100——换算百分率系数；
0.5455——转换因子(全反式维生素A分子量与全反式维生素A棕榈酸酯分子量的比值)。
10.如权利要求9所述特殊医学用途配方食品中全反式维生素A含量测定的方法，其特征在于，所述标准曲线由标准曲线液在相同条件下梯度洗脱获得，所述标准曲线液的制备包括：
A、精密称取全反式维生素A棕榈酸酯对照品10mg，用异丙醇溶解定容至50mL，得浓度为200μg/mL的标准储备液；
B、精密吸取所述标准储备液1.0mL，加异丙醇稀释至20mL，制得浓度为10μg/mL的对照液，作为标准曲线液V；
C、精密吸取所述标准曲线液V2.0mL，加异丙醇稀释至5mL，制得浓度为4μg/mL的对照液，作为标准曲线液Ⅳ；
D、精密吸取所述标准曲线液V2.0mL，加异丙醇稀释至10mL，制得浓度为2μg/mL的对照液，作为标准曲线液III；
E、精密吸取所述标准曲线液V2.0mL，加异丙醇稀释至20mL，制得浓度为1μg/mL的对照液，作为标准曲线液II；
F、精密吸取所述标准曲线液V2.0mL，加异丙醇稀释至50mL，制得浓度为0.4μg/mL的对照液，作为标准曲线液I。
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