CN102735774A

CN102735774A - 一种采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法

Info

Publication number: CN102735774A
Application number: CN2012102377982A
Authority: CN
Inventors: 孙军勇; 陆健; 谭新勇
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2012-07-10
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明涉及一种采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法，步骤如下：利用衍生剂邻苯二胺在强酸（pH 0.5～1.5）、高温（100～120℃）条件下对黄酒中的草酸进行衍生处理，进样前调pH值、离心、过滤取滤液，草酸标准样品的配制和处理，采用反相高效液相色谱系统分别对待测黄酒样品和草酸标准样品进行色谱分析和数据处理，分别得到所述待测黄酒样品滤液和草酸标准样品滤液的液相色谱图以及所述两种滤液中草酸衍生物峰面积值，最后经公式计算得到待测黄酒样品中的草酸含量。本发明检测灵敏度高、对草酸分辨率高、重复性好、回收率高，能对黄酒中的草酸准确地定性和定量。

Description

一种采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法

技术领域

本发明涉及黄酒的分析检测方法，具体涉及利用邻苯二胺衍生草酸，再通过反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法。

背景技术

草酸即乙二酸，是最简单的有机二元酸之一，广泛存在于动物、植物和微生物组织中。草酸为食品中的一种抗营养因子，若在日常饮食中摄入量过高，易造成草酸和钙离子结合形成草酸钙沉淀甚至导致结石，对人体健康产生危害。黄酒中也含有一定量的草酸，主要是由酿酒原料带入和发酵过程中的微生物代谢产生。成品黄酒中草酸含量与酿酒原料品质、酿造工艺及陈化贮存技术等因素有关，草酸含量高的成品酒其底部会出现草酸钙沉淀，严重损害成品黄酒的风味和品质，是困扰黄酒行业的难题，一旦出现沉淀，黄酒生产厂家就要对产品进行召回，造成巨大的经济损失。因此，为解决黄酒草酸钙沉淀问题，需要对酿酒原料和酿造过程中的草酸含量进行监控。

目前，针对黄酒、啤酒和果酒中包括草酸在内的有机酸的检测方法主要有分光光度法、高效毛细管电泳法、气相色谱法、反相高效液相色谱法等，但均存在一定局限性。其中，分光光度法检测分辨率低、灵敏度差、易受其他物质的干扰、检测误差较大，而且由于黄酒颜色较深，比色效果不明显；高效毛细管电泳法检测分辨率高，但在检测草酸时高效毛细管电泳图谱基线严重倾斜，影响测定结果的准确性；气相色谱法要求有机酸具有较好的挥发性，但草酸沸点较高，不适合用该项技术进行检测；反相高效液相色谱是当今液相色谱最主要的分离模式，在食品、生物和医药领域均有广泛应用，在黄酒、啤酒和果酒有机酸的测定方面也有应用，但现有技术中直接用反相高效液相色谱方法测定草酸，存在草酸峰和酒石酸峰出峰重合、分离度不够的缺点，对草酸分辨率和检测灵敏度低，回收率不高，不能准确定量。

发明内容

本申请人针对现有黄酒草酸含量测定方法存在的上述缺陷，提供一种采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法，该方法检测灵敏度高、对草酸分辨率高、重复性好、回收率高，能对黄酒中的草酸准确地定性和定量。

本发明的技术方案如下：

一种采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法，步骤如下：

（1）衍生处理：将待测黄酒样品调节pH值至0.5～1.5，加入其体积的20～40％的邻苯二胺溶液，混匀后对所得溶液进行称重，并于100～120℃加热4～8h，冷却至室温后，加入双蒸水至溶液重量与加热前一致，所述邻苯二胺溶液的质量浓度为8～12g/L；

（2）进样前处理：用NaOH调节上述溶液pH值至5.0～6.0，离心后收集上清液并用滤膜过滤，取滤液；

（3）草酸标准样品的配制和处理：配制草酸标准样品，并按照步骤（1）～（2）所述方法对其进行处理；

（4）色谱分析和数据处理：进样，采用反相高效液相色谱系统对步骤（2）所得待测黄酒样品滤液和步骤（3）所得草酸标准样品滤液进行色谱分析和数据处理，分别得到所述待测黄酒样品滤液和草酸标准样品滤液的液相色谱图以及所述两种滤液中草酸衍生物峰面积值，最后经公式计算得到待测黄酒样品中的草酸含量，所述公式如下：

其中，C_样为待测黄酒样品中草酸质量浓度，单位：mg/L；

C_标为草酸标准样品中草酸质量浓度，单位：mg/L；

A_样为待测黄酒样品中草酸衍生物峰面积值；

A_标为草酸标准样品中草酸衍生物峰面积值。

其进一步的技术方案为：

步骤（1）所述草酸标准样品的质量浓度C_标为100mg/L。

步骤（4）所述色谱分析的条件为：流动相为甲醇与乙酸铵，体积比为13：87～17∶83；流动相流速为1.1～1.3mL/min；进样量为40～60μL；色谱柱柱温为20～30℃；检测波长为310～320nm。

本发明有益的技术效果为：

本发明以邻苯二胺为衍生剂，在强酸（pH0.5～1.5）、高温（100～120℃）条件下与草酸发生衍生化反应，生成草酸衍生物2,3-二羟基喹喔啉，改变了草酸在液相色谱图上的出峰时间，解决了现有检测技术中草酸和酒石酸出峰重合，分离度不够的问题，对草酸分辨率高，另外，由于2,3-二羟基喹喔啉为一种强紫外吸收化合物，在较低浓度即能被紫外检测器检测到，因此显著提高了本检测方法的灵敏度，草酸的最低检出限可达0.5mg/L；本发明重复性好，回收率高，在最优色谱分析条件下，重现性％RSD(n=5)<9.30，加标回收率为91.40～103.70％；本发明可对黄酒中的草酸准确地定性和定量。

附图说明

图1为本发明实施例2中反相高效液相色谱检测草酸标准样品中草酸衍生物的液相色谱图。

图2为本发明实施例2中反相高效液相色谱检测待测黄酒样品中草酸衍生物的液相色谱图。

图3为本发明对比例1中采用高效毛细管电泳法检测实施例1～实施例3待测黄酒样品中草酸的电泳分离图。

图4为本发明对比例2中直接用反相高效液相色谱法检测实施例1～实施例3待测黄酒样品中草酸的液相色谱图。

具体实施方式

下面参见图1～4，并结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例和对比例中的草酸标准样品配制方法如下：

草酸标准样品：称取0.07g市售含两个结晶水的草酸置于500mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，得到质量浓度C_标为100mg/L的草酸标准样品，置于4℃冰箱中备用。

实施例1

一种采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法，具体步骤如下：

（1）衍生处理：取市售待测黄酒样品，用盐酸调节其pH值至0.5，然后取5mL该样品置于25mL比色管中，加入1mL新鲜配制的质量浓度为8g/L的邻苯二胺溶液，混匀后对所得溶液进行称重，并于100℃加热8h，冷却至室温后，加入双蒸水至溶液重量与加热前一致；

（2）进样前处理：用NaOH调节上述溶液pH值至5.0，于2000r/min离心10min，最后用0.45μm滤膜过滤，取滤液；

（3）草酸标准样品的处理：按照步骤（1）～（2）所述方法对草酸标准样品进行处理；

（4）色谱分析和数据处理：进样，采用反相高效液相色谱系统对步骤（2）所得待测黄酒样品滤液和步骤（3）所得草酸标准样品滤液进行色谱分析和数据处理，得到所述待测黄酒样品滤液和草酸标准样品滤液的液相色谱图以及所述滤液中草酸衍生物峰面积。经上述公式计算得到待测黄酒样品中的草酸质量浓度为33.46mg/L。所述色谱分析的条件为：流动相为甲醇与乙酸铵，体积比为13∶87；流动相流速为1.1mL/min；进样量为60μL；色谱柱柱温为30℃；检测波长为320nm。

方法评价：

（1）加标回收率：取三份上述黄酒样品，分别添加不同量的草酸标准样品，添加量从低到高依次为20mg/L、40mg/L、80mg/L，按照上述反相高效液相色谱法对其进行分析并测定草酸含量，计算得到上述三份样品的加标回收率为87.35～96.83％。

（2）重复性试验：取同一草酸标准样品按照上述反相高效液相色谱法对其进行分析并测定草酸含量，平行测定5次，计算得到草酸含量的标准偏差小于11.87％，即重现性％RSD(n=5)<11.87。

（3）灵敏度试验：通过20次测量空白时所得噪声强度，以3倍该噪声强度的响应值所对应的样品浓度为最低检出限，测得该方法的草酸最低检出限为0.6mg/L。

实施例2

（1）衍生处理：取实施例1所述待测黄酒样品，用盐酸调节其pH值至1.0，然后取5mL该样品置于25mL比色管中，加入2mL新鲜配制的质量浓度为10g/L的邻苯二胺溶液，混匀后对所得溶液进行称重，并于110℃加热6h，冷却至室温后，加入双蒸水至溶液重量与加热前一致；

（2）进样前处理：用NaOH调节上述溶液pH值至5.5，于2000r/min离心10min，最后用0.45μm滤膜过滤，取滤液；

（4）色谱分析和数据处理：进样，采用反相高效液相色谱系统对步骤（2）所得待测黄酒样品滤液和步骤（3）所得草酸标准样品滤液进行色谱分析和数据处理，得到所述待测黄酒样品滤液和草酸标准样品滤液的液相色谱图以及所述滤液中草酸衍生物峰面积，如图1和图2所示。经上述公式计算得到待测黄酒样品中的草酸质量浓度为37.23mg/L。所述色谱分析的条件为：流动相为甲醇与乙酸铵，体积比为15∶85；流动相流速为1.2mL/min；进样量为50μL；色谱柱柱温为25℃；检测波长为314nm。

方法评价：

按照实施例1所述评价方法对本实施所述反相高效液相色谱法进行加标回收率测试、重复性试验和灵敏度试验，测得加标回收率为91.40～103.70％，重现性％RSD(n=5)<9.30，草酸最低检出限为0.5mg/L。

实施例3

（1）衍生处理：取实施例1～2所述待测黄酒样品，用盐酸调节其pH值至1.5，然后取5mL该样品置于25mL比色管中，加入1.5mL新鲜配制的质量浓度为12g/L的邻苯二胺溶液，混匀后对所得溶液进行称重，并于120℃加热4h，冷却至室温后，加入双蒸水至溶液重量与加热前一致；

（2）进样前处理：用NaOH调节上述溶液pH值至6.0，于2000r/min离心10min，最后用0.45μm滤膜过滤，取滤液；

（4）色谱分析和数据处理：进样，采用反相高效液相色谱系统对步骤（2）所得待测黄酒样品滤液和步骤（3）所得草酸标准样品滤液进行色谱分析和数据处理，得到所述待测黄酒样品滤液和草酸标准样品滤液的液相色谱图以及所述滤液中草酸衍生物峰面积。经上述公式计算得到待测黄酒样品中的草酸质量浓度为35.74mg/L。所述色谱分析的条件为：流动相为甲醇与乙酸铵，体积比为17∶83；流动相流速为1.3mL/min；进样量为40μL；色谱柱柱温为20℃；检测波长为310nm。

方法评价：

按照实施例1～2所述评价方法对本实施所述反相高效液相色谱法进行加标回收率测试、重复性试验和灵敏度试验，测得加标回收率为89.53～94.47％，重现性％RSD(n=5)<10.84，草酸的最低检出限为0.56mg/L。

由上述实施例1～3的试验结果可知，实施例2具有最高的加标回收率，最佳重现性及最低的草酸检出限，为最优实施例。

实施例4

按照实施例2所述采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法，对市售4种黄酒样品（干型、半干型、半甜型、甜型）中的草酸含量进行测定，结果见表1。

表1

黄酒样品	市售干型	市售半干型	市售半甜型	市售甜型
					草酸含量（mg/L）	26.7	37.2	40.9	39.5

下面通过对照试验说明本发明的效果。

对比例1

按照常规高效毛细管电泳法对实施例1～3所述待测黄酒样品中的草酸进行检测，得到高效毛细管电泳分离图谱，如图3所示。

对比例2

取实施例1～3所述待测黄酒样品20mL，加入活性炭0.2g，振荡混匀30min，于室温静置10min，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，不经衍生处理，直接进样，用反相高效液相色谱方法测定草酸，色谱分析条件如下：流动相为0.01mol/L磷酸氢二铵溶液，pH为3.0；柱温20℃；检测波长213nm；流速1.0mL/min；进样量20μL。得到液相色谱图，如图4所示。

以上实施例所述反相高效液相色谱系统为戴安Ultimate 3000液相系统，购自美国戴安公司；所述色谱柱为Dionex Acclaim 120 C18，5μm，4.6×250mm，购自美国戴安公司；所述离心机为Heraeus Fresco 17离心机，购自德国Thermoscientific公司。

由上述实施例1～4和对比例1～2可知，对比例1所述高效毛细管电泳法在检测草酸时电泳图谱基线严重倾斜，对比例2所述反相高效液相色谱在直接检测草酸时色谱图中的草酸峰和酒石酸峰重合，分离度不够；本发明克服了上述缺陷，检测灵敏度高、对草酸分辨率高、重复性好、回收率高，能对黄酒中的草酸准确地定性和定量。

Claims

1.一种采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法，其特征在于步骤如下：

其中，C_样为待测黄酒样品中草酸质量浓度，单位：mg/L；

C_标为草酸标准样品中草酸质量浓度，单位：mg/L；

A_样为待测黄酒样品中草酸衍生物峰面积值；

A_标为草酸标准样品中草酸衍生物峰面积值。

2.根据权利要求1所述采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法，其特征在于：步骤（1）所述草酸标准样品的质量浓度C_标为100mg/L。

3.根据权利要求1所述采用反相高效液相色谱测定黄酒中草酸含量的方法，其特征在于步骤（4）所述色谱分析的条件为：流动相为甲醇与乙酸铵，体积比为13：87～17∶83；流动相流速为1.1～1.3mL/min；进样量为40～60μL；色谱柱柱温为20～30℃；检测波长为310～320nm。