CN104122363B

CN104122363B - 一种甲钴胺片有关物质的测定方法

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Publication number: CN104122363B
Application number: CN201410288671.2A
Authority: CN
Inventors: 徐春玲; 徐秀卉; 陆振宇; 宋远征; 姚丽萍; 蒋国潮; 徐鹏鹤; 丁忠海
Original assignee: HANGZHOU CONBA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU CONBA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2034-06-24
Also published as: CN104122363A

Abstract

本发明提供了一种甲钴胺片有关物质的测定方法，包括如下步骤：①供试品的制备：②对照品的制备；③采用高效液相色谱测定有关物质的含量，色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相是由乙腈与磷酸盐缓冲液组成的混合液；检测波长为300～360nm，进样量为20μl，柱温为30℃，流速为0.5～1.5ml/min；梯度洗脱；④计算供试品中各杂质的含量。本发明提供的甲钴胺片有关物质的测定方法，通用性强、重现性好、分离度高、检测结果准确；经方法学验证表明，具有稳定性指示作用，能够快速、准确地实现甲钴胺片各杂质的限度控制，确保质量可控，而且该测定方法成本低廉，具有良好的经济效益和推广前景。

Description

一种甲钴胺片有关物质的测定方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，更具体地说，涉及一种甲钴胺片有关物质的测定方法。

背景技术

甲钴胺又名甲基维生素B12，是一种深红色结晶或结晶性粉末；无臭、无味；引湿性强；遇光易分解；甲钴胺分子式为C₆₃H₉₁C_ON₁₃O₁₄P，分子量为1344.38，其结构是以钴离子为中心的大环络合物，该结构式如下：

甲钴胺是甲钴胺片的有效活性成分，是维生素B12(氰钴胺)的衍生物，从上述结构式中可知，因在中央钴分子上结合了一个甲基基团，参与物质的甲基转换及核酸、蛋白质和脂肪代谢，所以甲钴胺片的主要功能是修复损伤的神经，缓解麻木、疼痛和感觉异常，对周围神经病变具有良好的治疗作用，已在临床上得到广泛应用。

众所周知，甲钴胺在弱酸条件下较为稳定，强酸(pH<2)或碱性溶液中分解，遇热可有一定程度破坏，但短时间的高温消毒损失小，遇强光或紫外线易被破坏。由于本身化学性质的不稳定，甲钴胺在强光下会降解生成羟钴胺。羟钴胺和甲钴胺片的制备及储运过程中可能引入的其他杂质统称为有关物质。该有关物质会对甲钴胺片的安全性和有效性产生一定的影响。因此，如何准确测定甲钴胺片中有关物质的含量，是正确评价甲钴胺片质量的重要指标，也是提升临床应用量的关键因素。

发明人统计目前市售的口服固体剂型，发现目前市场销售的甲钴胺制剂以片剂、胶囊剂为主，制剂的生产工艺大多都涉及制粒、包衣步骤；可见，在甲钴胺制剂的生产过程中，如何快速、准确的检测有关物质(如氰钴胺、羟钴胺等)的含量，将其控制在药品标准范围内，对甲钴胺类产品的产业化有着非常重要的作用。

令人遗憾的是，在中国药典中尚未收录甲钴胺有关物质的检测方法，而现有的文献报道中，仅有对甲钴胺原料有关物质的检测方法，鲜见有对其制剂有关物质的检测方法；如文献《HPLC测定甲钴胺中的有关物质》(谢丽华、陈乔、陈晓艳，《河北化工》，2011年3月第34卷第3期，P51-52)中公开的检测方法，主要是通过甲钴胺的起始原料来检测甲钴胺原料的有关物质，该方法并不适用甲钴胺制剂(特别是甲钴胺片)的有关物质检测。

目前，我公司对甲钴胺片有关物质的检测，其方法是按照国家药品标准(标准号为YBH12912006)规定的步骤操作，具体如下：①去除片剂的薄膜包衣；②将去除包衣后的片子研磨成细粉；③称取细粉适量，加有机溶剂稀释，定容、进样；④用高效液相色谱等度洗脱。该检测方法的不足之处在于：①由于甲钴胺片为包衣片，采用该检测方法对片剂的辅料较敏感，若不完全去除包衣则对有关物质的检测结果有干扰；②由于该片剂的片型小，因此去除包衣困难，多一道工序，较繁琐；③在避光条件下，存在去衣不干净的因素，会影响检测的准确性；④辅料峰与杂质峰有重叠，分离度差、积分有干扰；⑤实践证明，同样的检测方法使用不同仪器，各杂质的分离效果不同，说明采用该检测方法测得的检测结果重现性差，不具有稳定性指示作用。

综上所述，现有的甲钴胺片有关物质的检测方法，主要存在检测步骤繁琐、检测灵敏度低、辅料峰与杂质峰的分离度差、检测结果的重现性差等技术缺陷。因此，如何克服上述技术缺陷，提供一种快速、准确的检测方法，更好的控制本产品质量，是本领域技术人员急需解决的技术难题。

发明内容

本发明提供一种甲钴胺片有关物质的测定方法，能够精准控制本制剂产品的质量，解决了上述现有技术的缺陷。

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种甲钴胺片有关物质的测定方法，包括如下步骤：

(1)供试品的制备：直接研磨甲钴胺片至细粉，取适量细粉置于量瓶中，加流动相使细粉溶解、稀释至刻度，制成浓度为0.25mg/ml的溶液；摇匀、滤过，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品的制备：取适量步骤(1)所得的供试品溶液，加流动相稀释至刻度，制成浓度为7.5μg/ml的溶液，作为对照品溶液；

(3)采用高效液相色谱测定有关物质的含量：取步骤(2)所得的对照品溶液注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，再精密量取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图至甲钴胺峰保留时间的2倍，供试品溶液中单个杂质含量不得大于1.0％，总杂质含量不得大于2.0％。

色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相是由乙腈与磷酸盐缓冲液组成的混合液；检测波长为300～360nm，进样量为20μl，柱温为30℃，流速为0.5～1.5ml/min；梯度洗脱；

(4)计算供试品中各杂质的含量。

优选的，梯度洗脱具体设置如下：，于0～2分钟，流动相中乙腈的体积占5％，磷酸盐缓冲液的体积占95％；于2～15分钟，流动相中乙腈的体积从5％变化为15％，磷酸盐缓冲液的体积从95％变化为85％；于15～30分钟，流动相中乙腈的体积从15％变化为20％，磷酸盐缓冲液的体积从85％变化为80％；于30～32分钟，流动相中乙腈的体积从20％变化为25％，磷酸盐缓冲液的体积从80％变化为75％；于32～35分钟，流动相中乙腈和磷酸盐缓冲液的体积各自回到初始比例，色谱柱重新平衡；后运行2分钟，使色谱柱充分平衡。

优选的，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.05mol/L，PH值为3.5～5.0。

更优选的，磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L，PH值为3.5。

优选的，磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢胺、磷酸氢二胺中的一种或几种。

更优选的，磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钠。

优选的，在本发明提供的测定方法中，步骤(1)、步骤(2)中的流动相是由乙腈与0.03mol/L磷酸二氢钠溶液按照体积比19：81的比例混合而成。

优选的，在本发明提供的测定方法中，色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相是由乙腈与磷酸盐缓冲液组成的混合液；检测波长为342nm，进样量为20μl，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；梯度洗脱。

本发明中，发明人通过平行对照实验，分别考察了磷酸盐缓冲液在不同浓度、不同PH值以及不同化合物组分的缓冲液下，其分离度、理论板数、对称度等测定结果的差异，经筛选后，发现当磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠，浓度为0.03mol/L，PH值为3.5时，采用本发明提供的测定方法，检测结果最佳，杂质峰和甲钴胺峰的分离效果最优。

除此之外，从文献《HPLC测定甲钴胺中的有关物质》(谢丽华、陈乔、陈晓艳，《河北化工》，2011年3月第34卷第3期，P51-52)中提供的甲钴胺原料的有关物质检测方法可知，在相同色谱条件下，进样分析，杂质在264nm时有较大的吸收，峰面积较大；因此选择264nm为检测波长。而发明人经实验验证，采用本发明提供的测定方法，当检测波长为342nm相比于264nm时，各杂质的分离效果最优，且峰面积最大。

与现有技术相比，本发明提供的甲钴胺片有关物质的测定方法，具有如下优势：

(1)通用性强，避免了甲钴胺片包衣辅料对检测结果的干扰影响，因此本发明的测定方法相比于传统的检测方法，省略了先要去除甲钴胺片包衣的工序，能够简化操作步骤、省时省力；

(2)重现性好，无论是采用Agilent液相，还是采用Waters液相，都能够较好地分离杂质；而且本发明采用普通的C18色谱柱进行梯度洗脱，对检测设备的要求较低，无形中降低了检测成本；

(3)分离度高、检测结果准确，在本发明提供的色谱条件下，甲钴胺与有关物质的分离度完全满足要求，理论塔板数非常高；从得到的色谱图可以验证，有关物质与甲钴胺峰之间达到良好的分离度(分离度>1.5)，使得积分不受干扰，能有效避免因辅料峰与杂质峰重叠而造成的检测结果偏差。

总之，本发明提供的甲钴胺片有关物质的测定方法，经方法学验证表明，具有稳定性指示的作用，能够快速、准确地实现甲钴胺片各杂质的限度控制，确保质量可控，而且该测定方法成本低廉，具有良好的经济效益和推广前景。

附图说明

图1为采用国家药品标准YBH12912006方法检测甲钴胺片有关物质的Agilent液相和Waters液相的对比色谱图

图2为实施例1中甲钴胺片系统适应性溶液的色谱图

图3为实施例1中甲钴胺片供试品溶液的色谱图

图4为实施例2中甲钴胺片供试品溶液的色谱图

图5为实施例3中甲钴胺片供试品溶液的色谱图

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

仪器：高效液相色谱仪(Waters2695/2996，waters公司)

试剂：磷酸二氢钠(分析纯，500g/瓶，湖州湖试化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，4L/瓶，TediaCompany)

色谱柱：DikmaDiamonsilC₁₈柱(250×4.0nm，5μm)

实施例1

直接将甲钴胺片研磨至细粉，精密称取适量细粉(即相当于甲钴胺2.5mg)，置10ml量瓶中，加流动相乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(体积比为19:81，含0.03mol/L磷酸二氢钠，用磷酸调节PH值为3.5)，使细粉溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

精密量取续滤液适量，同样加流动相乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(体积比为19:81，含0.03mol/L磷酸二氢钠，用磷酸调节PH值为3.5)稀释至刻度，制成浓度为7.5μg/ml的溶液，作为对照品溶液；

另取供试品溶液在日光下放置5-10分钟后作为系统适应性溶液。

取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，再精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至甲钴胺峰保留时间的2倍，供试品溶液中若有杂质峰，则供试品溶液中单个杂质含量≤1.0％，总杂质含量≤2.0％。

采用高效液相色谱的色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱(即C18柱)，流动相是由乙腈与磷酸盐缓冲液组成的混合液(即流动相A为乙腈，流动相B为PH＝3.5、0.03mol/L磷酸二氢钠溶液)；检测波长为342nm，进样量为20μl，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；按表1所示的条件进行梯度洗脱：

表1梯度洗脱程序

时间(分钟)	乙腈(％)	磷酸盐缓冲液(％)
			0	5	95
2	5	95
			15	15	85
30	20	80
			32	25	75
35	5	95

后运行时间为2min；计算供试品溶液中各杂质的含量，测定结果见图2和图3。

实施例2

与实施例1的操作方法相同，采用高效液相色谱测定甲钴胺片有关物质的含量，其色谱条件中流速改为1.5ml/min，按表1所示的梯度洗脱程序进行梯度洗脱，其余同实施例1；测定结果见图4。

实施例3

与实施例1的操作方法相同，采用高效液相色谱测定甲钴胺片有关物质的含量，其色谱条件中流速改为0.5ml/min，按表1所示的梯度洗脱程序进行梯度洗脱，其余同实施例1；测定结果见图5。

实施例4

为验证色谱条件的可行性，对甲钴胺片分别进行酸、碱、氧化、高温及光照破坏试验。

1.酸破坏：直接研磨甲钴胺片至细粉，精密称取含量测定项下的细粉适量(约相当于甲钴胺2.5mg)，置10ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸适量，放置约5min后，加乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(19:81)，使细粉溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.碱破坏：直接研磨甲钴胺片至细粉，精密称取含量测定项下的细粉适量(约相当于甲钴胺2.5mg)，置10ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠适量，放置约5min后，加乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(19:81)，使细粉溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3.氧化破坏：直接研磨甲钴胺片至细粉，精密称取含量测定项下的细粉适量(约相当于甲钴胺2.5mg)，置10ml量瓶中，加30％双氧水适量，放置约5min后，加乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(19:81)，使细粉溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

4.高温破坏：直接研磨甲钴胺片至细粉，精密称取含量测定项下的细粉适量(约相当于甲钴胺2.5mg)，置10ml量瓶中，避光置60℃烘箱中加热约1小时，取出放冷后加乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(19:81)，使细粉溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

5.光照破坏：直接研磨甲钴胺片至细粉，精密称取含量测定项下的细粉适量(约相当于甲钴胺2.5mg)，置10ml量瓶中，在日光下放置10分钟后，加乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(19:81)，使细粉溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

上述破坏试验1～5制得的供试品溶液，均按照实施例1的色谱条件进行测定，测定结果显示：

甲钴胺片在酸性条件和氧化条件下无明显杂质生成，在光照、碱性和高温条件下稳定性较差，分别有相应的杂质生成，但在本发明提供的测定方法下，这些杂质与甲钴胺均可得到基线分离。

【图谱分析】

发明人曾按照国家药品标准YBH12912006的方法对甲钴胺片的有关物质测定，且同样的方法分别采用型号为Agilent1100的Agilent高效液相色谱仪和型号为Waters2695/2996的Waters高效液相色谱仪进行测定，计算杂质的含量见表2，测定结果的色谱图如图1所示。

表2不同液相按照测定的杂质含量对比

	Waters液相	Agilent液相
			单个杂质(％)	0.77	0.90
总杂质(％)	0.77	1.75

结合表2数据及图1的色谱图可见：

①采用Agilet液相得到的色谱图中杂质2、杂质3的分离较差，积分存在干扰，导致测得的总杂质数值偏高；采用Waters液相较于Agilent液相来说，杂质2、杂质3之间的分离效果略好些，导致测得的总杂质数值就明显下降；由此说明，采用标准号YBH12912006的检测方法测定甲钴胺片的有关物质，其检测结果的重现性较差，对液相设备的选择度较高，不具有稳定性指示作用。

②虽然采用Waters液相的杂质分离效果略好些，但杂质2、杂质3之间的分离度仍低于1.5，不符合中国药典的要求；由此说明，按照国家药品标准YBH12912006的方法测定甲钴胺片的有关物质，检测准确度偏低，存在检测误差，不具有通用性。

此外，发明人分别考察了本发明提供的测定方法(在不同流速下的色谱条件下)与原标准(标准号YBH12912006)检测方法下测得的杂质含量对比，结果见下表3所示：

表3不同方法所测得的杂质含量对比

	原标准	实施例1	实施例2	实施例3
					单个杂质％	0.77	0.34	0.38	0.36
总杂质％	0.81	0.51	0.76	0.58

从表3中可见：

①采用本发明提供的测定方法，与采用标准号YBH12912006的检测方法相比，杂质限度控制更精准，检测效果更优。

②通过在不同流速的色谱条件下对比实验表明，本发明提供的测定方法选择流速为1.0ml/min的色谱条件，杂质含量的检测效果相对最优。

综合分析实施例1、实施例2和实施例3的测定结果，从图2中可以看出，甲钴胺片中的主成分甲钴胺与光降解产物羟钴胺(即杂质1)、以及与杂质2的分离度均完全满足要求(中国药典的规定是分离度>1.5)，柱效非常高。

从图3、图4和图5中可以看出，即使甲钴胺片中有包衣辅料的存在，但辅料峰与溶剂峰均在前4分钟出峰，而杂质均在后面出峰，且与主峰基线分离，不存在积分干扰。因此，验证了本测定方法的专属性较高，不会影响有关物质的检测；克服了传统检测方法必须先去除包衣才能消除积分干扰的技术缺陷。

Claims

1.一种甲钴胺片有关物质的测定方法，包括如下步骤：

(3)采用高效液相色谱测定有关物质的含量：取步骤(2)所得的对照品溶液注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，再精密量取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图至甲钴胺峰保留时间的2倍，供试品溶液中单个杂质含量不得大于1.0％，总杂质含量不得大于2.0％；

色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相是由乙腈与磷酸盐缓冲液组成的混合液；检测波长为342nm，进样量为20μl，柱温为30℃，流速为0.5～1.5ml/min；梯度洗脱；

梯度洗脱条件为：于0～2分钟，流动相中乙腈的体积占5％，磷酸盐缓冲液的体积占95％；于2～15分钟，流动相中乙腈的体积从5％变化为15％，磷酸盐缓冲液的体积从95％变化为85％；于15～30分钟，流动相中乙腈的体积从15％变化为20％，磷酸盐缓冲液的体积从85％变化为80％；于30～32分钟，流动相中乙腈的体积从20％变化为25％，磷酸盐缓冲液的体积从80％变化为75％；于32～35分钟，流动相中乙腈和磷酸盐缓冲液的体积各自回到初始比例，色谱柱重新平衡；后运行2分钟，使色谱柱充分平衡；

(4)计算供试品中各杂质的含量；

所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.05mol/L，PH值为3.5～5.0；

所述的磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢胺、磷酸氢二胺中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的甲钴胺片有关物质的测定方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L，PH值为3.5。

3.根据权利要求1所述的甲钴胺片有关物质的测定方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钠。

4.根据权利要求1所述的甲钴胺片有关物质的测定方法，其特征在于：所述的步骤(1)、步骤(2)中的流动相是由乙腈与0.03mol/L磷酸二氢钠溶液按照体积比19：81的比例混合而成。

5.根据权利要求1所述的甲钴胺片有关物质的测定方法，其特征在于：所述的色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相是由乙腈与磷酸盐缓冲液组成的混合液；检测波长为342nm，进样量为20μl，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；梯度洗脱。