CN112697936A - 一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法 - Google Patents

一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法 Download PDF

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肖丽静
钱凌燕
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    • G01N30/74—Optical detectors

Abstract

本发明公开了一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取适量甲钴胺颗粒置于量瓶中，加入流动相A振摇使其溶解、稀释，制成浓度为0.1mg/ml的溶液；摇匀、离心，取上清液作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：取适量甲钴胺和羟钴胺对照品，加流动相A超声使其溶解，稀释，制成浓度为1ug/ml的对照品溶液；(3)灵敏度溶液的制备：取适量对照品溶液置于量瓶中，加流动相A稀释，制成浓度为0.05ug/ml的灵敏度溶液；(4)采用高效液相色谱测定有关物质的含量。本发明提供的一种快速、准确的检测甲钴胺颗粒有关物质的分析方法，能够更好的控制本产品质量。

Description

一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法
领域
本发明涉及药物检测技术领域，特别涉及一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法。
背景
甲钴胺又名甲基维生素B12，是一种深红色结晶或结晶性粉末；无臭、无味；引湿性强；遇光易分解；甲钴胺分子式为C63H91CON13O14P，分子量为1344.38，其结构是以钴离子为中心的大环络合物，该结构式如下：
Figure BDA0002844549450000011
甲钴胺是甲钴胺颗粒的有效活性成分，是维生素B12(氰钴胺)的衍生物，从上述结构式中可知，因在中央钴分子上结合了一个甲基基团，参与物质的甲基转换及核酸、蛋白质和脂肪代谢，所以甲钴胺颗粒的主要功能是修复损伤的神经，缓解麻木、疼痛和感觉异常，对周围神经病变具有良好的治疗作用，已在临床上得到广泛应用。
甲钴胺在弱酸条件下较为稳定，强酸(pH<2)或碱性溶液中分解，遇热可有一定程度破坏，但短时间的高温消毒损失小，遇强光或紫外线易被破坏。由于本身化学性质的不稳定，甲钴胺在强光下会降解生成羟钴胺。羟钴胺和甲钴胺颗粒的制备及储运过程中可能引入的其他杂质统称为有关物质。该有关物质会对甲钴胺颗粒的安全性和有效性产生一定的影响。因此，如何准确测定甲钴胺颗粒中有关物质的含量，是正确评价甲钴胺颗粒质量的重要指标，也是提升临床应用量的关键因素。
目前市场销售的甲钴胺制剂以片剂、胶囊剂为主，制剂的生产工艺大多都涉及制粒、包衣步骤；可见，在甲钴胺制剂的生产过程中，如何快速、准确的检测有关物质(如氰钴胺、羟钴胺等)的含量，将其控制在药品标准范围内，对甲钴胺类产品的产业化有着非常重要的作用。
概述
本公开涉及一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取适量甲钴胺颗粒置于量瓶中，加入流动相A振摇使其溶解、稀释，制成浓度为0.1mg/ml的溶液；摇匀、离心，取上清液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取适量甲钴胺和羟钴胺对照品，加流动相A超声使其溶解，稀释，制成浓度为1ug/ml的对照品溶液；
(3)灵敏度溶液的制备：取适量对照品溶液置于量瓶中，加流动相A稀释，制成浓度为0.05ug/ml的灵敏度溶液；
(4)采用高效液相色谱测定有关物质的含量，具体为：
将步骤(3)制得的灵敏度溶液注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，再精密量取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
附图简要说明
图1示出了本公开一实施例的系统适用性溶液的色谱图；
图2示出了本公开一实施例的空白溶液(流动相A)的色谱图；
图3示出了本公开一实施例的对照品溶液的色谱图；
图4示出了本公开一实施例的甲钴胺颗粒供试品溶液的色谱图。
详述
在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其他方法、部件、材料等的情况下仍实现实施方案。
除非本公开中另有要求，在整体说明书和所附的权利要求中，词语“包括”、“包含”、“含有”和“具有”应解释为开放式的、含括式的意义，即“包括但不限于”。
在整体说明书中提到的“一实施方案”、“实施方案”、“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”意指在至少一实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同位置出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”不必全部指同一实施方案，此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。
定义
在本公开中，术语“外标法”是指用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。
在本公开中，术语“梯度洗脱”又称为“梯度淋洗”或“程序洗脱”，即在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比。
在本公开中，术语“空白溶液”是指在高效液相色谱检测分析方法中，为消除干扰，用与测定试样时完全一致的条件进行测定的溶液。测得结果称为"空白值"，应从试样测定结果中扣除，以此提高测定的准确性。
在本公开中，术语“供试品溶液”是指在高效液相色谱检测分析方法中，待测样品的溶液。
在本公开中，术语“对照品溶液”是在指在高效液相色谱检测分析方法中，标准样品的溶液。
在本公开中，术语“流动相”是指在液相色谱过程中携带待测组分向前移动的物质。
具体实施方式
本公开涉及一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取适量甲钴胺颗粒置于量瓶中，加入流动相A振摇使其溶解、稀释，制成浓度为0.1mg/ml的溶液；摇匀、离心，取上清液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取适量甲钴胺和羟钴胺对照品，加流动相A超声使其溶解，稀释，制成浓度为1ug/ml的对照品溶液；
(3)灵敏度溶液的制备：取适量对照品溶液置于量瓶中，加流动相A稀释，制成浓度为0.05ug/ml的灵敏度溶液；
(4)采用高效液相色谱测定有关物质的含量，具体为：
将步骤(3)制得的灵敏度溶液注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，再精密量取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
在某些实施方案中，供试品溶液中单个杂质含量不得大于1.0％，总杂质含量不得大于3.0％。
在某些实施方案中，步骤(4)中色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A由磷酸盐缓冲液和乙腈组成，流动相B由乙腈和水组成；检测波长为300-360nm，进样量为100μl，柱温为40℃，流速为0.5-1.5ml/min；以及采用梯度洗脱。
在某些实施方案中，检测波长为342nm，流速为1.0ml/min。
在某些实施方案中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/L，PH值为3.5-5.0。
在某些实施方案中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L，PH值为4.5。
在某些实施方案中，磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢胺、磷酸氢二胺中的一种或几种。
在某些实施方案中，磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钾。
在某些实施方案中，流动相A由0.03mol/L磷酸二氢钾溶液与乙腈按照体积比90：10的比例混合而成，流动相B是由乙腈与水按照体积比90：10的比例混合而成。
在某些实施方案中，梯度洗脱的过程为：于0-6分钟，流动相中A的体积占100％，流动相B的体积占0；于6-30分钟，流动相中A的体积从100％变化为92％，流动相B的体积从0变化为8％；于30-40分钟，流动相中A的体积从92％变化为100％，流动相B的体积从8％变化为0％。
实施例1高效液相色谱法测定甲钴胺颗粒的有关物质
检测方法的色谱条件：
所用的仪器为：岛津高效液相色谱仪；色谱柱：Phenomenex luna 5u C18(2)，规格为250mm×4.6mm；
流动相A：0.03mol/l磷酸二氢钾(pH4.5)-乙腈(90：10),
流动相B：乙腈-水(90：10)，采用梯度洗脱，梯度洗脱的程序为表1所示：
表1
时间(min) A(％) B(％)
0 100 0
6 100 0
6 92 8
30 92 8
30 100 0
40 100 0
空白溶液(稀释剂)为流动相A；
流速为1.0ml/min；
柱温为40℃；
进样体积为100μl；
样品盘温度为6℃。
溶液的配制：
(1)对照品的制备：精密称取甲钴胺和羟钴胺对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含1ug的混合溶液，作为对照品溶液。
(2)供试品溶液的配制：精密称取适量甲钴胺颗粒，加稀释剂溶解并稀释成每1ml中约含0.1mg甲钴胺的溶液，作为供试品溶液。
(3)灵敏度溶液的配制：精密量取适量对照品溶液置于量瓶中，加流动相A定量稀释制成0.05ug/ml的溶液，作为灵敏度溶液。
精密吸取灵敏度溶液、对照品溶液、空白溶液、供试品溶液各100μl，注入高效液相色谱仪进行测定，得到色谱图。
根据色谱图，采用外标法计算羟钴胺和其他未知单杂的含量。
结果表明，空白溶剂不干扰检测。对照品溶液中，甲钴胺RSD％符合要求，系统适用性溶液中甲钴胺和相邻峰的分离度≮1.5，符合标准。
综上所述：通过对磷酸盐缓冲液在不同PH值，不同柱温以及不同流速下，其分离度、理论板数、信噪比等测定结果的差异，经筛选后，发现当磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾，浓度为0.03mol/L，PH值为4.5时，采用本发明提供的测定方法，检测结果最佳，杂质峰和甲钴胺峰的分离效果最优。
因此，本发明提供的一种快速、准确的检测甲钴胺颗粒有关物质的分析方法，能够更好的控制本产品质量，解决了本领域技术急需解决的技术难题。
从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本公开的具体实施方案，但是在不偏离本公开的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种变形或改进、这些变形或修改都应落入本公开所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取适量甲钴胺颗粒置于量瓶中，加入流动相A振摇使其溶解、稀释，制成浓度为0.1mg/ml的溶液；摇匀、离心，取上清液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取适量甲钴胺和羟钴胺对照品，加流动相A超声使其溶解，稀释，制成浓度为1ug/ml的对照品溶液；
(3)灵敏度溶液的制备：取适量对照品溶液置于量瓶中，加流动相A稀释，制成浓度为0.05ug/ml的灵敏度溶液；
(4)采用高效液相色谱测定有关物质的含量，具体为：
将步骤(3)制得的灵敏度溶液注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，再精密量取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(4)中色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A由磷酸盐缓冲液和乙腈组成，流动相B由乙腈和水组成；检测波长为300-360nm，进样量为100μl，柱温为40℃，流速为0.5-1.5ml/min；以及采用梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，检测波长为342nm，流速为1.0ml/min。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/L，PH值为3.5-5.0。
5.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L，PH值为4.5。
6.根据权利要求4或5所述的测定方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢胺、磷酸氢二胺中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液选自磷酸二氢钾。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，流动相A由0.03mol/L磷酸二氢钾溶液与乙腈按照体积比90：10的比例混合而成，流动相B是由乙腈与水按照体积比90：10的比例混合而成。
9.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，梯度洗脱的过程为：于0-6分钟，流动相中A的体积占100％，流动相B的体积占0；于6-30分钟，流动相中A的体积从100％变化为92％，流动相B的体积从0变化为8％；于30-40分钟，流动相中A的体积从92％变化为100％，流动相B的体积从8％变化为0％。
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