CN113075331A - 一种甲钴胺片中有关物质新的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种甲钴胺中有关物质的测定方法，包括以下步骤：S1配制流动相：分别配制磷酸二氢钾溶液、流动相A溶液和流动相B溶液；S2配制供试品溶液；S3配制对照品储备溶液：分别配制羟钴胺储备溶液、维生素B12储备溶液和甲钴胺储备溶液；S4配制对照品溶液；S5配制辅料溶液；S6配制灵敏度溶液；S7配制系统适用性溶液；S8色谱分析测定，根据液相色谱图分析测定甲钴胺片杂质含量；该方法专属性更强，控制甲钴胺片杂质限度，从而更有效地控制产品质量，为有关物质研究提供一定的基础。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析的技术领域，具体涉及一种甲钴胺片中有关物质新的测定方法。
背景技术
甲钴胺为内源性维生素B12，存在于血液、髓液中，与维生素B12相比，其对神经元的传导有良好的改善作用，可通过甲基转换反应促进核酸-蛋白-脂肪代谢，其作为甲硫氨酸合成酶的辅酶，可使高半胱氨酸转化为甲硫氨酸，参与脱氧核苷合成胸腺嘧啶过程，促进核酸、蛋白合成，促进轴索内输送和轴索再生及髓鞘的形成，防止轴突变性，修复被损害的神经组织。甲钴胺片对周围神经病变具有良好的治疗作用，临床价值较高。
由于本身化学性质的不稳定，甲钴胺在强光下会降解生成羟钴胺。羟钴胺、甲钴胺原料及甲钴胺片制备及储运过程中可能引入的其他杂质统称为有关物质。目前，中国药典中甲钴胺片有关物质的检测方法比较简单，控制单杂≤1.0％、总杂≤3.0％，单杂限度较宽泛，对已知杂质羟钴胺及维生素B12未做限度控制，因此产品质量控制存在一定隐患。
中国发明专利CN104122363A公开了一种甲钴胺片有关物质的测定方法，包括如下步骤：①供试品的制备：②对照品的制备；③采用高效液相色谱测定有关物质的含量，色谱条件为：固定相是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相是由乙腈与磷酸盐缓冲液组成的混合液；检测波长为300～360nm，进样量为20μl，柱温为30℃，流速为0.5～1.5ml/min；梯度洗脱；④计算供试品中各杂质的含量，该方法虽然控制单杂含量≤1.0％，控制了总杂含量≤2.0％，但是单杂限度较宽泛，并且没有对RRT约1.09含量、RRT约1.20含量和羟钴胺含量做限度控制，因此还是对产品质量控制存在一定隐患。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种甲钴胺片中有关物质的测定方法，该方法专属性更强，控制甲钴胺片杂质限度(羟钴胺≤1.0％，杂质RRT约1.09≤0.5％，杂质RRT约1.20≤0.5％，单杂≤0.5％，总杂≤1％)，从而更有效地控制产品质量，为有关物质研究提供一定的基础。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种甲钴胺片中有关物质的测定方法，包括以下步骤：
S1配制流动相溶液：分别配制磷酸二氢钾溶液、流动相A溶液和流动相B溶液；
S2配制供试品溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，取适量甲钴胺片，加流动相A溶液超声使甲钴胺溶解，加流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液；
S3配制对照品储备溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，分别配制羟钴胺储备溶液、维生素B12储备溶液和甲钴胺储备溶液；
S4配制对照品溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，分别配制羟钴胺对照溶液、甲钴胺对照溶液和维生素B12对照溶液；
S5配制辅料溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，配制辅料溶液；
S6配制灵敏度溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，配制灵敏度溶液；
S7配制系统适用性溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，配制系统适用性溶液；
S8色谱分析测定，取系统适用性溶液，空白溶液，辅料溶液，灵敏度溶液，对照品溶液，供试品溶液适量，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，并根据液相色谱图分析测定甲钴胺片杂质含量。
本发明提供一种甲钴胺片中有关物质的测定方法，该方法专属性更强，控制甲钴胺片杂质限度(羟钴胺≤1.0％，杂质RRT约1.09≤0.5％，杂质RRT约1.20≤0.5％，其他单杂≤0.5％，总杂≤1％)，从而更有效地控制产品质量，为有关物质研究提供一定的基础。
进一步，步骤S1中配制流动相包括以下步骤：
配制磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾适量，加纯水溶解，混匀，用氢氧化钠溶液或磷酸溶液调节pH值，用水系滤膜过滤，即得磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液浓度为0.02mol/L-0.04mol/L；
配制流动相A溶液：取磷酸二氢钾溶液和乙腈，按比例混匀，超声脱气，即得流动相A溶液；
配制流动相B溶液：取乙腈和水按比例混合，超声脱气，即得流动相B溶液。
进一步，所述供试品溶液浓度为0.4-0.6mg/ml。
进一步，步骤S3中配制对照品储备溶液包括以下步骤：
配制羟钴胺储备溶液：称取羟钴胺对照品适量，置于棕色容量瓶中，加流动相A溶液适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，即得羟钴胺储备溶液；
配制维生素B12储备溶液：称取维生素B12对照品适量，置于棕色容量瓶中，加流动相A溶液适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，即得维生素B12储备溶液；
配制甲钴胺储备溶液：称取甲钴胺对照品适量，置于棕色容量瓶中，加流动相A溶液适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，即得甲钴胺储备溶液；
配制的供试品储备液浓度为450-550μg/ml。
进一步，步骤S4中配制对照品溶液，包括以下步骤：
移取甲钴胺储备溶液，维生素B12储备溶液，羟钴胺储备溶液适量，分别置于棕色容量瓶中，用流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，即得羟钴胺对照溶液、甲钴胺对照溶液和维生素B12对照溶液，其中羟钴胺对照溶液浓度为4.5-5.5μg/ml，甲钴胺对照溶液浓度为4.5-5.5μg/ml，维生素B12对照溶液浓度为2.25-2.75μg/ml。
进一步，步骤S5中配制辅料溶液，包括以下步骤：
称取供试品溶液适量，置于棕色容量瓶中，加适量流动相A溶液，振荡使溶解，用流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作为辅料溶液，辅料溶液的浓度为90-98mg/ml。
进一步，步骤S6中配制灵敏度溶液，包括以下步骤：
配制灵敏度储备溶液B：移取甲钴胺储备溶液置于棕色容量瓶中，用流动相A溶液定容，摇匀，即得灵敏度储备溶液B；
配制灵敏度溶液：移取灵敏度储备溶液B置于量瓶中，加入流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，即得灵敏度溶液，灵敏度溶液浓度为0.03-0.07％。
进一步，步骤中S7配制系统适用性溶液，包括以下步骤：
取甲钴胺对照品适量，加盐酸溶液，避光放置，立即加入氢氧化钠溶液适量，摇匀，即得系统适用性溶液，系统适用性溶液浓度为0.45-0.55mg/ml。
进一步，步骤S8中液相色谱仪所采用的色谱柱利用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
进一步，色谱柱中的流动相A为磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液，流动相B为乙腈-水溶液。
进一步，空白溶液为流动相A。
进一步，步骤S8中液相色谱仪所采用的色谱柱为Agilent C18柱，该色谱柱的规格为长度250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
进一步，步骤S8中该方法的色谱条件为：色谱柱中的流动相A为磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液、流动相B为乙腈-水溶液，流速为1.0ml/min，检测波长为342nm，色谱柱柱温为40℃，进样室温度为6℃，进样量为20μl。
进一步，步骤S8中液相色谱图的记录时间为40min。
进一步，步骤S8中洗脱方式为梯度洗脱。
本发明提供一种甲钴胺中有关物质的测定方法，具有以下有益效果为：
本发明设计流动相A、灵敏度溶液、系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液，通过配合，进行色谱分析测定，可以准确的测定甲钴胺片中有关物质的含量；本发明的检测方法专属性更强，控制甲钴胺片杂质限度(羟钴胺≤1.0％，杂质RRT约1.09≤0.5％，杂质RRT约1.20≤0.5％，其他单杂≤0.5％，总杂≤1％)，从而更有效地控制产品质量，为有关物质研究提供一定的基础。
附图说明
图1为本发明的系统适用性溶液的液相色谱图；
图2为本发明的空白溶液的液相色谱图；
图3为本发明的辅料溶液的液相色谱图；
图4为本发明的对照品溶液的液相色谱图；
图5为本发明的供试品溶液的液相色谱图。
具体实施方式
为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明提供的一种甲钴胺中有关物质的测定方法，做进一步详细的描述。
一种甲钴胺中有关物质的测定方法，包括如下步骤：
S1配制流动相，包括以下步骤：
磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾适量，加纯水溶解，混匀，用氢氧化钠溶液或磷酸溶液调节pH值，用水系滤膜过滤，即得磷酸二氢钾溶液。
流动相A：取磷酸二氢钾溶液和乙腈，按比例混匀，超声脱气，即得流动相A。
流动相B：取乙腈和水按比例混合，超声脱气，即得流动相B。
S2配制供试品溶液(避光操作，光强度≤5lx)，包括以下步骤：
取本品适量，置棕色容量瓶中，加流动相A超声使甲钴胺溶解，加流动相A稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液。
S3配制对照品储备溶液(避光操作，光照强度≤5lx)，包括以下步骤：
羟钴胺储备溶液：精密称取羟钴胺对照品适量，置于棕色量瓶中，加流动相A适量超声溶解后稀释，摇匀，作为羟钴胺储备溶液；
维生素B12储备溶液：精密称取维生素B12对照品适量，置于棕色量瓶中，加流动相A适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，作为维生素B12储备溶液；
甲钴胺储备溶液：精密称取甲钴胺对照品适量，置于棕色量瓶中，加流动相A适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，作为甲钴胺储备溶液。
S4配制对照品溶液(避光操作，光照强度≤5lx)，包括以下步骤：
精密移取甲钴胺储备溶液，维生素B12储备溶液，羟钴胺储备溶液适量，置于棕色容量瓶中，用流动相A稀释，摇匀，作为对照品溶液。
S5配制辅料溶液，包括以下步骤：
称取供试品浓度的辅料适量，置于棕色容量瓶中，加适量流动相A，振荡使溶解，用流动相A稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为辅料溶液。
S6配制灵敏度溶液(避光操作，光强度≤5lx)，包括以下步骤：
灵敏度储备溶液B：精密移取甲钴胺储备溶液置于棕色容量瓶中，用流动相A定容，摇匀，作为灵敏度储备溶液B。
灵敏度溶液：精密移取灵敏度储备溶液B置于量瓶中，加入流动相A稀释，摇匀，作为灵敏度溶液。
S7配制系统适用性溶液(避光操作，光照强度≤5lx)，包括以下步骤：
取甲钴胺对照品适量，加盐酸溶液，避光放置，立即加入氢氧化钠溶液适量，摇匀。
S8色谱分析测定，包括以下步骤：
取系统适用性溶液，空白溶液，辅料溶液，灵敏度溶液，对照品溶液，供试品溶液适量，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，并根据液相色谱图分析测定甲钴胺片杂质含量。
步骤S1中，磷酸二氢钾溶液浓度为0.02mol/L-0.04mol/L。
步骤S2中，供试品溶液浓度为0.4-0.6mg/ml。
步骤S3中，供试品储备液浓度为450-550μg/ml。
步骤S4中，羟钴胺对照溶液浓度为4.5-5.5μg/ml，甲钴胺对照溶液浓度为4.5-5.5μg/ml，维生素B12对照溶液浓度为2.25-2.75μg/ml。
步骤S5中，辅料浓度为90-98mg/ml。
步骤S6中，灵敏度溶液浓度为0.05％。
步骤S7中，系统适用性溶液浓度为0.45-0.55mg/ml。
稀释液为流动相A。
空白溶液为流动相A。
步骤S8中，液相色谱仪所采用的色谱柱为Agilent C18柱，该色谱柱的规格为长度250mm，内径4.6mm，粒径5μm。该色谱柱利用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
步骤S8中该方法的色谱条件为：色谱柱中的流动相A为磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液、流动相B为乙腈-水溶液，流速为1.0ml/min，检测波长为342nm，色谱柱柱温为40℃，进样室温度为6℃，进样量为20μl。
另外，步骤S8中，液相色谱图的记录时间为40min；步骤S8的洗脱方式为梯度洗脱。
本发明提供的一种甲钴胺中有关物质的测定方法，做进一步详细的描述。
1.试剂与材料
采用的试剂和材料包括磷酸二氢钾(分析级或更高级别)，氢氧化钠(分析级或更高级别)，磷酸(分析级或更高级别)，乙腈(色谱级)，纯化水(ChP级)，甲钴胺片，甲钴胺对照品，羟钴胺对照品，维生素B12对照品。
2.仪器设备
液相色谱仪；
色谱柱：Agilent C18，4.6×250mm，5μm或效能相当色谱柱；
纯水制备仪；
分析天平；
超声仪；
pH计。
3.色谱条件
色谱柱：Agilent C18，250mm×4.6mm，5μm或效能相当色谱柱
进样室温度：6℃
柱温：40℃
流动相A：0.03mol/L磷酸二氢钾溶液(pH4.5)-乙腈(90:10)
流动相B：乙腈-水(90:10)
流速：1.0ml/min
检测波长：342nm
进样体积：20μl
洗脱方法：梯度
按照下表进行洗脱：
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 6 | 100 | 0 |
| 6 | 92 | 8 |
| 30 | 92 | 8 |
| 30 | 100 | 0 |
4.配制溶液
流动相配制，包括以下步骤：
0.03mol/L磷酸二氢钾溶液(pH4.5)：称取磷酸二氢钾4.08g，加纯化水至1000ml，溶解，混匀，用0.2mol/L氢氧化钠溶液(称取氢氧化钠0.8g，加纯化水100ml，溶解，混匀，即得。)或磷酸调节pH值至4.5，用0.45μm水系滤膜滤过，即得。
流动相A：取0.03mol/L磷酸二氢钾溶液(pH4.5)和乙腈，按(90:10)(v/v)混匀，脱气，即得。
流动相B：按照乙腈-水(90:10)(v/v)混匀，脱气，即得。
空白溶液：流动相A。
稀释剂：流动相A。
供试品溶液配制(避光操作，光强度≤5lx)，包括以下步骤：
取本品10片(约相当于甲钴胺5mg)，置于10ml棕色容量瓶中，加流动相A超声使甲钴胺溶解，放至室温，加流动相A定容，摇匀，过滤，弃去1ml，取滤液作为供试品溶液，供试品溶液冷藏6℃条件下48h稳定。
对照品储备溶液(避光操作，光照强度≤5lx)配制，包括以下步骤：
羟钴胺储备溶液(500μg/ml)：精密称取约10mg(9mg-11mg)羟钴胺对照品置20ml棕色量瓶中，加流动相A适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，作为羟钴胺储备溶液。
维生素B12储备溶液(500μg/ml)：精密称取约25mg(22.5mg-27.5mg)维生素B12对照品置50ml棕色量瓶中，加流动相A适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，作为维生素B12储备溶液。
甲钴胺储备溶液(500μg/ml)：精密称取约25mg(22.5mg-27.5mg)甲钴胺对照品置50ml棕色量瓶中，加流动相A适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，作为甲钴胺储备溶液。
各储备溶液冷藏4℃条件下6天稳定。
对照品溶液配制(避光操作，光强度≤5lx)，包括以下步骤：
精密移取1.0ml甲钴胺储备溶液，0.5ml维生素B12储备溶液，1.0ml羟钴胺储备溶液置于100ml棕色容量瓶中，用流动相A定容，摇匀。对照品溶液冷藏6℃条件下48h内稳定。
灵敏度溶液(0.05％)配制(避光操作，光强度≤5lx)，包括以下步骤：
灵敏度储备溶液B：精密移取1.0ml甲钴胺储备溶液置于20ml棕色容量瓶中，用流动相A定容，摇匀，作为灵敏度储备溶液B；
灵敏度溶液：精密移取灵敏度储备溶液B1.0ml置于100ml量瓶中，加入流动相A稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液(0.05％)，灵敏度溶液冷藏6℃条件下48h内稳定。
系统适用性溶液配制(避光操作，光强度≤5lx)，包括以下步骤：
取甲钴胺对照品约5mg(4.5mg-5.5mg)，加1mol/L盐酸溶液5.0ml，避光放置1h，立即加入1mol/L的氢氧化钠溶液5.0ml，摇匀，系统适用性溶液常温下5天稳定。
色谱测定，包括以下步骤：
取系统适用性溶液，空白溶液，辅料溶液，灵敏度溶液，对照品溶液，供试品溶液适量，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
图1-5为所得到的各个液相色谱图。图1为系统适用性溶液的液相色谱图；图2为空白溶液的液相色谱图；图3为辅料的液相色谱图；图4为对照品溶液的液相色谱图，甲钴胺峰面积平均值为62.47；图5为供试品溶液的液相色谱图，单个杂质峰面积分别为羟钴胺3.30、维生素B12未检出、未知单杂10.97、未知单杂3.24、RRT(约为1.09)19.12、未知单杂4.12、RRT(约为1.20)6.39。
甲钴胺片中有关物质的含量计算公式为：
式中：
Ws：甲钴胺对照品的称样量；
Ai：供试品溶液中杂质的峰面积；
As：对照品溶液中甲钴胺的峰面积；
Vs：甲钴胺对照品溶液的稀释倍数；
P：甲钴胺对照品的含量(湿品计)；
Vu：供试品的稀释倍数；
LC：标示量；
N：片剂数。
式中：
Ws：羟钴胺对照品的称样量；
P：羟钴胺的含量；
Si：供试品中羟钴胺的峰面积；
Vu：供试品的稀释倍数；
Ss：羟钴胺对照品的峰面积；
Vs：羟钴胺对照品的稀释倍数；
LC：标示量；
N：片剂数。
式中：
Ws：维生素B12对照品的称样量；
P：维生素B12的含量；
Si：供试品中维生素B12的峰面积；
Vu：供试品的稀释倍数；
Ss：维生素B12对照品的峰面积；
Vs：维生素B12对照品的稀释倍数；
LC：标示量；
N：片剂数。
总杂(％)＝其他单杂+RRT约1.09+RRT约1.20+羟钴胺+维生素B12按照上述公式以及各个色谱图结果，计算如下：
其他单杂(％)＝0.17％+0.05％+0.06％＝0.28％
维生素B12未检出
总杂(％)＝(0.28％+0.30％+0.10％+0.05％+0％)＝0.73％
本发明设计流动相A、灵敏度溶液、系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液，通过配合，进行色谱分析测定，可以准确的测定甲钴胺片中有关物质的含量；本发明的检测方法专属性更强，控制甲钴胺片杂质限度(羟钴胺含量为0.05％，杂质RRT约1.09含量为0.30％，杂质RRT约1.20含量为0.10％，其他单杂含量为0.28％，总杂含量为0.73％)，从而更有效地控制产品质量，为有关物质研究提供一定的基础。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
Claims (10)
1.一种甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1配制流动相溶液：分别配制磷酸二氢钾溶液、流动相A溶液和流动相B溶液；
S2配制供试品溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，取适量甲钴胺片，加流动相A溶液超声使甲钴胺溶解，加流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液；
S3配制对照品储备溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，分别配制羟钴胺储备溶液、维生素B12储备溶液和甲钴胺储备溶液；
S4配制对照品溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，分别配制羟钴胺对照溶液、甲钴胺对照溶液和维生素B12对照溶液；
S5配制辅料溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，配制辅料溶液；
S6配制灵敏度溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，配制灵敏度溶液；
S7配制系统适用性溶液：在避光环境下，光强度≤5lx条件下，配制系统适用性溶液；
S8色谱分析测定，取系统适用性溶液，空白溶液，辅料溶液，灵敏度溶液，对照品溶液，供试品溶液适量，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，并根据液相色谱图分析测定甲钴胺片杂质含量。
2.根据权利要求1所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，步骤S1中配制流动相包括以下步骤：
配制磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾适量，加纯水溶解，混匀，用氢氧化钠溶液或磷酸溶液调节pH值，用水系滤膜过滤，即得磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液浓度为0.02mol/L-0.04mol/L；
配制流动相A溶液：取磷酸二氢钾溶液和乙腈，按比例混匀，超声脱气，即得流动相A溶液；
配制流动相B溶液：取乙腈和水按比例混合，超声脱气，即得流动相B溶液。
3.根据权利要求1所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，所述供试品溶液浓度为0.4-0.6mg/ml。
4.根据权利要求1所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，步骤S3中配制对照品储备溶液包括以下步骤：
配制羟钴胺储备溶液：称取羟钴胺对照品适量，置于棕色容量瓶中，加流动相A溶液适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，即得羟钴胺储备溶液；
配制维生素B12储备溶液：称取维生素B12对照品适量，置于棕色容量瓶中，加流动相A溶液适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，即得维生素B12储备溶液；
配制甲钴胺储备溶液：称取甲钴胺对照品适量，置于棕色容量瓶中，加流动相A溶液适量超声溶解后稀释至刻度，摇匀，即得甲钴胺储备溶液；
配制的供试品储备液浓度为450-550μg/ml。
5.根据权利要求1所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，步骤S4中配制对照品溶液，包括以下步骤：
移取甲钴胺储备溶液，维生素B12储备溶液，羟钴胺储备溶液适量，分别置于棕色容量瓶中，用流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，即得羟钴胺对照溶液、甲钴胺对照溶液和维生素B12对照溶液，其中羟钴胺对照溶液浓度为4.5-5.5μg/ml，甲钴胺对照溶液浓度为4.5-5.5μg/ml，维生素B12对照溶液浓度为2.25-2.75μg/ml。
6.根据权利要求1所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，步骤S5中配制辅料溶液，包括以下步骤：
称取供试品溶液适量，置于棕色容量瓶中，加适量流动相A溶液，振荡使溶解，用流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作为辅料溶液，辅料溶液的浓度为90-98mg/ml。
7.根据权利要求1所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，步骤S6中配制灵敏度溶液，包括以下步骤：
配制灵敏度储备溶液B：移取甲钴胺储备溶液置于棕色容量瓶中，用流动相A溶液定容，摇匀，即得灵敏度储备溶液B；
配制灵敏度溶液：移取灵敏度储备溶液B置于量瓶中，加入流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，即得灵敏度溶液，灵敏度溶液浓度为0.03-0.07％。
8.根据权利要求1所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，步骤中S7配制系统适用性溶液，包括以下步骤：
取甲钴胺对照品适量，加盐酸溶液，避光放置，立即加入氢氧化钠溶液适量，摇匀，即得系统适用性溶液，系统适用性溶液浓度为0.45-0.55mg/ml。
9.根据权利要求1所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，步骤S8中液相色谱仪所采用的色谱柱利用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
10.根据权利要求9所述的甲钴胺片中有关物质的测定方法，其特征在于，色谱柱中的流动相A为磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液，流动相B为乙腈-水溶液。
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