CN118050461A - 一种咪唑乙酸中甲基咪唑乙酸杂质的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种咪唑乙酸及其甲基咪唑乙酸杂质的HPLC检测方法；咪唑乙酸中杂质2‑甲基咪唑乙酸和4‑甲基咪唑乙酸的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法，采用耐碱的C18填料的色谱柱，流动相A：磷酸盐缓冲溶液和离子对试剂，流动相B：甲醇；等度洗脱，检测器为紫外检测器，检测波长为200nm～220nm。本发明提供的检测方法，可实现咪唑乙酸中至少两种甲基咪唑乙酸杂质的良好分离，检测成本低且具有良好的灵敏度、专属性和准确度，是咪唑乙酸质量控制行之有效的检测方法，从而进一步地保证以咪唑乙酸为中间体合成所得的唑来膦酸原料药及相关制剂的产品质量和患者用药安全。
Description
技术领域
本发明属药物分析检测领域，具体涉及一种唑来膦酸中间体(咪唑乙酸)中甲基咪唑乙酸杂质的检测方法，尤其涉及一种HPLC法测定咪唑乙酸中2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸的检测方法。
背景技术
药物中的杂质指药物生产、存储或者使用过程中引进或产生的目标化合物以外的所有其他化学物质。药物中的杂质直接影响药物的疗效并可能导致其他不良的副作用，必须加以控制。
咪唑乙酸作为唑来膦酸的中间体，其中的杂质含量需加以控制；由于咪唑中存在间位或邻位取代的甲基咪唑杂质较普遍，在咪唑参与反应生成咪唑乙酸的过程中，甲基咪唑杂质亦会参与反应进入到唑来膦酸的中间体(咪唑乙酸)中，除唑来膦酸中间体(咪唑乙酸)目标产物外，同时可能形成甲基咪唑乙酸的杂质，因此需要在中间体(咪唑乙酸)中控制该杂质，防止唑来膦酸中的杂质超标。基于上述信息，建立一个专属性强、灵敏度高的咪唑乙酸中甲基咪唑乙酸杂质的检测方法，十分必要。
高效液相色谱仪(HPLC)是药品分析中最常用的仪器之一，而紫外检测器(UV)是高效液相色谱仪中最常用的检测器。咪唑乙酸、2-甲基咪唑乙酸、4-甲基咪唑乙酸在常规反相色谱中保留较弱，容易在死体积中出峰且各成分间无法完全分离。
发明内容
针对检测的需要，本发明公开了一种咪唑乙酸中2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸的检测方法，该方法可用于咪唑乙酸中甲基咪唑乙酸杂质的检测。本发明中所述检测方法，以外标法进行定量，采用甲基咪唑乙酸杂质对相应杂质进行检测。该法准确度高，灵敏度高，检测方便快捷。
本发明所述的HPLC-UV检测方法，属于反相色谱法，使用的高效液相色谱仪需具备在线真空脱气机、双泵或四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器或二极管阵列检测器。
本发明具体技术方案如下：
采用反相液相色谱法对咪唑乙酸中2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸杂质进行检测，采用耐碱的C18柱，流动相A为磷酸盐缓冲溶液，流动相B为甲醇；等度洗脱，检测器为紫外检测器，检测波长为200nm～220nm，等度采集30分钟。所述磷酸盐缓冲液中添加了离子对试剂。
优选的，采用YMC的C18柱进行分析。
流动相以磷酸盐缓冲液为流动相A，甲醇为流动相B。
本发明所述的检测方法，流动相A为磷酸盐缓冲液，缓冲液中加入离子对试剂，pH值为7.6～8.0。
优选的，所述离子对试剂为四丁基氢氧化铵和乙二胺四乙酸二钠。优选流动相A中四丁基氢氧化铵的质量百分浓度为0.062％，乙二胺四乙酸二钠的质量百分浓度为0.0007％。
优选的，磷酸盐缓冲液的pH值是7.8。
优选的，流动相A-流动相B的体积比为90:10～94:6，优选94:6。
优选的，流动相的流速为1.0～1.2ml/min，优选1.0ml/min。
优选的，色谱柱的柱温为30～40℃，优选35℃。
检测器为紫外检测器，优选的检测波长为215nm。
优选的进样量为20～50μl，优选30μl。
本发明的有益效果：
本发明基于反相色谱的基础上，通过在流动相中添加离子对试剂来延长弱保留物质的出峰时间，使甲基咪唑乙酸杂质与咪唑乙酸之间的分离度达到检测要求，从而能够快速检测咪唑乙酸产品中杂质的含量，进而保证唑来膦酸的质量，从而进一步地保证相关药品的产品质量和患者用药安全。
采用外标法计算咪唑乙酸中2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸杂质的含量。因4-甲基咪唑与5-甲基咪唑互为异构体，咪唑在取代过程中，4-甲基咪唑与5-甲基咪唑同时存在，因此4-甲基咪唑乙酸在色谱图上表现为双峰，以两个峰面积之和计算杂质的总量，合并控制。方法学验证的结果显示咪唑乙酸、2-甲基咪唑乙酸及4-甲基咪唑乙酸之间分离度良好，各成分间分离度均符合要求，不干扰各待测成分间的检测，该方法专属性良好。此外，方法的检测灵敏度高，2-甲基咪唑定量限可达到0.0284μg/ml；线性关系良好(r>0.999)；重复性和中间精密度的RSD分别为0.23％和0.70％；平均回收率在100.1～103.9％之间(RSD<2.0％)，空白溶剂无干扰；且2-甲基咪唑乙酸对照品溶液在7天内稳定性良好。4-甲基咪唑乙酸定量限可达到0.01554μg/ml；线性关系良好(r>0.999)；重复性和中间精密度的RSD分别为1.8％和0.48％；平均回收率在100.2～110.2％之间(RSD<2.5％)，空白溶剂无干扰；且4-甲基咪唑乙酸对照品溶液在7天内稳定性良好。
附图说明
图1为实施例1中YMC C18色谱柱对咪唑乙酸中甲基咪唑乙酸杂质的分离效果色谱图(流动相pH值为7.8，流速1.2ml/min，10％甲醇，柱温35℃)。
图2为实施例2中YMC C18色谱柱对系统溶液的分离效果色谱图。(流动相pH值为7.8，流速1.2ml/min，6％甲醇，柱温35℃)。
图3为实施例3中YMC C18色谱柱，系统溶液在不同色谱柱温度下的分离效果色谱图。(流动相pH值为7.8，流速1.2ml/min，6％甲醇，柱温30℃-40℃，进样体积20μl)。
图4为实施例4中YMC C18色谱柱，系统溶液的分离效果色谱图(流动相pH值为7.8，流速1.0ml/min，6％甲醇，柱温35℃，进样体积30μl)。图5为实施例5中溶剂对各组分测定的干扰情况以及各成分峰之间的分离情况色谱图。
图6为实施例5中以浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，按最小二乘法作线性回归方程，2-甲基咪唑乙酸在0.2963～2.963μg/ml的范围内线性关系结果。
图7为实施例5中以浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，按最小二乘法作线性回归方程4-甲基咪唑乙酸在0.3055～3.055μg/ml的范围内线性关系结果。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义；下面将结合具体实施例和试验例对本发明进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
实验仪器：高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)；色谱条件：色谱柱为YMC-C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相流速：1.2ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；等度采集30分钟。
实验步骤：
流动相：取磷酸氢二钠5.3g和10％四丁基氢氧化铵溶液62.2ml，加水1000ml，加乙二胺四乙酸二钠储备液2ml，混匀，用磷酸调节pH值至7.8-甲醇(90:10，v/v)。
杂质贮备液：取2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸杂质对照品各适量，精密称定，加溶剂(即流动相)溶解并稀释制成每ml各约含15μg的溶液，作为杂质贮备液。
杂质定位溶液：取上述各杂质贮备液1ml，分别至不同10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。(1.5μg/ml)
系统溶液：取咪唑乙酸10mg，至10ml量瓶中，分别加入上述杂质贮备液各1ml，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
取上述各杂质定位溶液与系统溶液各20μl分别注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。结果见图1所示，结果显示在此色谱条件下，出峰顺序为2-甲基咪唑乙酸、咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸，2-甲基咪唑与咪唑乙酸的分离度小于1.5，4-甲基咪唑乙酸为双峰且与咪唑乙酸的分离度大于1.5；流动相中有机相比例需降低或者调节柱温改善各成分间的分离度。
实施例2本发明所述检测方法进行优化，流动相比例的调整
实验仪器：高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)；色谱条件：色谱柱为YMC-C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相流速：1.2ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；等度采集30分钟。
实验步骤：
流动相：取磷酸氢二钠5.3g和10％四丁基氢氧化铵溶液62.2ml，加水1000ml，加乙二胺四乙酸二钠储备液2ml，混匀，用磷酸调节pH值至7.8-甲醇(94:6)。
取实施例1中杂质定位溶液与系统溶液各20μl分别注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。结果见图2所示，结果显示在此色谱条件下，2-甲基咪唑与咪唑乙酸的分离度为2.0，4-甲基咪唑乙酸为双峰且与咪唑乙酸的分离度大于1.5；说明流动相比例调整对2-甲基咪唑乙酸和咪唑乙酸间分离度有提高。
实施例3柱温的筛选
实验仪器：高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)；色谱条件：色谱柱为YMC-C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相流速：1.2ml/min；柱温：30℃、35℃、40℃；检测波长：215nm；等度采集30分钟。
实验步骤：
流动相：取磷酸氢二钠5.3g和10％四丁基氢氧化铵溶液62.2ml，加水1000ml，加乙二胺四乙酸二钠储备液2ml，混匀，用磷酸调节pH值至7.8-甲醇(94:6)。
取实施例1中杂质定位溶液与系统溶液，分别采用不同色谱柱温度的色谱条件进行系统溶液的分离检测，记录色谱图。不同色谱柱温度的色谱条件下洗脱的系统溶液对比图见图3所示，结果见下表，
随着色谱柱温度的降低，2-甲基咪唑乙酸与咪唑乙酸之间的分离度逐渐增大，4-甲基咪唑乙酸为双峰且与咪唑乙酸的分离度均大于1.5；说明色谱柱温度有利于2-甲基咪唑乙酸与咪唑乙酸的分离，考虑到实际环境的可控因素，优选色谱柱柱温为35℃。
实施例4流动相流速的筛选
实验仪器：高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)；色谱条件：色谱柱为YMC-C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；等度采集30分钟。
实验步骤：
流动相：取磷酸氢二钠5.3g和10％四丁基氢氧化铵溶液62.2ml，加水1000ml，加乙二胺四乙酸二钠储备液2ml，混匀，用磷酸调节pH值至7.8-甲醇(94:6)。
取实施例1中杂质定位溶液与系统溶液各30μl注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测(仅改变流速)，记录色谱图。结果如图4所示，随着流动相流速的降低，各成分的保留时间有所推后，流速为1.0ml/min时，2-甲基咪唑乙酸的保留时间为6.599min，咪唑乙酸的保留时间为7.520min；2-甲基咪唑与咪唑乙酸的分离度随流速的降低而增大，两者的分离度约为2.1，各成分峰型良好，4-甲基咪唑乙酸与咪唑乙酸间分离度远大于1.5，同时其余杂峰不干扰目标杂质的检测。因此优选流动相流速为1.0ml/min。
实施例5方法学验证与应用
5.1专属性
溶剂：取流动相适量即得。
2-甲基咪唑乙酸定位溶液：取2-甲基咪唑乙酸对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每ml约含1.5μg的溶液，摇匀，即得。
4-甲基咪唑乙酸定位溶液：取4-甲基咪唑乙酸对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每ml约含1.5μg的溶液，摇匀，即得。
供试品溶液：取咪唑乙酸适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每ml约含1mg的溶液，摇匀，即得。
供加标溶液：取咪唑乙酸、2-甲基咪唑乙酸对照品和4-甲基咪唑乙酸对照品各适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每ml约含咪唑乙酸1mg、2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸各1.5μg的混合溶液，摇匀，即得。
取溶剂、各定位溶液、供试品溶液和供试品加标溶液，按实施例4项下色谱条件进样。考察溶剂对各组分测定的干扰情况以及各成分峰之间的分离情况。色谱图见图5，溶剂不干扰各待测组分的测定，出峰顺序为2-甲基咪唑乙酸、咪唑乙酸、4-甲基咪唑乙酸，各组分与相邻峰之间的分离度符合要求且不干扰待测组分的测定。说明方法的专属性良好。
5.2线性
取2-甲基咪唑乙酸与4-甲基咪唑乙酸对照品各适量，精密称定，加溶剂溶解并制成每ml约含6μg/ml的对照品贮备液，分别精密量取上述对照品贮备液适量，用溶剂稀释制成0.3μg/ml、0.6μg/ml、0.9μg/ml、1.5μg/ml、2.25μg/ml和3.0μg/ml的线性测试溶液，依法测定。以浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，按最小二乘法作线性回归方程。结果2-甲基咪唑乙酸在0.2963～2.963μg/ml的范围内线性关系良好，相关系数r＞0.9998。结果见图6。4-甲基咪唑乙酸在0.3055～3.055μg/ml的范围内线性关系良好，相关系数r＞0.9998。结果见图7。
5.3灵敏度
取线性测定项下的2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸对照品贮备液各适量，逐级稀释，制成不同浓度的灵敏度测试溶液，依法进样分析，测定2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸的峰高及其峰附近的基线噪音，按信噪比(S/N)均不低于3∶1计算检测限；按信噪比(S/N)均不低于10∶1计算定量限。
结果显示，2-甲基咪唑乙酸的检测限为0.009459μg/ml，定量限为0.0284μg/ml；4-甲基咪唑乙酸(以双峰中较小峰计)的检测限为0.05181μg/ml，定量限为0.01554μg/ml；方法的灵敏度高，满足检测要求。
5.4精密度试验
照5.1项下内容分别配制2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸对照品溶液(即定位溶液)、供试品溶液和供试品加标溶液，按照外标法计算供试品加标溶液中2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸的含量，考察供试品加标溶液中2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸的回收率，并计算6份测定结果的相对标准偏差。由两人分别于不同天、采用不同色谱仪进行检测。
2-甲基咪唑乙酸精密度结果：人员A的6份回收率在100.1％～100.7％之间，RSD为0.23％；人员B的6份回收率在101.8％～103.9％之间，RSD为0.70％；两人12份回收率的RSD为1.3％。4-甲基咪唑乙酸精密度结果：人员A的6份回收率在100.2％～101.0％之间，RSD为0.31％；人员B的6份回收率在101.6％～103.1％之间，RSD为0.48％；两人12份回收率的RSD为1.0％。说明本方法的精密度良好。
5.5准确度
取2-甲基咪唑乙酸与4-甲基咪唑乙酸对照品各适量，精密称定，加溶剂溶解并制成每ml约含15μg/ml的对照品母液，精密量取上述对照品母液各5ml置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度做为混合对照品储备液；精密量取混合对照品储备液0.5ml、1ml、2ml、2.4ml，分别加入供试品中依法制备不同浓度水平的供试品加标溶液，结合平行测定的供试品溶液中的本底量，考察2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸的加样回收率，每个浓度平行考察3份。
回收率＝(供试品加标溶液中的测得量-供试品溶液中的本底量)/加入量。
实验结果表明：2-甲基咪唑乙酸的回收率在99.6％～101.9％之间，12份溶液回收率均值为100.5％，RSD为0.59％；4-甲基咪唑乙酸的回收率在97.1％～100.6％之间，12份溶液回收率均值为99.7％，RSD为1.1％；本方法准确度良好。
5.6溶液稳定性
取5.5准确度项下的2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸对照品贮备液，依法制备2-甲基咪唑和4-甲基咪唑对照品溶液，并于自动进样器中放置不同时间后重复进样，依据各待测组分峰面积的变化情况考察对照品溶液的稳定性。
实验结果表明，室温条件下，在72小时内，2-甲基咪唑乙酸峰面积变化程度＜±1.0％，峰面积的RSD为0.42％，2-甲基咪唑乙酸的稳定性良好。4-甲基咪唑乙酸峰面积变化程度＜±1.0％，峰面积的RSD为0.92％，4-甲基咪唑乙酸的稳定性良好。
实施例6样品检测
磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠5.3g，10％四丁基氢氧化铵溶液62.3ml，加水1000ml使溶解，加乙二胺四乙酸二钠溶液2ml，混匀，用磷酸调节pH值至7.8)：甲醇-(94:6)；作为空白溶液。
依法制备取2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸对照品贮备液，精密量取1ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液，依法进样分析。(1.5μg/ml)
精密称定待测样品10mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，依法进样分析。
按照外标法以峰面积计算2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸的含量。取用不同时间生产的6批样品进行测定。
本发明方法对6批咪唑乙酸中2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸含量的检测结果见下表，
| 样品批号 | 2-甲基咪唑乙酸含量％ | 4-甲基咪唑乙酸含量％ |
| Int-20220102 | 未检出 | 未检出 |
| Int-20220103 | 未检出 | 未检出 |
| Int-20220201 | 未检出 | 未检出 |
| Int-20210721 | 未检出 | 0.006 |
| Int-20210901 | 0.050 | 0.050 |
| Int-20210902 | 0.030 | 0.040 |
Claims (10)
1.咪唑乙酸中杂质2-甲基咪唑乙酸和4-甲基咪唑乙酸的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法，采用耐碱的C18填料的色谱柱，流动相A：磷酸盐缓冲溶液和离子对试剂，流动相B：甲醇；等度洗脱，检测器为紫外检测器，检测波长为200nm～220nm。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述耐碱的C18填料的色谱柱为YMC-C18，4.6mm×250mm，5μm。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述离子对试剂，为四丁基氢氧化铵和乙二胺四乙酸二钠。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液，pH值为7.6～8.0。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于磷酸盐缓冲液的pH值是7.8。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于采用等度洗脱时流动相A和B的体积比为90:10～94:6。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于采用等度洗脱时流动相A和B的体积比为94:6。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于流动相的流速为1.0～1.2ml/min，色谱柱柱温为30～35℃。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于流动相的流速为1.0ml/min，色谱柱柱温为35℃。
10.如权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于所述方法中咪唑乙酸与其2-甲基咪唑乙酸、4-甲基咪唑乙酸之间的分离度不低于1.5，其他峰不干扰两峰的检测，且方法的重复性、准确度及灵敏度均能满足检测要求。
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