CN114354789A - 一种同时测定卡博替尼类似物及其有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定卡博替尼类似物及其有关物质的高效液相色谱分析法，色谱条件为色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，以醋酸盐缓冲液‑乙腈(70：30)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，醋酸盐缓冲液的浓度为0.005～0.01mol/L，pH值为8.5～9.5，柱温为25～35℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为254nm，进样器温度为2～20℃，进样量为10μl。本发明所述测定方法可快速准确的检测出卡博替尼类似物及其有关物质，操作简单，重现性好，灵敏度高，可较好地控制卡博替尼类似物原料药产品质量，为合成工艺优化提供了保证。

Description

一种同时测定卡博替尼类似物及其有关物质的方法

技术领域

本发明涉及卡博替尼类似物原料药的分析方法，具体涉及一种用高效液相色谱梯度法进行测定的方法，属于药物分析检测领域。

背景技术

本发明所述的卡博替尼似物为(S)-2-(4-(7-(2-氟-4-(1-((4-氟苯基)氨甲酰基)环丙烷-1-甲酰胺)苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-1H-吡唑基-1-基)乙醇缬氨酸酯盐酸盐，分子式为C₃₄H₃₃ClF₂N₆O₅S，其化学结构式如(I)所示。

卡博替尼类似物是一类新药。目前在世界各国的药典及专利文献中未收录相关标准。

本文通过考察不同的流动相组成、比例、不同的洗脱方式，不同色谱柱及不同的无机盐首次实现了同时测定卡博替尼类似物及其有关物质的目的，很好地保证了卡博替尼类似物原料的质量可控。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时测定卡博替尼类似物及其有关物质的方法，可用于卡博替尼类似物制备过程及最终产品的质量控制。本发明提到的卡博替尼类似物有关物质包括卡博替尼类似物合成制备过程中的原料、中间体、催化剂等。

本发明的技术方案为：

一种利用高效液相色谱同时测定卡博替尼类似物及其有关物质的方法，卡博替尼类似物及其有关物质的名称、分子式及结构式如下表所示：

优选地，该检测方法用于同时检测卡博替尼类似物、杂质A和杂质B，包括以下步骤：

(1)系统适用性试验和灵敏度测试

制备系统适用性溶液：取卡博替尼类似物工作对照品、杂质A对照品和杂质B对照品与溶剂混合，制成浓度为0.005mg/ml～0.5mg/ml的系统适用性溶液；其中，所述溶剂由超纯水与乙腈以体积比为70:30混合而成；

制备灵敏度测试溶液：取卡博替尼类似物工作对照品，用所述溶剂定量稀释，制成浓度为0.1μg/ml的灵敏度测试溶液；

分别以所述系统适用性溶液和所述灵敏度测试溶液在以下色谱条件下进行系统适用性试验和灵敏度测试，校定检测系统；

所述色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，以醋酸盐缓冲液与乙腈比例为70：30的混合溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.005mol/L～0.01mol/L，pH值为8.5～9.5，所述色谱柱的柱温为25℃～35℃，流速为0.9ml/min～1.1ml/min，检测波长为254nm，进样器温度为2℃～20℃；

分别精密量取10μl所述系统适用性溶液和10μl所述灵敏度测试溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，校定检测系统至卡博替尼类似物的峰与杂质A和杂质B的峰之间的分离度大于1.5，所述灵敏度测试溶液的色谱图中卡博替尼类似物峰的信噪比不小于10。

(2)制备供试品溶液和对照品溶液；

取卡博替尼类似物待测样品，加所述溶剂制成浓度为0.5mg/ml的供试品溶液；

取卡博替尼类似物工作对照品，加所述溶剂制成浓度为5μg/ml的对照品溶液；

(3)通过高效液相色谱测定所述供试品溶液中卡博替尼类似物、杂质A和杂质B的含量

将所述对照品溶液注入步骤(1)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将所述供试品溶液注入所述液相色谱仪，在步骤(1)所述的色谱条件下进行高效液相色谱测定，记录色谱图；

(4)计算所述卡博替尼类似物待测样品中卡博替尼类似物、杂质A和杂质B的含量；

按外标法以峰面积计算卡博替尼类似物、杂质A和杂质B的含量。

合格的卡博替尼类似物原料药所包含的杂质A的含量不得大于0.50％(W/W)，杂质B的含量不得大于0.10％(W/W)，其他单个杂质不得大于0.20％(W/W)，各杂质总和不得大于2.0％(W/W)。

优选地，上述梯度洗脱为：0分钟～5分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从100％变化为80％，流动相B的比例从0％变化为20％；于5～16分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持80％不变，流动相B的比例保持20％不变；于16～17分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从80％变化为65％，流动相B的比例从20％变化为35％；于17～22分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持65％不变，流动相B的比例保持35％不变；于22～24分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从65％变化为30％，流动相B的比例从35％变化为70％；于24～29分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持30％不变，流动相B的比例保持70％不变；于29～32分钟，流动相A和B回到初始比例；于32～40分钟，色谱柱重新平衡。

优选地，上述醋酸盐选自醋酸铵。

优选地，上述醋酸盐缓冲液为浓度为0.005mol/L，pH值为9.0的醋酸铵溶液。

优选地，上述色谱柱为规格4.6mm×150mm，填料粒径3.5μm的十八烷基硅烷键合硅胶柱。

更优选地，上述色谱柱为Waters XBridge Shield RP18色谱柱。

优选地，上述卡博替尼类似物待测样品为卡博替尼类似物原料药。

本发明通过使用高效液相色谱梯度法同时测定卡博替尼类似物、杂质A和杂质B，通过对色谱条件的探索，确定了可以有效分离卡博替尼类似物、杂质A与杂质B及有关物质的色谱条件。本发明方法首次实现了同时测定卡博替尼类似物杂质A、杂质B及其他有关物质的含量，且专属性好、分离度佳、灵敏度高、重现性好，对评价合成工艺的优劣、终产品质量控制及稳定性样品检测具有重要的意义。

本发明方法适用于卡博替尼类似物原料药检测。本发明检测方法准确，操作简单，时间迅速，可以充分满足有关物质检查与分解产物测定的要求，较好地控制样品中的特定杂质与非特定杂质，保证产品质量，在实际质量控制工作中实用性强。

附图说明

图1为实施例2.1中色谱柱XBridge shield RP18(4.6×150mm，3.5μm)的色谱图；

图2为实施例2.1中色谱柱Inertsil ODS-SP(4.6×250mm，5μm)的色谱图；

图3为实施例2.1中色谱柱Poroshell 120 PFP(4.6×250mm，4μm)的色谱图；

图4为实施例2.1中色谱柱Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)的色谱图；

图5为实施例2.1中色谱柱Symmetry Shield RP18(4.6×250mm，5μm)的色谱图；

图6为实施例2.2中缓冲盐为0.02mol/L磷酸二氢钾pH4.0时的色谱图；

图7为实施例2.2中缓冲盐为0.02mol/L磷酸二氢钾pH6.0时的色谱图；

图8为实施例2.2中缓冲盐为5mM乙酸铵pH9.0时的色谱图；

图9为实施例2.3中流动相B为乙腈-甲醇(7：3)时的色谱图；

图10为实施例2.3中流动相B为乙腈-甲醇(7：3)时的色谱图；

图11为实施例2.4中梯度洗脱条件优化中第一组的色谱图；

图12为实施例2.4中梯度洗脱条件优化中第二组的色谱图；

图13为实施例2.4中梯度洗脱条件优化中第三组的色谱图；

图14为实施例2.4中梯度洗脱条件优化中第四组的色谱图；

图15为实施例3中未被破坏的供试品溶液的色谱图；

图16为实施例3中被高温破坏的供试品溶液的色谱图；

图17为实施例3中被光照破坏的供试品溶液的色谱图；

图18为实施例3中被碱破坏的供试品溶液的色谱图；

图19为实施例3中被酸破坏的供试品溶液的色谱图；

图20为实施例3中被氧化破坏的供试品溶液的色谱图；

图21为实施例4系统适用性试验色谱图；

图22为实施例5专属性试验空白溶剂色谱图；

图23为实施例6专属性试验供试品溶液谱图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

以下具体实施方式中，所使用的对照品、样品、试剂及仪器有：

仪器：Agilent 1260系列高效液相色谱仪；

试剂：醋酸铵(分析纯)，氨水(分析纯)，乙腈(色谱纯，Merck公司)

色谱柱：

Waters Waters XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×150mm，3.5μm)；

Inertsil ODS-SP，4.6×250mm，5μm；

Poroshell 120 PFP，4.6×250mm，4μm；

Eclipse XDB-C18，4.6×250mm，5μm；

Symmetry Shield RP18，4.6×250mm，5μm；

本发明提到的溶剂，如无特别说明，为超纯水与乙腈以体积比为70:30混合而成。

卡博替尼类似物原料药，来源：自制(深圳海王医药科技研究院有限公司化药室)，批号20210502、20211102；制备方法参考专利申请CN113336768A，《一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂》。

标准品的化学名、结构式及来源：

卡博替尼类似物工作对照品：

分子式：C₃₄H₃₃ClF₂N₆O₅S

分子量：711.18

批号：J20211201

纯度：99.6％

来源：自制(深圳海王医药科技研究院有限公司化药室)

包装：棕色玻璃瓶

贮藏：2～8℃，避光密封保存

化学名称：(S)-2-(4-(7-(2-氟-4-(1-((4-氟苯基)氨甲酰基)环丙烷-1-甲酰胺)苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-1H-吡唑基-1-基)乙醇缬氨酸酯盐酸盐

结构式：

杂质A对照品：

分子式：C₂₉H₂₃F₂N₅O₄S

分子量：575.59

批号：20210902

纯度：98.7％

来源：自制(深圳海王医药科技研究院有限公司化药室)

包装：棕色玻璃瓶

贮藏：2～8℃，避光密封保存

化学名称：(N-(3-氟-4-((2-(1-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-4-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氧代)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺

结构式：

杂质B对照品：

分子式：C₁₃H₈FIN₂OS

分子量：386.18

批号：BM-873

纯度：98.4％

来源：安庆博曼生物技术有限公司

包装：棕色玻璃瓶

贮藏：2～8℃，避光密封保存。

化学名称：3-氟-4-(2-碘噻吩并[3,2-b]吡啶-7-氧基)-苯胺

结构式：

【实施例1】制备检测用溶液

1.1制备杂质贮备液

称取上表中各杂质对照品各约10mg，分别置不同20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为各杂质贮备液。

1.2制备供试品溶液

精密称取卡博替尼类似物原料药约50mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

1.3制备加标供试品溶液

精密称取卡博替尼类似物原料药约50mg，置100ml量瓶中，加适量溶剂溶解后，分别移取杂质A贮备液和杂质B贮备液各1ml置于量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得加标供试品溶液。

【实施例2】色谱条件筛选

2.1色谱柱的选择

取由实施例1制备的供试品溶液和加标供试品溶液，分成5组，分别利用表1所示的色谱柱，按照以下色谱条件进行检测，分别获得色谱图如附图1～5所示。

表1色谱柱

流动相A：磷酸盐缓冲盐溶液(取磷酸二氢钾约2.72g，加水1000ml使溶解，用10％磷酸调节pH值至3.0)；

流动相B：乙腈；

流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长254nm，按照表2所示的梯度洗脱程序：

表2梯度洗脱

以主峰的保留时间、理论板数、拖尾因子以及杂质间分离度作为评价指标，对上述色谱柱进行比较，结果见表3。

表3不同色谱柱的检测结果

结果显示，采用Waters XBridge shield RP18(4.6mm×150mm，3.5μm)色谱柱，主峰保留时间约为19min，主峰与相邻杂质峰分离度最大，主峰拖尾因子最小，拖尾因子均较其他色谱柱好，但主峰拖尾因子仍大于1.5，会影响本品有关物质测定，因此，选择WatersXBridge shield RP18(4.6mm×150mm，3.5μm)色谱柱，通过调整流动相及梯度洗脱程序改善主峰拖尾。

2.2流动相A的选择

取实施例1的供试品溶液和加标供试品溶液，分成4组，分别采用表4中的流动相A，按照实施例2.1的色谱条件进行检测，其中色谱柱选用Waters XBridge shield RP18(4.6mm×150mm，3.5μm)，获得色谱图如附图6～图8所示。表4为采用不同流动相A进行检测的检测结果。

表4采用不同流动相A的检测结果

备注：根据Waters建议的缓冲盐体系，醋酸铵缓冲范围在pH8.2～10.2，磷酸盐在8.2以下或11.3～13.3，故pH9.0采用醋酸铵缓冲盐；

结果显示，0.02M磷酸二氢钾pH3.0和pH4.0条件下，主峰拖尾因子在1.91～1.94范围，拖尾较大，均不符合要求；在0.02M磷酸二氢钾pH6.0条件下，主峰拖尾因子为1.01，拖尾因子较好，但SM1与主峰重合，不符合检测要求；5mM醋酸铵缓冲盐pH9.0条件下，主峰拖尾因子为0.93，各杂质峰与相邻峰最小分离度为1.67，符合要求。故最终确定流动相A为pH9.0的醋酸铵缓冲盐溶液。

2.3流动相B的选择

取实施例1的供试品溶液和加标供试品溶液，分成3组，分别采用表5所示的流动相B，按照实施例2.2的色谱条件进行检测，其中，流动相A为pH9.0的醋酸铵缓冲盐溶液，获得色谱图如附图8～图10。表5为采用不同流动相B进行检测的检测结果。

表5采用不同流动相B的检测结果

结果显示，甲醇作为流动相B时，Z2和Z3重合，且主峰在51.845min出峰，出峰时间较晚，Z1未出峰；甲醇与乙腈(7：3)比例混合时，Z3和Z1重合。以乙腈为流动相B时，主峰拖尾因子为0.93，各杂质峰与相邻峰最小分离度为1.67，符合要求。因此，选择乙腈为流动相B。

2.4梯度洗脱程序

取实施例1的供试品溶液和加标供试品溶液，分成4组，分别采用表6、8、10和12的梯度洗脱程序，按照实施例2.3的色谱条件进行检测，其中，流动相B为乙腈，进样量10μl。

表6第一组梯度洗脱程序

检测结果见表7及图11。

表7第一组梯度洗脱结果

卡博替尼类似物主峰与杂质峰、杂质峰之间的分离度能达到要求，但主峰出峰时间较晚。

表8第二组梯度洗脱程序

试验结果见表9及图12。

表9第二组梯度洗脱结果

卡博替尼类似物主峰出峰时间提前至20min左右，但起始物料SM2和催化剂DMAP分离度较小，且流动相A为缓冲盐水溶液，容易滋生细菌，故需进行进一步优化。

表10第三组梯度洗脱程序

检测结果见表11及图13。

表11第三组梯度洗脱结果

各峰分离度均达到要求，拖尾因子也较理想，但主峰在溶剂倒峰附近出峰，故需进行简化优化。

表12第四组梯度洗脱程序

检测结果见表13及图14。

表13第四组梯度洗脱结果

各峰之间的分离度、主峰出峰时间及拖尾因子均达到要求。因此，选择第四组的梯度洗脱条件作为卡博替尼类似物有关物质测定的梯度洗脱条件。

2.5总结

综上，本发明优选的检测卡博替尼类似物及其有关物质的色谱条件为：色谱柱Waters XBridge shield RP18(4.6mm×150mm，3.5μm)，流动相为流动相A：醋酸盐缓冲盐(取醋酸铵约0.77g，加水2000ml使溶解，用氨水调节pH值至9.0)，流动相B，乙腈；流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长254nm，梯度洗脱：于0～5分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从100％变化为80％，流动相B的比例从0％变化为20％；于5～16分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持80％不变，流动相B的比例保持20％不变；于16～17分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从80％变化为65％，流动相B的比例从20％变化为35％；于17～22分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持65％不变，流动相B的比例保持35％不变；于22～24分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从65％变化为30％，流动相B的比例从35％变化为70％；于24～29分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持30％不变，流动相B的比例保持70％不变；于29～32分钟，流动相A和B回到初始比例；于32～40分钟，色谱柱重新平衡。

由本发明的色谱方法可以有效地分离检测卡博替尼类似物、杂质A和杂质B，可以充分满足有关物质检查与分解产物测定的要求，较好地控制样品中的特定杂质与非特定杂质，保证产品质量，在实际质量控制工作中实用性强。

【实施例3】强制降解试验

分别用高温、酸、碱、氧化、光照等剧烈条件对本品破坏后，进行有关物质测定，以考察所选择的色谱条件能否检测出本品可能产生的降解产物，具体如下：

(1)未破坏供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加30％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤即得。

(2)高温破坏供试品溶液配制：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加适量30％乙腈溶解，于90℃水浴加热7h，取出放冷，加30％乙腈稀释至刻度，摇匀过滤，即得。

(3)光照破坏供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加30％乙腈溶解并稀释至刻度，置于光照箱内放置12天，取出，摇匀过滤，即得。

(4)酸破坏供试品溶液：取本品约10mg，精密称定置20ml量瓶中，加入1mol/L盐酸溶液1ml，于室温放置8h，取出中和，加30％乙腈稀释至刻度，摇匀过滤，即得。

(5)碱破坏供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液1ml，于室温放置45min，取出中和，加30％乙腈稀释至刻度，摇匀过滤，即得。

(6)氧化破坏供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入30％过氧化氢1ml，于室温放置8h，取出，加30％乙腈稀释至刻度，摇匀过滤，即得。

采用实施例2.5总结的色谱条件分别对(1)～(6)的溶液进行检测，记录色谱图，分别为图15～图20，试验结果如表14所示。

表14强制降解试验结果(统计≥0.05％未知杂质)

主峰与相邻杂质峰之间的分离度均在1.5以上，杂质与杂质之间的分离度基本能在1.2以上，且主峰纯度均在990以上，因此本方法可用于对卡博替尼类似物有关物质进行检测。

【实施例4】系统适用性试验

取卡博替尼类似物工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加适量溶剂溶解，分别移取实施例1.1的杂质A和杂质B贮备液各1ml，置上述量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得系统适用性溶液。

取系统适用性溶液10μl，注入高效液相色谱仪中，按照实施例2.5总结的色谱条件进行检测，记录色谱图。色谱检测结果见表15及图21。

表15系统适用性试验结果

系统适用性溶液中卡博替尼类似物峰与杂质B(相对保留时间约为0.89)之间的分离度应大于1.5。

【实施例5】空白干扰试验

取空白溶剂，系统适用性溶液及卡博替尼类似物供试品溶液(批号：20211102)各10μl，注入液相色谱仪，按照实施例2.5总结的色谱条件进行检测，记录色谱图，色谱检测结果见图22～图23。

结果显示空白在主峰、杂质A及杂质B未检出色谱峰，未干扰本品有关物质测定。

【实施例6】定量限及检测限测定

精密称取卡博替尼类似物工作对照品适量，置相应体积的量瓶中，加溶剂适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，再不断地进行稀释，并精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算信噪比。

以信噪比约为3:1时相应浓度确定检测限，卡博替尼类似物检测限浓度为0..3227μg/ml，相当于供试品浓度(实施例1中的1.2)的0.006％；以信噪比约为10:1时相应浓度确定定量限，并连续进样5针，峰面积的RSD≤10％，卡博替尼类似物定量限浓度为0.1076μg/ml，相当于供试品浓度的0.02％，结果见表16。

表16定量限及检测限测定结果

结果显示，连续进样峰面积RSD值小于10％，满足定量限可接受标准。

【实施例7】线性及范围

精密称取卡博替尼类似物工作对照品、杂质A对照品及杂质B对照品各适量，分别加溶剂溶解并稀释制成每1ml中各含500μg卡博替尼类似物工作对照品、10μg杂质A对照品及10μg杂质B对照品的贮备液。用该贮备液再加上述稀释剂配制成7份不同浓度的溶液，分别进样，按照实施例2.5总结的色谱条件进行检测。以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得到卡博替尼类似物、杂质A及杂质B的线性回归方程，结果见表17。

表17线性及范围测定结果

结果显示，在本方法下，卡博替尼类似物、杂质A及杂质B在一定浓度范围内，均能呈良好的线性关系。

【实施例8】精密度

重复性试验：取杂质A对照品及杂质B对照品各适量，加入卡博替尼类似物原料药中，制成6份杂质A及杂质B浓度分别为卡博替尼类似物标示量0.5％及0.1％的加标供试品溶液，分别进样，按照实施例2.5总结的色谱条件进行检测，计算各杂质含量，试验结果见表18。

表18精密度试验结果

结果显示，各杂质含量RSD值均5.0％，说明本方法对杂质A及杂质B含量的测定结果重复性良好。

【实施例9】准确度

制备对照品贮备液：取杂质A对照品及杂质B对照品各适量，精密称定，加溶剂，溶解并稀释制成每1ml中约含杂质A 25μg及含杂质B 5μg的贮备液。

制备供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，分别量取对照品贮备液1ml、2ml、3ml置20ml量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，得不同浓度的加标供试品溶液，每个浓度的加标供试品溶液各制备3份。

按照实施例2.5总结的色谱条件进行检测，计算各杂质的回收率，结果见表19。

表19准确度试验结果

结果显示：各杂质的平均回收率均在90％～110％之间，回收率RSD均小于5.0％，表明有关物质测定方法的准确度良好。

【实施例10】耐用性试验

分别考察柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％、醋酸盐缓冲液pH值变化±0.2及色谱柱，进行耐用性试验。

按照实施例3制备方法制备系统适用性溶液，精密量取10μl系统适用性溶液注入液相色谱仪。按照实施例2.5总结的色谱条件进行检测，试验结果见表20。

表20耐用性试验结果

结果显示：在所有参数发生微小变化时，卡博替尼类似物主峰理论板数，卡博替尼类似物与杂质B之间的分离度满足系统适用性要求，但更换色谱柱后，理论板数及分离度较Waters XBridge shield RP18色谱柱差。

Claims (7)

1.一种利用高效液相色谱同时测定卡博替尼类似物、杂质A和杂质B的方法，所述的卡博替尼类似物、杂质A和杂质B的结构式分别为(I)、(II)和(III)，

其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)系统适用性试验和灵敏度测试

制备系统适用性溶液：取卡博替尼类似物工作对照品、杂质A对照品和杂质B对照品与溶剂混合，制成浓度为0.005mg/ml～0.5mg/ml的系统适用性溶液；其中，所述溶剂由超纯水与乙腈以体积比为70:30混合而成；

制备灵敏度测试溶液：取卡博替尼类似物工作对照品，用所述溶剂定量稀释，制成浓度为0.1μg/ml的灵敏度测试溶液；

分别以所述系统适用性溶液和所述灵敏度测试溶液在以下色谱条件下进行系统适用性试验和灵敏度测试，校定检测系统；

所述色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，以醋酸盐缓冲液与乙腈比例为70：30的混合溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.005mol/L～0.01mol/L，pH值为8.5～9.5，所述色谱柱的柱温为25℃～35℃，流速为0.9ml/min～1.1ml/min，检测波长为254nm，进样器温度为2℃～20℃；

分别精密量取10μl所述系统适用性溶液和10μl所述灵敏度测试溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，校定检测系统至卡博替尼类似物的峰与杂质A和杂质B的峰之间的分离度大于1.5，所述灵敏度测试溶液的色谱图中卡博替尼类似物峰的信噪比不小于10。

(2)制备供试品溶液和对照品溶液；

取卡博替尼类似物待测样品，加所述溶剂制成浓度为0.5mg/ml的供试品溶液；

取卡博替尼类似物工作对照品，加所述溶剂制成浓度为5μg/ml的对照品溶液；

(3)通过高效液相色谱测定所述供试品溶液中卡博替尼类似物、杂质A和杂质B的含量

将所述对照品溶液注入步骤(1)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将所述供试品溶液注入所述液相色谱仪，在步骤(1)所述的色谱条件下进行高效液相色谱测定，记录色谱图；

(4)计算所述卡博替尼类似物待测样品中卡博替尼类似物、杂质A和杂质B的含量；

按外标法以峰面积计算卡博替尼类似物、杂质A和杂质B的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脱为：

0分钟～5分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从100％变化为80％，流动相B的比例从0％变化为20％；

5分钟～16分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持80％不变，流动相B的比例保持20％不变；

16分钟～17分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从80％变化为65％，流动相B的比例从20％变化为35％；

17分钟～22分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持65％不变，流动相B的比例保持35％不变；

22分钟～24分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从65％变化为30％，流动相B的比例从35％变化为70％；

24分钟～29分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持30％不变，流动相B的比例保持70％不变；

29分钟～32分钟，流动相A和B回到初始比例；

32分钟～40分钟，色谱柱重新平衡。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醋酸盐选自醋酸铵。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醋酸盐缓冲液为浓度为0.005mol/L，pH值为9.0的醋酸铵溶液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的色谱条件为：流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样器温度为室温，所述醋酸盐缓冲液是由醋酸铵约0.77g，加水2000ml溶解，再加氨水调节pH值至9.0制成的。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的色谱柱为Waters XBridge ShieldRP18色谱柱。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述的卡博替尼类似物待测样品为卡博替尼类似物原料药。

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