CN113009013A - 一种甲钴胺样品中杂质的分析方法 - Google Patents
一种甲钴胺样品中杂质的分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种甲钴胺样品中杂质的分析方法。所述分析方法包括以下步骤：将含有甲钴胺样品的溶液I进行HPLC分离、检测，获得色谱图，根据所述色谱图得到所述杂质的含量；所述溶液I的溶剂为磷酸盐溶液I；所述HPLC分离的流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A包括磷酸盐溶液II；所述流动相B包括醇类；所述杂质包括氰钴胺和/或羟钴胺。所述分析方法的分析体系中不含有乙腈，避免了在检测过程中杂质羟钴胺发生反应，可准确得到羟钴胺和/或氰钴胺的含量，该方法灵敏度高、准确性佳。
Description
技术领域
本申请涉及一种甲钴胺样品中杂质的分析方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
甲钴胺制剂的主要功能是修复损伤的神经，缓解麻木、疼痛和感觉异常，对周围神经病变具有良好的治疗作用，已在临床上得到广泛应用。甲钴胺原料是甲钴胺片的有效成分，而甲钴胺原料主要是由氰钴胺(结构式1)甲基化反应得来，因此，甲钴胺原料中含有残存的氰钴胺，且由于甲钴胺化学性质不稳定，在强光下会降解生成羟钴胺(结构式2)，因此羟钴胺与氰钴胺作为甲钴胺原料的主要杂质，其含量的多少直接影响了甲钴胺原料及甲钴胺制剂的质量，准确测定甲钴胺原料及甲钴胺制剂中氰钴胺及羟钴胺的含量，是正确评价甲钴胺原料及甲钴胺制剂质量的重要指标，现有的中国药典、美国药典与日本药典中甲钴胺原料及甲钴胺制剂的检测方法均使用含有乙腈的溶液作为样品的溶解溶剂及HPLC分离的流动相，甲钴胺原料及甲钴胺制剂的杂质羟钴胺在含有乙腈的溶液中与乙腈逐渐反应生成另一种杂质氰钴胺，不能准确测定甲钴胺原料及甲钴胺制剂中氰钴胺及羟钴胺的含量。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种甲钴胺样品中杂质的分析方法，所述分析方法分析体系中不含有乙腈，可避免在检测过程中杂质羟钴胺发生反应而影响检测结果。
一种甲钴胺样品中杂质的分析方法，所述分析方法包括以下步骤：将含有甲钴胺样品的溶液I进行HPLC分离、检测，获得色谱图，根据所述色谱图得到所述杂质的含量；
所述溶液I的溶剂为磷酸盐溶液I；
所述HPLC分离的流动相包括流动相A和流动相B；
所述流动相A包括磷酸盐溶液II；
所述流动相B包括醇类；
所述杂质包括氰钴胺和/或羟钴胺。
可选地，所述分析方法包括以下步骤：将含有甲钴胺样品的溶液I进行HPLC分离、检测，获得色谱图，根据所述色谱图得到所述杂质的含量；
所述溶液I的溶剂为磷酸盐溶液I；
所述HPLC分离的流动相包括流动相A和流动相B；
所述流动相A为磷酸盐溶液II；
所述流动相B为醇类；
所述杂质包括氰钴胺和/或羟钴胺。
可选地，所述甲钴胺样品包括甲钴胺原料和/或甲钴胺制剂。
可选地，所述甲钴胺制剂包括甲钴胺片、甲钴胺注射液中的至少一种。
可选地，所述溶液I中甲钴胺的浓度为1～150μg/ml。
可选地，所述溶液I中甲钴胺的浓度上限选自1、5、10、20、50、100、或150μg/ml；下限选自1、5、10、20、50、或100μg/ml。
可选地，所述磷酸盐溶液I中的磷酸盐包括磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢胺中的至少一种。
可选地，所述磷酸盐溶液I的浓度为0.01～0.05mol/L。
可选地，所述磷酸盐溶液I的浓度为0.02～0.04mol/L。
可选地，所述磷酸盐溶液II中的磷酸盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢胺。
可选地，所述磷酸盐溶液II的浓度为0.01～0.05mol/L。
可选地，所述磷酸盐溶液II的浓度为0.02～0.04mol/L。
可选地，所述醇类包括甲醇。
可选地，所述流动相A和所述流动相B的体积比为75～90：10～25。
可选地，所述HPLC分离所用的色谱柱的填充剂包括C2～C18烷基硅烷键合硅胶、氰基硅烷键合硅胶或氨基键合硅胶中的至少一种。
可选地，所述C2～C18烷基硅烷键合硅胶为C8烷基硅烷键合硅胶或C18烷基硅烷键合硅胶。
可选地，所述HPLC分离的柱温为10～60℃。
可选地，所述HPLC分离的柱温上限选自20、30、40、50或60℃；所述HPLC分离的柱温下限选自10、20、30、40或50℃。
可选地，所述HPLC分离的洗脱程序为：
第0～10分钟中，流动相中流动相A的体积占比由90％变化至86％，和流动相B的体积占比由10％变化至14％；
第10～35分钟中，流动相中流动相A的体积占比由86％变化至85％，流动相B的体积占比由14％变化至15％；
第35～45分钟中，流动相中流动相A的体积占比由85％变化至75％，流动相B的体积占比由15％变化至25％；
第45～55分钟中，流动相中流动相A的体积占比为75％，流动相B的体积占比为25％；
第55～55.01分钟中，流动相中流动相A的体积占比由75％变化至90％，流动相B的体积占比由25％变化至10％；
第55.01～65分钟中，流动相中流动相A的体积占比为90％，流动相B的体积占比为10％。
可选地，所述检测的波长为332～352nm。
可选地，所述检测的波长为340～344nm。
可选地，所述检测的波长为342nm。
可选地，所述分析方法的羟钴胺的检测限为0.89ng，定量限为2.98ng，氰钴胺的检测限为0.91ng，定量限为2.74ng。
本申请所要解决的技术问题是如何准确的分析测定甲钴胺原料及甲钴胺制剂中氰钴胺及羟钴胺的含量，本申请为解决上述技术问题，提供了一种甲钴胺原料及甲钴胺制剂中氰钴胺及羟钴胺杂质含量的分析检测方法，用于分析测定甲钴胺原料及甲钴胺制剂中氰钴胺及羟钴胺的含量。
作为一种实施方案，本申请提供的技术方案是：
一种测定甲钴胺原料及甲钴胺制剂中氰钴胺及羟钴胺杂质含量的方法，包括：
a.取甲钴胺原料或甲钴胺制剂，以0.01～0.05mol/L的磷酸盐溶液为溶剂溶解，以甲钴胺计，配成含甲钴胺为1～150μg/ml的溶液。
b.取上述溶液适量，注入到高效液相色谱柱中，用流动相进行冲洗，梯度洗脱，柱温为10～60℃，所述高效液相色谱柱以硅烷键合硅胶为填充剂。
c.使用波长为332～352nm的紫外光检测。
a中所述的含甲钴胺原料或甲钴胺制剂为甲钴胺原料、甲钴胺片、甲钴胺注射液，优选甲钴胺原料。
a中所述的磷酸盐选自磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢胺中的一种或几种，优选磷酸二氢钾。
b中所述的流动相为0.03mol/L磷酸二氢钾与甲醇的混合溶液，所述的梯度洗脱中于0～10分钟，流动相中甲醇的体积从10％变化为14％，0.03mol/L磷酸二氢钾的体积从90％变化为86％；于10～35分钟，流动相中甲醇的体积从14％变化为15％，0.03mol/L磷酸二氢钾的体积从86％变化为85％；于35～45分钟，流动相中甲醇的体积从15％变化为25％，0.03mol/L磷酸二氢钾的体积从85％变化为75％；于45～55分钟，流动相中甲醇的体积占25％，0.03mol/L磷酸二氢钾的体积占75％；于55～55.01分钟，流动相中甲醇的体积从25％变化为10％，0.03mol/L磷酸二氢钾的体积从75％变化为90％；于55.01～65分钟甲醇和0.03mol/L磷酸二氢钾的体积各自回到初始比例。
b中所述的柱温为40℃。
b中所述的高效液相色谱柱的填充剂优选C2～C18烷基硅烷键合硅胶、氰基硅烷键合硅胶或氨基键合硅胶；优选C8或C18烷基硅烷键合硅胶，最优选C18烷基硅胶键合硅胶。
c中所述的紫外光检测波长优选340～344nm，更优选342nm。
本申请的甲钴胺原料及甲钴胺制剂中氰钴胺及羟钴胺杂质含量的分析检测方法操作简便、灵敏度高、准确性佳，用于分析检测甲钴胺或其制剂的杂质时，羟钴胺的检测限为0.89ng，定量限为2.98ng，氰钴胺的检测限为0.91ng，定量限为2.74ng；羟钴胺回收率为99.8％，氰钴胺回收率为100.7％。
本申请能产生的有益效果包括：
(1)本申请所提供的甲钴胺样品中杂质的分析方法，样品溶剂和流动相均不含乙腈，可使准确得到羟钴胺和/或氰钴胺的含量，该方法灵敏度高、准确性佳。
(2)本申请所提供的甲钴胺样品中杂质的分析方法，通过采用梯度洗脱程序将样品溶液进行分离，从而实现羟钴胺和/或氰钴胺含量的准确测量。
附图说明
图1所示为本申请实施例3所获得的色谱图。
图2所示为本申请实施例4所获得的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
其中，甲钴胺原料由宁夏金维制药股份有限公司生产，批号：PB20180803；
甲钴胺片按照以下方法制备：
处方：
工艺：
1.将磷酸氢钙、聚乙二醇4000、预胶化淀粉和硬脂酸镁按处方用量称量。
2.将甲钴胺原料药过60目筛后按照全检报告折干折纯计算用量后进行称量。
3.将称量后的磷酸氢钙一部分加入湿法混合制粒机内，再将聚乙二醇4000与甲钴胺原料药在不锈钢盆内初混后加入湿法混合制粒机内，最后依次加入剩余磷酸氢钙，预胶化淀粉，搅拌5r/s，切刀25r/s，混合5min。
4.将上述物料转移至自封袋内，加入硬脂酸镁在自封袋内手工混合均匀
5.使用φ6浅凹冲头压片，片重90mg，硬度6～8kg。
6.配制10％固含量包衣液，设定包衣参数：温度62℃，转速15rpm，喷枪：0.20MPa雾化：0.22Mpa喷速：8ml/min，风量：1400rpm，进行包衣，目标包衣增重6％。
本申请中，所述室温为25℃。
本申请中，回收率的计算方法如下：
回收率＝测定值/加入值×100％；
测定值＝(回收率供试品峰面积-本底溶液峰面积)/对照品溶液峰面积×加入值
对比例1中国药典检测方法的回收率验证
待测样品：甲钴胺原料。
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相是0.03mol/L磷酸二氢钾-乙腈(84：16)，柱温为室温，检测波长为342nm，溶剂同流动相，采用等度洗脱。
溶液制备：
杂质贮备液：取羟钴胺素乙酸盐、氰钴胺，精密称定，加溶剂(同流动相)溶解并定量稀释制成每1ml溶液中含羟钴胺、氰钴胺均为50μg的溶液，作为杂质贮备液。
对照品溶液：精密量取杂质贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂(同流动相)稀释至刻度，摇匀即得。
本底溶液：取甲钴胺原料，加溶剂(同流动相)溶解并稀释制成0.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
回收率供试品：分别精密量取杂质贮备液0.5ml(由此可以制备得到杂质浓度为限度浓度50％的回收率供试品，记为1#回收率供试品)、1.0ml(由此可以制备得到杂质浓度为限度浓度100％的回收率供试品，记为2#回收率供试品)、1.5ml(由此可以制备得到杂质浓度为限度浓度150％的回收率供试品，记为3#回收率供试品)，置20ml量瓶中，并加入甲钴胺原料10mg，加溶剂(同流动相)溶解并稀释至刻度，摇匀。
分别精密量取对照品溶液、本底溶液与各回收率供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录峰面积；按外标法计算回收率结果。
实施例1本申请所提供的检测方法的回收率验证
待测样品：甲钴胺原料。
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相是0.03mol/L磷酸二氢钾与甲醇的混合溶液(即0.03mol/L磷酸二氢钾为流动相A、甲醇为流动相B)，柱温为40℃，检测波长为342nm，溶剂为0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液。按下表1所示的条件进行梯度洗脱。
表1梯度洗脱程序
溶液制备：
杂质贮备液：取羟钴胺素乙酸盐、氰钴胺，精密称定，加溶剂(0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液)溶解并定量稀释制成每1ml中含羟钴胺、氰钴胺均为50μg的溶液，作为杂质贮备液。
对照品溶液：精密量取杂质贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂(0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液)稀释至刻度，摇匀即得。
本底溶液：取甲钴胺原料，加溶剂(0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液)溶解并稀释制成0.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
回收率供试品：分别精密量取杂质贮备液0.5ml(由此可以制备得到杂质浓度为限度浓度50％的回收率供试品，记为1#回收率供试品)、1.0ml(由此可以制备得到杂质浓度为限度浓度100％的回收率供试品，记为2#回收率供试品)、1.5ml(由此可以制备得到杂质浓度为限度浓度150％的回收率供试品，记为3#回收率供试品)，置20ml量瓶中，并加入甲钴胺原料10mg，加溶剂(0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀。
分别精密量取对照品溶液、本底溶液与各回收率供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录峰面积；按外标法计算回收率结果。
对比例1和实施例1两种测定方法回收率结果对比如下表2和表3所示。
表2对比例1和实施例1羟钴胺回收率结果对比
表3对比例1和实施例1氰钴胺回收率结果对比
由上述表2和表3可以看出：使用中国药典方法进行回收率试验，羟钴胺回收率均小于85％，氰钴胺回收率均大于110％，不能准确测定甲钴胺中的羟钴胺含量与氰钴胺含量，而使用现方法进行回收率试验，羟钴胺与氰钴胺的回收率均在98％～102％之间，能够准确测定甲钴胺中的羟钴胺含量与氰钴胺含量。
实施例3甲钴胺原料中氰钴胺、羟钴胺杂质检测结果
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相是0.03mol/L磷酸二氢钾与甲醇的混合溶液(即0.03mol/L磷酸二氢钾为流动相A、甲醇为流动相B)，柱温为40℃，检测波长为342nm，按下表4所示的条件进行梯度洗脱。
表4梯度洗脱程序
溶液制备：取甲钴胺原料，用0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液配制成浓度为0.5mg/ml的待测样品。取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图如图1所示，保留时间4.783min为羟钴胺吸收峰，保留时间10.381min为氰钴胺吸收峰，保留时间34.081min为甲钴胺吸收峰，按面积归一化法计算羟钴胺和氰钴胺的含量。测得结果：羟钴胺含量为0.04％，氰钴胺含量为0.01％。
实施例4甲钴胺片中氰钴胺、羟钴胺杂质检测结果
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相是0.03mol/L磷酸二氢钾与甲醇的混合溶液(即0.03mol/L磷酸二氢钾为流动相A、甲醇为流动相B)，柱温为40℃，检测波长为342nm，按下表5所示的条件进行梯度洗脱。
表5梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 86 | 14 |
| 35 | 85 | 15 |
| 45 | 75 | 25 |
| 55 | 75 | 25 |
| 55.01 | 90 | 10 |
| 65 | 90 | 10 |
溶液制备：取甲钴胺片，研成细粉，用0.03mol/L的磷酸二氢钾溶液配制成浓度为0.5mg/ml(按甲钴胺计)的样品。取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图如图2所示，保留时间4.624min为羟钴胺吸收峰，保留时间10.152min为氰钴胺吸收峰，保留时间32.951min为甲钴胺吸收峰，按面积归一化法计算羟钴胺和氰钴胺的含量。测得结果：羟钴胺含量为0.09％，氰钴胺含量为0.02％。
实施例5本申请分析方法的检测限、定量限测定
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相是0.03mol/L磷酸二氢钾与甲醇的混合溶液(即0.03mol/L磷酸二氢钾为流动相A、甲醇为流动相B)，柱温为40℃，检测波长为342nm，按下表6所示的条件进行梯度洗脱：
表6梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 86 | 14 |
| 35 | 85 | 15 |
| 45 | 75 | 25 |
| 55 | 75 | 25 |
| 55.01 | 90 | 10 |
| 65 | 90 | 10 |
溶液制备：取羟钴胺素乙酸盐、氰钴胺及甲钴胺适量，用稀释剂制成适当浓度的溶液，分别精密量取注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰高计，当S/N为3时，相应进样质量为该物质的检测限，当S/N为10时，相应进样质量为该物质的定量限。经过测定，用本申请所提供的方法测定，当S/N为3时，羟钴胺的进样质量为0.89ng、氰钴胺的进样质量为0.91ng，当S/N为10时，羟钴胺的进样质量为2.98ng，氰钴胺的进样质量为2.74ng。即，羟钴胺的检测限0.89ng，定量限为2.98ng，氰钴胺的检测限为0.91ng，定量限为2.74ng。
实施例6～7甲钴胺原料中氰钴胺、羟钴胺杂质检测
与实施例3相比，区别仅在于如表7所示的条件/参数/试剂。
表7实施例6～7与实施例3的区别之处
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Claims (10)
1.一种甲钴胺样品中杂质的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括以下步骤：将含有甲钴胺样品的溶液I进行HPLC分离、检测，获得色谱图，根据所述色谱图得到所述杂质的含量；
所述溶液I的溶剂为磷酸盐溶液I；
所述HPLC分离的流动相包括流动相A和流动相B；
所述流动相A包括磷酸盐溶液II；
所述流动相B包括醇类；
所述杂质包括氰钴胺和/或羟钴胺。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括以下步骤：将含有甲钴胺样品的溶液I进行HPLC分离、检测，获得色谱图，根据所述色谱图得到所述杂质的含量；
所述溶液I的溶剂为磷酸盐溶液I；
所述HPLC分离的流动相包括流动相A和流动相B；
所述流动相A为磷酸盐溶液II；
所述流动相B为醇类；
所述杂质包括氰钴胺和/或羟钴胺。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述甲钴胺样品包括甲钴胺原料和/或甲钴胺制剂。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述甲钴胺制剂包括甲钴胺片、甲钴胺注射液中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述溶液I中甲钴胺的浓度为1～150μg/ml。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液I中的磷酸盐包括磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢胺中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液I的浓度为0.01～0.05mol/L。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液II中的磷酸盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢胺。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液II的浓度为0.01～0.05mol/L。
10.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述醇类包括甲醇；
优选地，所述流动相A和所述流动相B的体积比为75～90：10～25；
优选地，所述HPLC分离所用的色谱柱的填充剂包括C2～C18烷基硅烷键合硅胶、氰基硅烷键合硅胶或氨基键合硅胶中的至少一种；
优选地，所述HPLC分离的柱温为10～60℃；
优选地，所述HPLC分离的洗脱程序为：
第0～10分钟中，流动相中流动相A的体积占比由90％变化至86％，和流动相B的体积占比由10％变化至14％；
第10～35分钟中，流动相中流动相A的体积占比由86％变化至85％，流动相B的体积占比由14％变化至15％；
第35～45分钟中，流动相中流动相A的体积占比由85％变化至75％，流动相B的体积占比由15％变化至25％；
第45～55分钟中，流动相中流动相A的体积占比为75％，流动相B的体积占比为25％；
第55～55.01分钟中，流动相中流动相A的体积占比由75％变化至90％，流动相B的体积占比由25％变化至10％；
第55.01～65分钟中，流动相中流动相A的体积占比为90％，流动相B的体积占比为10％；
优选地，所述检测的波长为332～352nm；
优选地，所述分析方法的羟钴胺的检测限为0.89ng，定量限为2.98ng，氰钴胺的检测限为0.91ng，定量限为2.74ng。
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