CN105085265A - 一种绿原酸原料或原料药及其制备方法和质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种绿原酸原料或原料药，它含有重量百分含量占98％以上的绿原酸及重量百分含量1.9％以下的杂质，其中，杂质中含有3-香豆酰奎尼酸，占原料或原药料总重量的0.1-0.5％。本发明还提供了绿原酸原料或原料药的制备方法，以及质量检测方法。本发明绿原酸原料或原料药的制备方法，结晶后不需经过重结晶工序处理，减少因重结晶带来的绿原酸损失，提高产品得率；同时，减少重结晶工序可缩短生产周期，实用性很强，利于大生产制备绿原酸；产品质量可控性较强，相关杂质均在受控范围之内，含量在0.1％以上的相关杂质能够定性定量分析；检测方法对绿原酸及其类似物检测灵敏度较高；流动相对有关物质检测无明显干扰，塔板数较高，分离度较好，主峰对称性较好。

Description

一种绿原酸原料或原料药及其制备方法和质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种绿原酸原料或原料药。

技术领域

绿原酸(chlorogenicacid)，又名3-O-咖啡酰奎宁酸(3-O-caffeoylquinnicacid)，是广泛存在于植物中的一种多酚类化合物，其中在忍冬类、杜仲、咖啡等植物中的含量较高。绿原酸具有较强的抗变态反应、调节体内血糖、清除氧自由基及抗癌抗HIV等作用，由于其疗效显著、毒副作用小而引起广泛研究。绿原酸源自于植物提取，由于其结构不稳定,因此极易在生产和贮运过程中引入相关杂质。为保证药物的安全有效和质量可控,相关杂质的研究已成为目前新药质量研究的重要环节,因此,对绿原酸中相关杂质进行研究十分必要。(田晨煦，等，高效液相色谱-串联质谱法分离鉴定绿原酸及其相关杂质，色谱，2007年7月)

此外，针对绿原酸的标准，也有相关文献报道，如：廖丽云，绿原酸及冻干制剂质量标准、稳定性的研究和绿原酸精制品结构确证，四川大学，药物分析，2005，硕士。该文献对绿原酸中的杂质进行了分析，但没有说明哪些杂质影响绿原酸的质量。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种绿原酸原料或原料药及其制备方法和质量检测方法。

本发明提供了一种绿原酸原料或原料药，它含有重量百分含量占98％以上的绿原酸及1.9％以下的杂质，其中，杂质中含有3-香豆酰奎尼酸，占中间体总重量的0.1-0.5％。

本发明所述的“绿原酸原料”系从杜仲叶中提取出的绿原酸单体，其绿原酸含量在98％以上，其他杂质在1.9％以下。除了来源于杜仲外，也可指来源于其它含有绿原酸的植物提取纯化，如金银花等。

进一步优选地，它含有5-咖啡酰奎尼酸(新绿原酸)、4-乙烯基邻苯二酚(咖啡酸脱羧物)、咖啡酸、4-咖啡酰奎尼酸(隐绿原酸)、绿原酸甲基化物中的一种或几种；其重量百分含量为：咖啡酸的重量百分含量不超过0.4％，除了咖啡酸外其他相关物质中单个重量百分含量不超过0.5％。

其中，3-香豆酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸(新绿原酸)、4-乙烯基邻苯二酚(咖啡酸脱羧物)、4-咖啡酰奎尼酸(隐绿原酸)、绿原酸甲基化物的总百分含量不超过1.5％。

优选地，它含有重量百分含量为98.0－99.8％绿原酸及0.1-1.9％杂质。

本发明还提供了一种制备绿原酸原料或原料药的方法，它包括如下步骤：

a、母液制备：取绿原酸含量在20％-60％的杜仲叶提取物，配制粗品水液浓度为20％-80％，绿原酸浓度为40mg/ml-480mg/ml，配制温度为10℃-60℃，pH＝1.0-3.0；

b、萃取：采用乙酸乙酯萃取，萃取次数为3-8次，每次萃取用量为母液体积的5-10倍，每次萃取前母液pH为1.0-3.0，萃取温度5℃-60℃；

c、脱色：活性炭用量为粗品质量的0.1-0.5倍，脱色温度50℃-70℃，脱色时间为0.5h-2.0h；

d、浓缩：浓缩温度50℃-70℃，真空度为-0.06--0.08MP，浓缩液控制绿原酸含量为20mg/ml-50mg/ml；

e、沉降：沉降温度0℃-25℃，沉降时间12h-24h；

f、结晶：沉降后结晶，结晶温度50℃-70℃，结晶时间0.5h-3.0h，结晶后冷却至10℃-40℃；

g、粉碎：乳化或研磨粉碎，粉碎后的晶体粒度100μm-500μm，粉碎过程可用或不用溶剂，其溶剂种类为乙酸乙酯、水或一定比例的乙酸乙酯和水的混合液，其混合比例为1％-99％；

h、洗涤：乙酸乙酯、水或一定比例的乙酸乙酯和水的混合液洗涤，其混合比例为1％-99％，洗涤溶剂用量为物料质量的1-10倍体积，溶剂(液)温度0℃-70℃；

i、干燥：干燥物料粒度为120目-20目，干燥温度30℃-80℃，干燥真空度为常压--0.09MP。

进一步优选地，它包括下述步骤制备而成：

a、母液制备：取绿原酸含量在40％的杜仲叶提取物，配制粗品水液浓度为60％，绿原酸浓度为240mg/ml，配制温度为25℃，pH＝1.0；

b、萃取：采用乙酸乙酯萃取，萃取次数为5次，每次萃取用量为母液体积的8倍，每次萃取前母液pH为1.0，萃取温度25℃；

c、脱色：活性炭用量为粗品质量的0.2倍，脱色温度60℃，脱色时间为1.0h；

d、浓缩：浓缩温度60℃，真空度为-0.08MP，浓缩液控制绿原酸含量为40mg/ml；

e、沉降：沉降温度25℃，沉降时间12h；

f、结晶：沉降后结晶，结晶温度70℃，结晶时间1.0h，结晶终止温度25℃；

g、粉碎：乳化或研磨粉碎，粉碎后的晶体粒度200μm-300μm，粉碎过程用乙酸乙酯溶剂；

h、洗涤：用水洗涤，其用量为物料质量的3倍体积，水温度5℃；

i、干燥：干燥物料粒度为60目，干燥温度60℃，干燥真空度为-0.08MP。

本发明还提供了一种检测所述的绿原酸原料或原料药的方法，它包括绿原酸的检测方法和杂质的检测方法：

其中绿原酸的含量检测方法为：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录ⅤD)测定；

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸溶液-乙腈(92:8)为流动相；检测波长215nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000，绿原酸峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求；

测定法取本品适量，精密称定，加流动相制成每1ml约含10μg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取绿原酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含10μg的溶液，同法测定；按外标法以峰面积计算，即得；

杂质的检测方法为：

取本品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照溶液；另取咖啡酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml中含2μg的溶液，作为对照品溶液；照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为滿量程的20％，再精密量取供试品溶液、对照溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍；供试品溶液色谱图中如有咖啡酸杂质峰，按外标法计算；如有其它杂质峰，按自身对照法计算。

本发明绿原酸原料或原料药的制备方法，结晶后不需经过重结晶工序处理，减少因重结晶带来的绿原酸损失，提高产品得率；同时，减少重结晶工序可缩短生产周期，实用性很强，利于大生产制备绿原酸；产品质量可控性较高，相关杂质均在受控范围之内，含量在0.1％以上的相关杂质能够定性定量分析；检测方法对绿原酸及其类似物检测灵敏度较高；流动相对有关物质检测无明显干扰，塔板数较高，分离度较好，主峰对称性较好。

附图说明

图1绿原酸原料药的水和流动相溶液紫外光谱图

图2绿原酸原料药高温破坏DAD三维检测图

图3绿原酸原料药高温破坏HPLC图(215nm)

图4绿原酸原料药高温破坏各峰DAD检测紫外光谱图

图5绿原酸原料系统适应色谱图

图6绿原酸检测限图谱

图7绿原酸定量限图谱

图8系统适用性试验HPLC图

图9咖啡酸及供试品碱氧化破坏前后HPLC图

图10咖啡酸定量限图

图11咖啡酸检测限图

图12其它有关物质检测色谱图

图13实施例1有关物质检测色谱图

图14实施例2有关物质检测色谱图

图15实施例3有关物质检测色谱图

图16实施例4有关物质检测色谱图

图17实施例5有关物质检测色谱图

图18实施例6有关物质检测色谱图

图19实施例7有关物质检测色谱图

图20实施例8有关物质检测色谱图

具体实施方式

实施例1本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸＝20％)10kg，加水至50L于10℃条件下搅拌溶解，配制成含绿原酸40mg/ml的水液，用盐酸调pH值至1.0；

2、萃取

用乙酸乙酯萃取8次，每次用量为500L，每次萃取前母液pH值调至1.0，萃取温度5℃；

3、脱色

向合并后的萃取液加入5kg活性炭，于50℃条件下搅拌脱色2.0h；

4、浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后，于50℃，真空度为-0.08MP条件下进行浓缩，控制浓缩液中绿原酸含量约为20mg/ml(浓缩液体积约为90L)；

5、沉降

将浓缩液于0℃条件下静置24h，料液温度为0℃，过滤，收集滤液；

6、结晶

将沉降后的滤液加热至70℃，搅拌结晶3.0h，通冷却水冷却至10℃，过滤，收集滤渣，得3.3kg；

7、粉碎

取结晶过滤出的结晶体，加30L乙酸乙酯于乳化机中乳化至晶体粒度为400-500μm，过滤，收集滤渣，得2.8kg；

8、洗涤

取粉碎后的滤渣，用2.8L0℃冰水搅拌使物料充分分散后，过滤，收集滤渣，

9、干燥

将洗涤后的滤渣于80℃、真空度为-0.09MP条件下干燥，将干燥至近干物料粉过120目筛再置同等条件下进行干燥，直至干燥完全。

10、产品特征

(1)产品重量：1.407kg

(2)含量：99.56％(按干燥品计)

(3)有关物质：3-香豆酰奎尼酸0.231％、咖啡酸0.038％

(4)绿原酸转移率：70.04％

实施例2本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸＝60％)10kg，加水至12.5L于60℃条件下搅拌溶解，配制成含绿原酸480mg/ml的水液，用盐酸调pH值至3.0；

2、萃取

用乙酸乙酯萃取8次，每次用量为125L，每次萃取前母液pH值调至3.0，萃取温度60℃；

3、脱色

向合并后的萃取液加入5kg活性炭，于70℃条件下搅拌脱色0.5h；

4、浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后，于70℃，真空度为-0.06MP条件下进行浓缩，控制浓缩液中绿原酸含量约为50mg/ml(浓缩液体积约为110L)；

5、沉降

将浓缩液于25℃条件下静置12h，料液温度为25℃，过滤，收集滤液；

6、结晶

将沉降后的滤液加热至70℃，搅拌结晶0.5h，通冷却水冷却至40℃，过滤，收集滤渣，得9.3kg；

7、粉碎

取结晶过滤出的结晶体，加10L水于乳化机中乳化至晶体粒度为100-150μm，过滤，收集滤渣，得6.4kg；

8、洗涤

取粉碎后的滤渣，用20L0℃水搅拌使物料充分分散后，过滤，收集滤渣，

9、干燥

将洗涤后的滤渣于80℃、真空度为-0.09MP条件下干燥，将干燥至近干物料粉碎过120目筛再置同等条件下进行干燥，直至干燥完全。

10、产品特征

(1)产品重量：4.327kg

(2)含量：99.69％(按干燥品计)

(3)有关物质：3-香豆酰奎尼酸0.128％、咖啡酸0.040％、隐绿原酸0.016％

(4)绿原酸转移率：71.89％

实施例3本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸＝40％)10kg，加水至15L于25℃条件下搅拌溶解，配制成含绿原酸267mg/ml的水液，用盐酸调pH值至1.0；

2、萃取

用乙酸乙酯萃取3次，每次用量为150L，每次萃取前母液pH值调至1.0，萃取温度25℃；

3、脱色

向合并后的萃取液加入1kg活性炭，于50℃条件下搅拌脱色2.0h；

4、浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后，于50℃，真空度为-0.08MP条件下进行浓缩，控制浓缩液中绿原酸含量约为40mg/ml(浓缩液体积约为90L)；

5、沉降

将浓缩液于25℃条件下静置12h，料液温度25℃，过滤，收集滤液；

6、结晶

将沉降后的滤液加热至50℃，搅拌结晶3.0h，冷却至25℃，过滤，收集滤渣，得6.8kg；

7、粉碎

取结晶过滤出的结晶体，加20L乙酸乙酯于乳化机中乳化至晶体粒度为300-400μm，过滤，收集滤渣，得5.2kg；

8、洗涤

取粉碎后的滤渣，用52L25℃乙酸乙酯搅拌使物料充分分散后，过滤，收集滤渣，

9、干燥

将洗涤后的滤渣于70℃、常压条件下干燥，将干燥至近干物料粉碎过20目筛再置同等条件下进行干燥，直至干燥完全。

10、产品特征

(1)产品重量：2.990kg

(2)含量：99.47％(按干燥品计)

(3)有关物质：3-香豆酰奎尼酸0.215％、新绿原酸0.009％、咖啡酸0.0436％、隐绿原酸0.022％

(4)绿原酸转移率：74.35％

实施例4本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸＝40％)10kg，加水至20L于40℃条件下搅拌溶解，配制成含绿原酸200mg/ml的水液，用盐酸调pH值至3.0；

2、萃取

用乙酸乙酯萃取8次，每次用量为100L，每次萃取前母液pH值调至3.0，萃取温度40℃；

3、脱色

向合并后的萃取液加入3kg活性炭，于60℃条件下搅拌脱色1.0h；

4、浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后，于60℃，真空度为-0.06MP条件下进行浓缩，控制浓缩液中绿原酸含量约为50mg/ml(浓缩液体积约为70L)；

5、沉降

将浓缩液于25℃条件下静置12h，料液温度为25℃，过滤，收集滤液；

6、结晶

将沉降后的滤液加热至60℃，搅拌结晶0.5h，冷却至25℃，过滤，收集滤渣，得6.3kg；

7、粉碎

取结晶过滤出的结晶体，于研磨机中研磨至晶体粒度为500μm；

8、洗涤

取研磨粉碎后的物料，用63L70℃乙酸乙酯搅拌使物料充分分散后，过滤，收集滤渣，

9、干燥

将洗涤后的滤渣于30℃、真空度为-0.09MP条件下干燥，将干燥至近干物料粉碎过60目筛再置同等条件下进行干燥，直至干燥完全。

10、产品特征

(1)产品重量：2.861kg

(2)含量：98.93％(按干燥品计)

(3)有关物质：3-香豆酰奎尼酸0.395％、新绿原酸0.020％、咖啡酸脱羧物0.040％、咖啡酸0.028％、隐绿原酸0.017％、绿原酸甲基化物0.029％

(4)绿原酸转移率：70.69％

实施例5本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸＝30％)10kg，加水至30L于25℃条件下搅拌溶解，配制成含绿原酸100mg/ml的水液，用盐酸调pH值至1.0；

2、萃取

用乙酸乙酯萃取6次，每次用量为150L，每次萃取前母液pH值调至1.0，萃取温度25℃；

3、脱色

向合并后的萃取液加入3kg活性炭，于70℃条件下搅拌脱色1.0h；

4、浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后，于70℃，真空度为-0.08MP条件下进行浓缩，控制浓缩液中绿原酸含量约为30mg/ml(浓缩液体积约为90L)；

5、沉降

将浓缩液于25℃条件下静置24h，料液温度为25℃，过滤，收集滤液；

6、结晶

将沉降后的滤液加热至70℃，搅拌结晶1.5h，自然冷却至25℃，过滤，收集滤渣，得5.8kg；

7、粉碎

取结晶过滤出的结晶体，加10L乙酸乙酯混合液(乙酸乙酯：水＝99:1)于乳化机中乳化至晶体粒度为200-300μm，过滤，收集滤渣，得4.8kg；

8、洗涤

取粉碎后的滤渣，用48L25℃乙酸乙酯混合液(乙酸乙酯：水＝99:1)搅拌使物料充分分散后，过滤，收集滤渣，

9、干燥

将洗涤后的滤渣于60℃、真空度为-0.09MP条件下干燥，将干燥至近干物料粉碎过60目筛再置同等条件下进行干燥，直至干燥完全。

10、产品特征

(1)产品重量：2.206kg

(2)含量：99.34％(按干燥品计)

(3)有关物质：3-香豆酰奎尼酸0.217％、新绿原酸0.030％、咖啡酸脱羧物0.058％、咖啡酸0.074％

(4)绿原酸转移率：73.05％

实施例6本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸＝50％)10kg，加水至25L于25℃条件下搅拌溶解，配制成含绿原酸200mg/ml的水液，用盐酸调pH值至2.0；

2、萃取

用乙酸乙酯萃取4次，每次用量为150L，每次萃取前母液pH值调至2.0，萃取温度25℃；

3、脱色

向合并后的萃取液加入2kg活性炭，于60℃条件下搅拌脱色1.0h；

4、浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后，于60℃，真空度为-0.06MP条件下进行浓缩，控制浓缩液中绿原酸含量约为50mg/ml(浓缩液体积约为90L)；

5、沉降

将浓缩液于15℃条件下静置24h，料液温度为15℃，过滤，收集滤液；

6、结晶

将沉降后的滤液加热至60℃，搅拌结晶2.0h，通水冷却至10℃，过滤，收集滤渣，得9.8kg；

7、粉碎

取结晶过滤出的结晶体，加10L乙酸乙酯混合液(乙酸乙酯：水＝1:99)于乳化机中乳化至晶体粒度为100-150μm，过滤，收集滤渣，得8.2kg；

8、洗涤

取粉碎后的滤渣，用48L60℃乙酸乙酯混合液(乙酸乙酯：水＝1:99)搅拌使物料充分分散后，过滤，收集滤渣，

9、干燥

将洗涤后的滤渣于60℃、真空度为-0.09MP条件下干燥，将干燥至近干物料粉碎过60目筛再置同等条件下进行干燥，直至干燥完全。

10、产品特征

(1)产品重量：3.563kg

(2)含量：99.63％(按干燥品计)

(3)有关物质：3-香豆酰奎尼酸0.096％、新绿原酸0.043％、咖啡酸脱羧物0.062％、咖啡酸0.049％

(4)绿原酸转移率：71.00％

实施例7本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸＝40％)10kg，加水至20L于25℃条件下搅拌溶解，配制成含绿原酸200mg/ml的水液，用盐酸调pH值至2.0；

2、萃取

用乙酸乙酯萃取5次，每次用量为100L，每次萃取前母液pH值调至2.0，萃取温度25℃；

3、脱色

向合并后的萃取液加入3kg活性炭，于50℃条件下搅拌脱色2.0h；

4、浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后，于50℃，真空度为-0.08MP条件下进行浓缩，控制浓缩液中绿原酸含量约为40mg/ml(浓缩液体积约为90L)；

5、沉降

将浓缩液于25℃条件下静置12h，料液温度为25℃，过滤，收集滤液；

6、结晶

将沉降后的滤液加热至70℃，搅拌结晶1.0h，通水冷却至25℃，过滤，收集滤渣，得7.2kg；

7、粉碎

取结晶过滤出的结晶体，加10L水于乳化机中乳化至晶体粒度为100-150μm，过滤，收集滤渣，得5.4kg；

8、洗涤

取粉碎后的滤渣，用55L5℃乙酸乙酯搅拌使物料充分分散后，过滤，收集滤渣，

9、干燥

将洗涤后的滤渣于60℃、真空度为-0.08MP条件下干燥，将干燥至近干物料粉碎过60目筛再置同等条件下进行干燥，直至干燥完全。

10、产品特征

(1)产品重量：2.811kg

(2)含量：99.52％(按干燥品计)

(3)有关物质：3-香豆酰奎尼酸0.239％、咖啡酸0.040％

(4)绿原酸转移率：69.94％

实施例8本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸＝40％)10kg，加水至16.7L于25℃条件下搅拌溶解，配制成含绿原酸240mg/ml的水液，用盐酸调pH值至1.0；

2、萃取

用乙酸乙酯萃取5次，每次用量为134L，每次萃取前母液pH值调至1.0，萃取温度25℃；

3、脱色

向合并后的萃取液加入2kg活性炭，于60℃条件下搅拌脱色1.0h；

4、浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后，于60℃，真空度为-0.08MP条件下进行浓缩，控制浓缩液中绿原酸含量约为40mg/ml(浓缩液体积约为90L)；

5、沉降

将浓缩液于25℃条件下静置12h，料液温度为25℃，过滤，收集滤液；

6、结晶

将沉降后的滤液加热至70℃，搅拌结晶1.0h，通水冷却至25℃，过滤，收集滤渣，得6.9kg；

7、粉碎

取结晶过滤出的结晶体，加10L乙酸乙酯于乳化机中乳化至晶体粒度为200-300μm，过滤，收集滤渣，得5.8kg；

8、洗涤

取粉碎后的滤渣，用17.4L5℃水搅拌使物料充分分散后，过滤，收集滤渣；

9、干燥

将洗涤后的滤渣于60℃、真空度为-0.08MP条件下干燥，将干燥至近干物料粉碎过60目筛再置同等条件下进行干燥，直至干燥完全。

10、产品特征

(1)产品重量：3.204kg

(2)含量：99.78％(按干燥品计)

(3)有关物质：3-香豆酰奎尼酸0.165％

(4)绿原酸转移率：79.92％

实施例9本发明绿原酸原料或原料药中杂质含量范围的实验依据

采用HPLC法和LC-MS法对绿原酸原料药中存在的有关物质进行了分离和鉴定，共分离鉴定出奎尼酸、咖啡酸、新绿原酸、隐绿原酸、3-香豆酰奎尼酸、咖啡酸脱羧物和绿原酸甲基化物等7个主要有关物质；

有关物质色谱、质谱测定参数

奎尼酸有法定对照品，采用HPLC对照品法对奎尼酸的分离检测条件、方法学和含量进行了初步研究，结果绿原酸原料药中未检出奎尼酸，故未进行深入研究和标准收入；咖啡酸有法定对照品，采用HPLC对照品法对咖啡酸的分离检测条件和方法学进行了研究，结果证明建立的检测条件和方法适用于绿原酸原料药中咖啡酸的检查；其它有关物质无法定对照品，均为绿原酸的类似物，响应值与绿原酸相近，采用HPLC自身对照法对其它有关物质的分离检测条件和方法学进行了研究，结果证明建立的检测条件和检测方法适用于绿原酸原料药中其他有关物质的检查。三批小试样品(080801，080802，080803)和三批中试样品(090101、090102、090103)、三批中试样品(100101、100102、100103)48月长期稳定性实验有关物质检查结果见表1、表2。

表1六批样品有关物质检查结果

表248月长期稳定性实验有关物质检查结果

六批样品中咖啡酸含量为0.076～0.092％，其它有关物质总含量为0.479～0.511％，单个其它有关物质含量为0.045～0.226％；48月长期稳定性实验有关物质检查结果中咖啡酸含量为0.149～0.161％，其它有关物质总含量为0.770～0.787％，单个其它有关物质含量为0.091～0.309％。有关文献报道咖啡酸小鼠腹腔注射LD50为1583mg/kg，家兔静脉注射14mg/kg/天，连续十天，其心、肝、肾功能及解剖镜检均未见病理变化，说明咖啡酸有较好的安全性，考虑到生产和贮藏过程中影响因素的波动，确定咖啡酸含量不大于0.40％；其它有关物质主要为绿原酸的异构体及其类似物，考虑到生产和贮藏过程中影响因素的波动，确定其它单个有关物质含量不大于0.50％，总和不大于1.5％。

实施例10本发明绿原酸原料或原料药中绿原酸的检测方法试验

1)检测波长选择

绿原酸在流动相溶液(乙腈-0.1％甲酸8:92)和水溶液中的紫外光谱特征基本一致，在215和323nm波长附近均有最大吸收；在绿原酸原料药高温破坏样品的LC-DAD三维检测图中，绿原酸及其检出的有关物质在波长215nm和323nm附近均有最大吸收；其中，323nm波长处，绿原酸及其类似物检测灵敏度较高；但215nm波长处除能够检出绿原酸及其类似物外，还有利于检出仅有末端紫外吸收的杂质；在323nm波长处，流动相对有关物质检测无明显干扰，而在215nm波长处，溶剂峰较为明显，但对溶剂峰附近的有关物质检测无明显干扰；因此，在绿原酸原料药的质量控制中，采用215nm波长作为绿原酸有关物质检查的检测波长。光谱图和色谱图见图1-4。

2)分离条件选择

①流动相的选择分别考察了不同有机相(乙腈、甲醇)、不同酸组成的流动相对绿原酸及其有关物质分离的色谱行为，以组分中难分离对(绿原酸与咖啡酸)的分离度和分析时间作为评价指标，对不同流动相的分离效果进行评价。

取本品约25mg，加水50ml使溶解制成相当于0.5mg/ml的溶液作为供试品溶液。

不同有机相的评价按下表配制含不同有机相的流动相，以ODS150mm×4.6mm作为色谱柱，检测波长215nm，流速1ml/min；取供试品溶液20μl注入色谱仪，记录色谱图。结果见表3。

表3不同有机相难分离对的分离度与分析时间

注：*表示未分离；R为分离度；n为绿原酸的理论板数；－表示未实验。

结果表明，有机相比例相同时，甲醇系统的分离度大于乙腈系统，但甲醇系统耗费的分析时间长，柱效较乙腈系统差；综合判定乙腈系统优于甲醇系统，乙腈-0.1％甲酸的比例在8:92时，绿原酸与难分离的咖啡酸的分离度较为理想，实验选用乙腈-0.1％甲酸(8:92)为流动相。

不同酸的评价根据绿原酸及其类似物的弱酸性特点，设计在流动相中加入适量的酸，以酸抑制色谱峰的拖尾，增加色谱峰的对称性。选用常见的甲酸、乙酸和磷酸，分别考察其对绿原酸及其有关物质的分离影响。以峰对称性、分离度、分析时间等因素作为综合评判指标，进行酸种类的筛选。结果见表4。

表4不同种类酸对绿原酸分离的影响

结果表明，用磷酸溶液作水相时，主峰对称性较好，但分离度较差；用乙酸溶液作水相时，分离度较好，但主峰对称性较差；用甲酸溶液作水相时，分离度较好，主峰对称性较好。故确定以0.1％甲酸溶液作为流动相的水相。

综合评价后确定流动相为0.1％甲酸-乙腈(92:8)。

②色谱柱的选择：以绿原酸主峰柱效、绿原酸与咖啡酸的分离度为指标进行评价，考察了不同品牌的C18柱，如AichromBond-AQ、Zirchrom、Kromasil、Gemini等的色谱行为。数据见表5。

表5不同色谱柱对绿原酸的分离比较

结果表明，在绿原酸主峰柱效达3000以上时，不同C18色谱柱都能较好分离本品中难分离组分绿原酸与咖啡酸，分离度均大于2，故选择C18色谱柱作为有关物质检查的色谱柱。

综上所述，确定有关物质的采用HPLC法检查，色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸-乙腈(92:8)为流动相；流速为1ml/min；检测波长为215nm；理论板数按绿原酸峰计大于3000，绿原酸的主成分峰与咖啡酸杂质峰分离度大于1.5，见图5。

含量测定方法学考察

1色谱条件的选择与系统适用性试验

绿原酸有关物质研究中确定的检测波长、流动相、色谱柱能使本品与有关物质完全分离，且理论板数按绿原酸峰计算大于3000，满足绿原酸含量测定要求。故确定以215nm为检测波长，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％甲酸-乙腈(92:8)为流动相，进行含量测定研究。

2测定方法

供试品溶液的制备：取绿原酸原料药适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含约10μg的溶液，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml中约含10μg的溶液，作为对照品溶液。

精密量取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算绿原酸的含量。

3线性

取绿原酸对照品约12mg，精密称定，加流动相溶解稀释成125、75、50、25、12.5、2.50、0.25μg/ml的系列溶液。精密量取系列溶液各10μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以绿原酸峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，进行线性回归，得线性方程。结果见表6。

表6绿原酸线性数据

结果绿原酸在浓度0.25～125μg/ml的范围内，呈良好的线性关系，相关系数为0.9994。

4检测限和定量限

取线性研究中低浓度溶液(0.25μg/ml)逐渐稀释进样，按信噪比法，在S/N≥3测得绿原酸检出量为0.625ng；在S/N≥10测得绿原酸检出量为2.5ng，故确定绿原酸的检测限为0.625ng，定量限为2.5ng，色谱图见图6、7。

5加样回收实验

取本品适量，加流动相溶解稀释成每ml约含绿原酸78.00μg的储备液。分别取储备液1.0ml于9只10ml量瓶中，均分成三组，按低、中、高组分别加入浓度为50μg/ml、62.5μg/ml、75μg/ml的绿原酸对照品溶液1.0ml加流动相稀释至刻度，作为供试品溶液，精密量取该供试品溶液各10μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按以下公式计算加样回收率，结果见表7。

表7加样回收率结果

结果表明，本法加样回收率平均值为100.9％，RSD为0.88％，说明该方法测定结果准确度良好。

6重复性

取本品适量，精密称定，加流动相分别制成高、中、低(约10、12、15μg/ml)三种浓度的供试品溶液各3份，分别精密量取供试品溶液与对照品溶液(12.5μg/ml)各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算各组含量的相对标准偏差(RSD％)，结果见表8。

表8重复性结果

测得结果的平均值为99.49％，RSD为0.27％，说明该方法重复性良好。

7范围

由以上重复性实验结果可知，本品3个浓度梯度的精密度均良好，证明供试品溶液浓度在9.6～14.4μg/ml之间，按拟定的方法测定，检测结果均能达到良好的精密度。

8中间精密度

于不同时间、不同人员、不同设备条件下进行中间精密度实验。取本品适量，精密称定，加流动相制成高、中、低三种浓度的供试溶液(共18份样品)。分别精密量取各供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，分别计算高、中、低浓度组含量的相对标准偏差(RSD％)和总相对标准偏差(RSD％)。结果见表9。

表9中间精密度结果

含量平均值为99.59％，总平均相对标准偏差为0.43％，表明本品在不同时间、不同人员、不同设备条件下检测结果的中间精密度良好。

9溶液稳定性实验

取同一份供试品溶液，间隔一定时间分别进样，记录峰面积，测定结果见表10，RSD＝2.30％，表明被测溶液在24小时内稳定。

表10溶液稳定性实验

10耐用性

根据《中国药典》2000年版二部附录XIXA“药品质量标准分析方法验证”要求，考察了色谱柱品牌和批号、流动相组成、柱温、波长等变化条件下，对方法测定的影响。

(1)不同品牌色谱柱

将上述供试品溶液，分别用同一类型不同厂家的色谱柱测定含量，结果见表11。表明用不同品牌的C18柱(150mm×4.6mm，5μm)测定，保留时间略有差异，理论板数均达到要求，含量结果无明显差异。

表11不同品牌色谱柱的比较实验

(2)不同比例流动相

将上述供试品溶液，分别在不同比例流动相下测定含量，结果见表12。表明：在不同比例的流动相条件下，理论板数均达到要求，含量结果无明显的差异。因此流动相比例的微小变化对含量测定影响不大。

表12不同比例流动相比较实验

(3)不同柱温

将上述供试品溶液，分别在不同的柱温下测定含量，结果见表13。表明：在不同的柱温条件下，理论板数均达到要求，含量结果无明显的差异。因此柱温对含量测定影响不大。

表13不同的柱温比较实验

(4)不同检测波长

将上述供试品溶液，分别在215nm和323nm波长处测定含量，结果见表14。两个检测波长条件下，理论板数均达到要求，含量结果无明显的差异。

表14不同检测波长比较实验

综上所述，该方法系统适用性、专属性、线性、准确度、精密度、耐用性方面符合方法学验证要求。说明本方法测定绿原酸含量准确、可行。

11样品含量测定结果

根据上述方法分别对实施例中各个样品进行绿原酸含量测定，结果见表15。

表15本品含量测定结果

实施例11本明绿原酸原料或原料药中有关物质的分离与鉴定

以上述色谱条件对绿原酸原料药的有关物质进行分离与鉴定，以便深入了解和研究本品的有关物质。

(1)咖啡酸的检查

1)仪器与试药

LC-6A高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可见检测器、N2000色谱工作站。

色谱柱：AichromBondAQ、GeminiC18柱(150mm×4.6mm，5μm)。

对照品：咖啡酸对照品(批号114930050)。

试剂：乙腈为色谱纯；甲酸为分析纯；水为自制二次蒸馏水。

2)色谱条件及系统适用性实验

咖啡酸在上述确定的有关物质分离和检测条件中，保留时间适中，与相邻组分(绿原酸)完全分离，能够满足咖啡酸定量测定的要求，故以上述确定的有关物质分离和检测条件作为咖啡酸检查的色谱条件。

色谱条件及系统适用性：十八烷基键合硅胶柱(150mm×4.6mm，5μm)为色谱柱；以0.1％甲酸-乙腈(92:8)为流动相；流速为1ml/min，理论板数按咖啡酸峰计算大于3000，检测波长为215nm，绿原酸的主成分峰与咖啡酸杂质峰分离度大于1.5。系统适用性试验图见图8。由图可知，流动相对测定结果无干扰，绿原酸与咖啡酸分离度大于1.5，相对保留时间在0.35之前应为溶剂峰和系统峰，故此色谱条件适用于咖啡酸的检查。

3)对照品溶液的制备

精密称取咖啡酸对照品适量，加流动相并定量稀释制成每1ml中含2μg的溶液，作为对照品溶液。

4)供试品溶液的制备

取本品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。

5)测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算，即得。

6)方法学考察

①专属性考察

考察上述确定的色谱条件能否有效地检出本品的有关物质，以证实该检验方法的专属性，故对原料药进行强制破坏实验，对原料药的降解产物进行考察。

破坏实验取原料药水溶液(1mg/ml)1ml，加30％过氧化氢溶液3ml，0.01mol/LNaOH溶液0.1ml，70℃水浴加热30min，作为供试品溶液(破坏后)；另取原料药水溶液加水稀释至0.25mg/ml的溶液，作为对照溶液(破坏前)。分别精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果绿原酸主峰与各杂质峰均能有效分离，各杂质峰彼此基本分离；咖啡酸峰显著升高，新绿原酸峰明显升高，说明该色谱条件能充分地分离检出原料药碱氧化破坏后的有关物质，具有较好的专属性。色谱图见图9。

上述实验结果表明该色谱条件具有较好的专属性。

②线性

取咖啡酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.01mg的储备液。分别取储备液适量，用流动相稀释成浓度为4.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.05μg/ml的系列溶液。分别精密量取上述溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以咖啡酸的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，回归得直线方程。结果见表16。

表16咖啡酸线性数据

结果表明，咖啡酸在浓度0.05～4.0μg/ml范围内，呈良好的线性关系，相关系数为0.9996。

③检测限和定量限

取线性研究中低浓度溶液(0.05μg/ml)逐渐稀释进样，按信噪比法，在S/N≥3时，确定为咖啡酸的检测限，为0.3ng；在S/N≥10时，确定为咖啡酸的定量限，为1ng，色谱图见图10，11。

④加样回收实验

取绿原酸原料药(含咖啡酸0.09％)适量，精密称定，加流动相制成每ml含绿原酸约500μg的储备液，取储备液1.0ml于9只10ml量瓶中，分别加入2、4、6μg/ml的咖啡酸对照品溶液1.0ml，加流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。另取线性研究项下咖啡酸对照品溶液(0.5μg/ml)，作为对照品溶液。分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，由标准曲线方程计算测定量并计算回收率，结果见表17。

表17加样回收率数据

结果表明，本法加样回收率平均值为101.1％，RSD为0.57％，说明该方法测定结果准确度良好。

⑤重复性

取绿原酸原料药约0.35、0.50、0.65g各3份，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，再精密量取1ml于10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度作为供试品溶液。另取咖啡酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每ml含0.5μg的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，按外标法计算含量和相对标准偏差(RSD％)，结果见表18。

表18重复性实验结果

测得结果总相对标准偏差为0.77％，说明咖啡酸检测结果的重复性较好。

⑥范围

由以上重复性实验结果可知，本品3个浓度梯度的精密度均良好，证明供试品溶液中咖啡酸浓度在0.32～0.61μg/ml之间，按拟定的方法测定，检测结果均能达到良好的精密度。

⑦中间精密度实验

照重复性项下配制低、中、高供试品溶液。另取咖啡酸适量，加流动相制成含咖啡酸0.5μg/ml的溶液作为对照品溶液。照咖啡酸色谱条件，由不同人员在不同时间于不同色谱仪上检测，记录色谱峰面积，由一点法计算测定量，并计算相对标准偏差RSD。结果见表19。

表19中间精密度结果

测得结果的平均含量为0.093％，总相对标准偏差为0.80％，说明该方法中间精密度良好。

⑧耐受性

根据《中国药典》2000年版二部附录XIXA“药品质量标准分析方法验证”要求，考察了色谱柱品牌和批号、流动相组成、柱温等变化条件下，对方法测定的影响。

不同品牌色谱柱将同一供试品溶液，分别用同一类型不同厂家的色谱柱测定含量，结果见表20。

表20不同品牌色谱柱的比较实验

表明：用不同品牌的C18柱(150mm×4.6mm，5μm)测定，保留时间略有差异，分离度、理论板数均达到要求，测得咖啡酸含量无明显差异。

流动相不同比例将上述供试品溶液，分别在不同比例流动相下测定含量，结果见表21。

表21不同比例流动相比较实验

结果表明，在不同比例的流动相条件下，分离度、理论板数均达到要求，测得咖啡酸含量无明显差异。因此流动相比例的微小变化对含量测定影响不大。

不同柱温将上述供试品溶液，分别在不同的柱温下测定含量，结果见表22。表明：在不同的柱温条件下，理论板数均达到要求，含量结果无明显的差异。因此柱温对咖啡酸测定影响不大。

表22不同的柱温比较实验

综上所述，该方法系统适用性、专属性、线性、准确度、精密度、耐用性方面符合方法学验证要求。说明本方法测定咖啡酸含量准确、可行。

7)检测和结果

照上述检查法对供试品进行咖啡酸的检查，结果见表23：

表23咖啡酸检测结果

(3)其它有关物质的检查

绿原酸原料药中其它有关物质包括新绿原酸、隐绿原酸、3-香豆酰奎尼酸和绿原酸甲基化物及其它未鉴定的有关物质，这些有关物质无法定对照品，故均采用绿原酸主成分自身对照法进行研究。

1)仪器与试药

LC-6A高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可见检测器、N2000色谱工作站。

色谱柱：AichromBondAQ柱(150mm×4.6mm，5μm)

试剂：乙腈为色谱纯；甲酸为分析纯；水为自制二次蒸馏水。

2)色谱条件及系统适用性实验

咖啡酸的色谱条件及系统适用性试验能充分分离和检测其它有关物质，故确定其它有关物质的检测条件与咖啡酸一致。

3)供试品溶液的制备

取绿原酸原料药适量，精密称定，加流动相制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。

4)对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1.0ml置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照溶液。

5)测定法

精密量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使绿原酸主成分峰为满量程的10～20％，再精密量取上述供试品溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至绿原酸峰保留时间的3倍以上。供试品溶液的色谱图中如显现除咖啡酸以外的其它杂质峰，则计算其它各杂质峰面积与对照溶液主峰面积的比值，得其它有关物质含量，计算其他有关物质总和。

6)方法学考察

①专属性考察同咖啡酸专属性考察结果。

②检测限

取绿原酸原料药适量，加流动相配制成每1ml含1mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液逐渐稀释进样，记录色谱图，将峰面积最小的有关物质作为考察对象，以信噪比(S/N)≥3时注入样品的浓度作为其它有关物质的检测限。

结果表明，样品中其它有关物质的检测限以供试品溶液浓度计为0.125mg/ml。为使绿原酸原料中的其它有关物质能被充分检测，设定供试品溶液浓度为0.5mg/ml。色谱图见图12。

7)检测结果

根据上述有关物质检测方法分别对实施例中各产品进行有关物质检测，结果见表24，图13-图20。

表24其它有关物质检测结果

Claims (7)

1.一种绿原酸原料或原料药，其特征在于：它含有重量百分含量占98％以上的绿原酸及重量百分含量1.9％以下的杂质，其中，杂质中含有3-香豆酰奎尼酸，占原料或原药料总重量的0.1-0.5％。

2.根据权利要求1所述的绿原酸原料或原料药，其特征在于：它含有5-咖啡酰奎尼酸、4-乙烯基邻苯二酚、咖啡酸、4-咖啡酰奎尼酸、绿原酸甲基化物中的一种或几种；其重量百分含量为：咖啡酸的重量百分含量不超过0.4％，除了咖啡酸外其他相关物质中单个重量百分含量不超过0.5％。

3.根据权利要求2所述的绿原酸原料或原料药，其特征在于：3-香豆酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、4-乙烯基邻苯二酚、4-咖啡酰奎尼酸、绿原酸甲基化物的总百分含量不超过1.5％。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的绿原酸原料或原料药，其特征在于：它含有重量百分含量为98.0－99.8％绿原酸及重量百分含量为0.1-1.9％杂质。

5.一种制备权利要求1-4任意一项所述的绿原酸原料或原料药的方法，它包括如下步骤：

a、母液制备：取绿原酸含量在20％-60％的杜仲叶提取物，配制成绿原酸浓度为40mg/ml-480mg/ml，配制温度为10℃-60℃，pH＝1.0-3.0；

b、萃取：采用乙酸乙酯萃取，萃取次数为3-8次，每次萃取用量为母液体积的5-10倍，每次萃取前母液pH为1.0-3.0，萃取温度5℃-60℃；

c、脱色：活性炭用量为粗品质量的0.1-0.5倍，脱色温度50℃-70℃，脱色时间为0.5h-2.0h；

d、浓缩：浓缩温度50℃-70℃，真空度为-0.06--0.08MP，浓缩液控制绿原酸含量为20mg/ml-50mg/ml；

e、沉降：沉降温度0℃-25℃，沉降时间12h-24h；

f、结晶：沉降后结晶，结晶温度50℃-70℃，结晶时间0.5h-3.0h，结晶后冷却至10℃-40℃；

g、粉碎：将f步骤的结晶物乳化或研磨粉碎，粉碎后的晶体粒度100μm-500μm，粉碎过程可用或不用溶剂，其溶剂种类为乙酸乙酯、水或比例为1％-99％的乙酸乙酯和水的混合液；

h、洗涤：乙酸乙酯、水或体积比为1％-99％的乙酸乙酯和水的混合液洗涤，洗涤溶剂用量为物料质量的1-10倍体积，温度0℃-70℃，进行洗涤；

i、干燥：干燥物料粒度为120目-20目，干燥温度30℃-80℃，干燥真空度为常压--0.09MP。

6.根据权利要求5所述的绿原酸原料或原料药的制备方法，其特征在于：它包括下述步骤制备而成：

a、母液制备：取绿原酸含量在40％的杜仲叶提取物，配制粗品水液浓度为60％，绿原酸浓度为240mg/ml，配制温度为25℃，pH＝1.0；

b、萃取：采用乙酸乙酯萃取，萃取次数为5次，每次萃取用量为母液体积的8倍，每次萃取前母液pH为1.0，萃取温度25℃；

c、脱色：活性炭用量为粗品质量的0.2倍，脱色温度60℃，脱色时间为1.0h；

d、浓缩：浓缩温度60℃，真空度为-0.08MP，浓缩液控制绿原酸含量为40mg/ml；

e、沉降：沉降温度25℃，沉降时间12h；

f、结晶：沉降后结晶，结晶温度70℃，结晶时间1.0h，结晶终止温度25℃；

g、粉碎：乳化或研磨粉碎，粉碎后的晶体粒度200μm-300μm，粉碎过程用乙酸乙酯溶剂；

h、洗涤：用水洗涤，其用量为物料质量的3倍体积，水温度5℃；

i、干燥：干燥物料粒度为60目，干燥温度60℃，干燥真空度为-0.08MP。

7.一种检测权利要求1-4任意一项所述的绿原酸原料或原料药的方法，其特征在于：它包括绿原酸的检测方法、杂质检测方法：

其中绿原酸的含量检测方法为：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录ⅤD)测定；

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸溶液-乙腈(92:8)为流动相；检测波长215nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000，绿原酸峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求；

测定法取本品适量，精密称定，加流动相制成每1ml约含10μg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取绿原酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含10μg的溶液，同法测定；按外标法以峰面积计算，即得；

杂质检测方法为：

取本品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；

取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为对照溶液；

另取咖啡酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml中含2μg的溶液，作为对照品溶液；

照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为滿量程的20％，再精密量取供试品溶液、对照溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍；供试品溶液色谱图中如有咖啡酸杂质峰，按外标法计算；如有其它杂质峰，按自身对照法计算。