CN102928530A - 一种高效液相色谱法测定豆芽中尿素残留量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本方法公开了一种高效液相色谱法测定豆芽中尿素残留量的检测方法，包括以下步骤：利用无水乙醇振荡提取豆芽中的尿素，同时沉淀蛋白，提取液经离心后，采用9-羟基呫吨作衍生剂，在酸性条件下衍生，衍生产物经碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。本方法具有定性准确、避免假阳性、定量快速等特点，适合于豆芽中尿素残留量的检测。
Description
技术领域
本发明涉及了一种豆芽中尿素残留量的检测方法，具体涉及一种高效液相色谱法测定豆芽中尿素残留量的检测方法。
背景技术
尿素别名碳酰二胺、碳酰胺、脲，是由碳、氮、氧和氢组成的有机化合物，又称脲，其化学式为CO(NH2)2，白色晶体或粉末。它是动物蛋白质代谢后产物，通常用作植物的氮肥。尿素在肝合成，是哺乳类动物排出的体内含氮代谢物。尿素是第一种以人工合成无机物质而得到的有机化合物，现已广泛应用到农业生产、化妆品等领域。
近年来，不法生产经营者在豆芽生产过程中，非法添加尿素来促其快速生长。食用后，残留的尿素会被人体吸收，在体内产生亚硝酸盐，长期食用可致癌，严重危害食用者健康。各省市加大对豆芽的违法生产经营的查处力度，捣毁了一大批“问题豆芽”生产窝点，保障广大消费者的健康和利益。
目前，国内尚没有豆芽中尿素的限量要求和指标，对于尿素在食品工业生产中的使用标准也有所变化，《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760-2007)、《进出口食品添加剂检验规程第25部分：食品工业用加工助剂》(SN/T 2360.25-2009)均将尿素纳入允许使用的食品工业用加工助剂(食品工业用加工助剂一般应在制成最后成品之前除去，有规定食品中残留量的除外)，但《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB 2760-2011)食品工业加工助剂名单中已无尿素。
《豆芽卫生标准》(GB 22556-2008)中规定，食品添加剂的品种和使用量应符合GB2760的规定；地方标准四川省《豆芽》(DB51/T1061-2010)、北京市《豆芽安全卫生要求》(DB11/377-2006)、青岛市《豆芽生产管理技术规范》(DB 3702/T090-2006)、浙江省《无公害豆芽第2部分：质量安全要求》(DB33/625.2-2007)等，主要限定铅、无机砷、总汞、镉、亚硫酸盐、亚硝酸盐、百菌清、多菌灵、2，4-D、6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、赤霉素等最大残留量，并无尿素的限量要求。
目前，国内关于豆芽生产、卫生标准中尚无尿素检测方法，其他物质中尿素含量的检测标准有：《河北省地方标准：乳及乳制品中尿素氮的测定分光光度法》(DB13/T 1111-2009)、《出口蘑菇罐头中尿素残留量检验方法》(SN/T 1004-2001)、《游泳水中尿素测定方法》(GB/T 18204.29-2000)，主要包括二乙酰一肟比色、对二甲氨基苯甲醛比色法，利用这些物质与尿素产生颜色反应，在一定波长条件下测定吸光度，从而定量检测尿素含量。安徽省地方标准《化妆品中尿素的测定高效液相色谱法》(DB34/T1330-2011)，用乙腈+水溶解化妆品中的尿素，以乙腈+水为流动相，使用C18色谱柱分离，二极管阵列检测器检测，外标法定量。
国内外文献中尿素检测方法有两类：
第一类是化学分析法，主要包括二乙酰一肟比色法、对二甲氨基苯甲醛比色法、邻苯二甲醛比色法、丁二酮肟比色法、苯酚次氯酸盐比色法、酶解纳氏比色法等，此类文献原理基本类似：尿素与某些物质发生颜色反应，在一定波长条件下检测含量。此法应用于豆芽中尿素的测定，由于豆芽基质有浅黄色，对比色结果干扰较大，容易造成假阳性。
第二类是液相色谱法，此类方法又分为两种，一种是用某些溶剂直接提取样品(黄酒、土壤等)中的尿素，采用C18柱分离，二极管阵列检测器在190-205nm紫外光区域检测尿素含量，此种方法在测定豆芽中尿素时，豆芽基质也容易造成影响，杂质峰对目标峰有干扰；另一种是利用某些特定物质(主要是9-羟基呫吨)对尿素进行衍生，产生具有荧光的物质，从而利用液相色谱-荧光检测器检测样品(红酒、人体尿液、黄酒等)中尿素的含量。(Shona Clark，et al.Determination of urea using high-performance liquidchromatography with fluorescence detection after automatedderivatisation with xanthydrol.Journal of Chromatography A，2007(1161)：207213；刑江涛等.高效液相色谱-荧光检测器法测定黄酒中尿素含量.酿酒科技，2011，3(201)：104-106.
本方法采用9-羟基呫吨衍生，液相色谱检测尿素含量的方法，应用于豆芽中尿素测定时，前处理方法加以改进，结合豆芽基质的特殊性质，利用无水乙醇提取尿素，并沉淀豆芽中的蛋白质，基质影响明显降低。对上述两个公开文献中衍生试剂的配制溶剂正丙醇改进为无水乙醇，且改进了衍生试剂的添加比例，明显降低了衍生试剂的用量。
本发明豆芽中尿素的测定方法，具有杂质干扰小、准确度高、检出限低等优点，为豆芽产品的监管提供数据支持和理论依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于选择合适的有机溶剂提取豆芽中的尿素，同时沉淀蛋白，降低豆芽基质干扰，同时优化衍生试剂的添加比例。
本发明所述的的技术问题可通过以下技术方案得以解决：
(1)准确称取1-5g粉碎后的豆芽样品于50mL离心管中，加入10-20mL无水乙醇，震荡提取20-30min；
(2)提取液在6000-8000r/min条件下离心3-5min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，滤液待测；
(3)取上述滤液0.5-1.0mL，加入0.02mol/L 9-羟基呫吨衍生剂50-100μL，1.5mol/L盐酸50-100μL，使得衍生反应比例范围为：豆芽提取液∶0.02mol/L 9-羟基呫吨∶1.5mol/L盐酸＝5∶1∶1至10∶1∶1，室温条件下避光反应20-30min；
(4)衍生后的样液采用高效液相色谱法分离检测，以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱分离，荧光检测器(激发波长：213nm，发射波长：308nm)检测，外标法定量，计算豆芽中尿素的残留量。
本发明的有益效果在于，建立了一种豆芽中尿素残留量的测定方法，采用无水乙醇提取豆芽中的尿素，同时沉淀蛋白，降低基质干扰、优化了衍生试剂的添加比例，明显降低了衍生试剂的用量。方法具有基质干扰小、准确度高、检出限低等特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1某市售散装黄豆芽中尿素残留量的测定
1、分析步骤
称取粉碎后豆芽试样2.00g(精确到0.001g)于50mL离心管中，加10mL无水乙醇振荡提取30min，8000r/min离心5min，上清液经0.45μm有机滤膜过滤后，滤液待测。移取滤液0.5mL于1.5mL进样瓶中，加入100μL 0.02mol/L 9-羟基呫吨和100μL 1.5mol/L盐酸溶液，避光衍生反应20min，待测。
2、高效液相色谱条件
仪器：Agilent1200液相色谱仪配有荧光检测器；色谱柱：以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：乙腈+0.02mol/L乙酸钠溶液(梯度洗脱，程序见表1)；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：35℃；激发波长：213nm，发射波长：308nm。
表1液相色谱梯度洗脱条件
| 时间/min | 乙腈/％ | 0.02mol/L乙酸钠/％ |
| 0.00 | 20 | 80 |
| 0.05 | 20 | 80 |
| 12.0 | 50 | 50 |
| 13.0 | 100 | 0 |
| 20.0 | 100 | 0 |
| 22.0 | 20 | 80 |
| 25.0 | 20 | 80 |
3、标准工作曲线
用将100μg/mL的尿素标准储备液逐级稀释得1.00，2.00，5.00，10.0，25.0μg/mL的标准工作液。分别取配制的标准工作液500μL，加入100μL 0.02mol/L 9-羟基呫吨溶液和100μL 1.5mol/L盐酸溶液，避光衍生反应20min。按照上述仪器条件测定，所得标准曲线方程为：Y＝120.4X+28.4，相关系数R2＝0.9997。
4、试样测定及加标回收结果
经6次平行实验测定，该市售散装黄豆芽尿素残留量为28.4mg/kg，相对标准偏差RSD为5.8％。对该市售散装黄豆芽进行加标回收实验，加标量分别为20μg、100μg，加标回收率在81.1％-104.7％之间，相对标准偏差在4.2％-8.9％之间。
实施例2多个市售样品中尿素残留量的测定
随机采购市售豆芽7种，按照上述的前处理方法和仪器分析方法进行实验。对样品做3次平行测定，测定结果见表2。
表2市售豆芽含量测定结果(n＝3)
(单位：mg/kg)
从上述结果可以看出，各品牌豆芽样品都检测出不同含量的尿素残留量(有机豆芽在5.5-11.0mg/kg之间，散装豆芽含量稍高在21.4-37.4之间)，分析原因可能是豆芽生产过程中可能自身氨基酸代谢产生尿素，对检测结果会产生一定影响，因此建议在制定豆芽中尿素限量时，应该考虑此方面的因素。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。
Claims (4)
1.一种高效液相色谱法测定豆芽中尿素残留量的检测方法，其特征包括如下步骤：
(1)样品加入有机溶剂，震荡提取试样中的尿素同时沉淀蛋白质；
(2)提取液经离心处理后，取上清液过微孔滤膜；
(3)滤液加入0.02mol/L 9-羟基呫吨衍生剂，加入1.5mol/L盐酸，在酸性条件下衍生；
(4)衍生后的样液经高效液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量，计算豆芽中尿素的残留量。
2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所用的提取豆芽中尿素和沉淀蛋白的有机溶剂为无水乙醇。
3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所用的0.02mol/L9-羟基呫吨衍生剂采用无水乙醇为溶剂配制。
4.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，衍生反应比例范围为：豆芽提取液∶0.02mol/L 9-羟基呫吨∶1.5mol/L盐酸为5∶1∶1至10∶1∶1。
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