CN109632781A - 抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸与咖啡酸含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸与咖啡酸含量的测定方法，包括：S1、向抗球虫饲料添加剂产品中加入甲醇或乙醇浸提，将提取液作为样品溶液；S2、向样品溶液中加入甲醇或乙醇、十二烷基硫酸钠、铁氰化钾和三氯化铁，于暗处放置一段时间，加入酸性物质终止反应；S3、用紫外分光光度计测定190～800nm处的吸光度值；S4、分别配制绿原酸、咖啡酸标准品溶液，按S2‑S3进行检测，绘制标准曲线；S5、根据样品溶液的检测结果，对照标准曲线，获得样品溶液中绿原酸与咖啡酸的浓度，计算出产品中绿原酸与咖啡酸的含量。利用本发明的紫外分光光度法测定爱绿爽产品中绿原酸与咖啡酸含量，操作简单、成本低、灵敏度高、稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体地说，涉及抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸与咖啡酸含量的测定方法。
背景技术
在禽类养殖中，球虫病是严重危害养殖业的疾病之一，该病的发生率极高，分布范围广，其病死率可达40％～80％。爱绿爽是北京爱绿生物科技有限公司生产的一种安全高效、无残留、不易产生耐药性的抗球虫饲料添加剂(参见ZL201410832060.X，发明名称：一种天然植物抗球虫饲料添加剂及其应用)。该饲料添加剂中，发挥抑杀球虫作用的主要为酚酸类成分，包括绿原酸、咖啡酸等，酚酸类物质可直接抑杀球虫子孢子、第一代及第二代裂殖体，还可激活和增加体内特异性蛋白酶类，发挥对虫体蛋白质的分解作用，抑制球虫的发育，降低卵囊排出率。为了明确产品中酚酸类成分的含量，作为品质控制指标，用于产品真伪鉴定，必须运用适当的检测手段来实现这一目的，且该手段应快速、准确，便于操作。
酸类物质的常规检测手段包括总酸滴定法(常用于酸度范围已知的无机酸类，利用氢离子浓度的差异标定总酸的含量)、高效液相色谱法(常用于定量检测某种单一酸类物质的测定，不限于无机或有机酸)等，该产品所含酸类物质主要为有机酸中的酚酸类，且含量范围未知，不适用于总酸滴定法；高效液相色谱法非常精确，但是操作要求严格，步骤相对复杂，耗时耗力，仪器成本高，虽可用于该产品的总酚酸常规测定，然而综合考虑到成本、操作难易度等因素，高效液相色谱法并非日常生产中进行产品质控的优选方法。
发明内容
本发明的目的是提供抗球虫饲料添加剂产品(特别是天然植物抗球虫饲料添加剂产品)中绿原酸与咖啡酸含量的测定方法。
本发明构思如下：利用紫外分光光度法测定爱绿爽产品(ZL201410832060.X)中总酚酸(绿原酸和咖啡酸)含量。紫外分光光度计法的原理为：酚类化合物在碱性条件中，当有氧化剂铁氰化钾存在时，酚类化合物中的酚羟基与三氯化铁中的铁离子呈现显色反应，生成蓝色络合物。根据络合物颜色深浅，通过紫外分光光度计在其相应波长下进行比色，能够迅速准确地测定产品中的总酚酸含量。
为了实现本发明目的，本发明提供的抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸与咖啡酸含量的测定方法，包括以下步骤：
S1、向抗球虫饲料添加剂产品中加入甲醇或乙醇浸提，将提取液作为样品溶液；
S2、向样品溶液中加入适量甲醇或乙醇，然后加入十二烷基硫酸钠、铁氰化钾和三氯化铁，混匀，于暗处放置一段时间，向体系中加入酸性物质终止反应；
S3、用紫外分光光度计测定190～800nm(优选324nm)处的吸光度值；
S4、分别配制不同浓度梯度的绿原酸标准品溶液和咖啡酸标准品溶液，按照步骤S2-S3进行检测，根据标准品溶液的浓度及相应的吸光度值绘制标准曲线；
S5、根据样品溶液的检测结果，对照标准曲线，获得样品溶液中绿原酸与咖啡酸的浓度，从而计算出抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸的含量；
其中，所述抗球虫饲料添加剂产品为天然植物抗球虫饲料添加剂产品(爱绿爽产品)。
前述的方法，步骤S1具体为：向1.0～2.0g天然植物抗球虫饲料添加剂产品中加入70％甲醇30～60ml，加热回流提取2～3次，每次提取1～2h，放冷过滤，合并滤液，用70％甲醇定容至50ml，作为样品溶液。
优选地，向2.0g抗球虫饲料添加剂产品中加入70％甲醇40ml，加热回流提取2次，每次提取1h，放冷过滤，合并滤液，用70％甲醇定容至50ml，作为样品溶液。
可选地，步骤S1具体为：向0.1～2.0g(优选2.0g)天然植物抗球虫饲料添加剂产品中加入70％甲醇40ml，在超声功率60W，频率45HZ下超声2次，每次30min，超声后过滤，收集滤液，用70％甲醇定容至50ml，作为样品溶液。
前述的方法，步骤S2所述酸性物质为盐酸，优选0.1M盐酸。
步骤S2具体为：向0.5～2ml样品溶液中加入无水乙醇3～5ml，然后加入0.3％十二烷基硫酸钠0.5～2ml、0.5％铁氰化钾0.2～1ml、1％三氯化铁0.2～1ml，混匀，暗处放置3～5min，然后向体系中加入0.05～0.1mol/L盐酸溶液至总体积25～50ml，混匀，暗处放置20～40min。
优选地，向2ml样品溶液中加入无水乙醇5ml，然后加入0.3％十二烷基硫酸钠2ml、0.5％铁氰化钾1ml、1％三氯化铁1ml，混匀，暗处放置5min，然后向体系中加入0.1mol/L盐酸溶液至总体积25ml，混匀，暗处放置20min。
前述的方法，步骤S4中以甲醇或乙醇为溶剂配制不同浓度梯度的绿原酸标准品溶液和咖啡酸标准品溶液。
利用本发明提供的天然植物抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸含量的测定方法，绿原酸的线性检测范围：0.32～1.92μg/ml，最低检测限：0.32μg/ml。咖啡酸的线性检测范围：0.005～0.04μg/ml，最低检测限：0.005μg/ml。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用紫外分光光度法测定(天然植物)抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸与咖啡酸含量，较高效液相色谱法操作更简单、成本低、灵敏度高和稳定性好，对于每日进行大量样品检测的生产企业来说，提高了工作效率，适宜作为产品质量与真伪的判断和鉴别手段。本发明为紫外分光光度法测定天然植物抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸与咖啡酸含量提供了一套标准化操作流程。
附图说明
图1为本发明实施例1中样品溶液与绿原酸标准品溶液在190～800nm波长范围内吸收光谱图。
图2为本发明实施例1中绿原酸标准品溶液在190～800nm波长范围内吸收光谱图。
图3为本发明实施例1中咖啡酸标准品溶液在190～800nm波长范围内吸收光谱图。
图4为本发明实施例1中样品溶液在190～800nm波长范围内吸收光谱图。
图5为本发明实施例1中根据不同浓度绿原酸标准品溶液测定的吸光度值所绘制的标准曲线。
图6为本发明实施例1中根据不同浓度咖啡酸标准品溶液测定的吸光度值所绘制的标准曲线。
图7为利用HPLC法检测绿原酸标准品的结果。
图8为利用HPLC法检测咖啡酸标准品的结果。
图9为利用HPLC法检测供试品的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1利用紫外分光光度法测定爱绿爽产品中绿原酸含量
1、实验器材
紫外分光光度计、超声清洗机、烧杯、三角烧瓶、量筒、移液管等。
2、实验试剂
绿原酸标准品、0.3％十二烷基硫酸钠、无水乙醇、0.5％铁氰化钾、1％三氯化铁、0.1mol/L盐酸等。
3、实验步骤
3.1显色反应试液的制备
精确称取十二烷基硫酸钠3.0g，加水1000ml，得到十二烷基硫酸钠试液。
取铁氰化钾0.5g，加水100ml溶解备用。
取三氯化铁六水合物1.0g，加水溶解成100ml备用。
3.2绿原酸标准品溶液与咖啡酸标准品溶液的制备
精密称取绿原酸标准品适量，加95％乙醇配制成0.402mg/ml的对照品储备液。精密吸取供试品溶液1ml置于25ml棕色容量瓶中，用95％乙醇定容至刻度，即得标准品溶液。
精密称取咖啡酸标准品适量，加70％乙醇配制成0.2mg/ml的对照品储备液。精密吸取储备溶液1ml置于25ml棕色容量瓶中，用70％乙醇定容至刻度，即得标准品溶液。
3.3样品溶液的制备
爱绿爽产品2.0g，精密称定，加70％甲醇40ml加热回流2次，每次1h(或功率60W，频率45HZ下超声2次，每次30min)放冷过滤，合并滤液，用70％甲醇定容至50ml量瓶中，备用。
3.4测定波长的确定
精密吸取样品溶液、绿原酸标准品溶液或咖啡酸标准品溶液、95％乙醇(空白对照)各2ml，分别置25ml棕色瓶中，加无水乙醇至总体积5ml，再分别加入0.3％十二烷基硫酸钠2ml、0.5％铁氰化钾-1％三氯化铁(体积比1:1)混合物2ml，摇匀，暗处放置5min，加0.1mol/l盐酸溶液至25ml，摇匀，暗处放置20min。在190～800nm波长范围内测定吸收光谱，结果样品溶液(图4)与标准品溶液(图2-图3)在该范围内吸收光谱一致，且在324nm处有最大吸收(图1)。
3.5标准曲线的绘制
分别吸取绿原酸标准品溶液0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、3ml置于25ml容量瓶中，加无水乙醇至5ml，再分别加入0.3％十二烷基硫酸钠2ml、0.5％铁氰化钾-1％三氯化铁(体积比1:1)混合物2ml，摇匀，暗处放置5min，加0.1mol/L盐酸溶液至25ml，摇匀，暗处放置20min。用紫外分光光度计测定324nm处的吸光度值。按紫外分光光度法，以绿原酸标准品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程，计算绿原酸含量(图5)。
分别吸取咖啡酸标准品溶液0ml、0.2ml、0.3ml、0.5ml、1ml置于25ml容量瓶中，加无水乙醇至5ml，再分别加入0.3％十二烷基硫酸钠2ml、0.5％铁氰化钾-1％三氯化铁(体积比1:1)混合物2ml，摇匀，暗处放置5min，加0.1mol/L盐酸溶液至50ml，摇匀，暗处放置20min。用紫外分光光度计测定324nm处的吸光度值。按紫外分光光度法，以咖啡酸标准品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程，计算咖啡酸含量(图6)。
总酚酸含量＝ml/m×100％
其中，ml＝C×50×50
ml：提取物绿原酸/咖啡酸的质量(g)
m：待测样品质量(g)
C：待测液的浓度(mg/ml)
利用紫外分光光度法测得的绿原酸的线性检测范围：0.32～1.92μg/ml，最低检测限：0.32μg/ml。咖啡酸的线性检测范围：0.005～0.04μg/ml，最低检测限：0.005μg/ml。
对比例利用HPLC法测定爱绿爽产品中绿原酸、咖啡酸的含量
1实验材料
1.1实验仪器
电热鼓风干燥箱(WGL-45B)，Agilent1260高效液相色谱仪(DAD检测器、自动进样器、在线脱气、四元泵)；双频数控超声波清洗器(KQ-500VD型)等。
1.2实验试剂
乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其他试剂均为分析纯。
对照品：绿原酸(批号Y24J7K16726)；咖啡酸(批号Y17D6C7672)购自上海源叶生物科技有限公司。
2方法与结果
2.1标准品溶液的制备
绿原酸：取绿原酸准品品适量，精密称定，置棕色瓶中，加50％甲醇制成每l ml含1mg的溶液，即得(10℃以下保存)。
咖啡酸：取咖啡酸准品品适量，精密称定，加甲醇制成每l m l含0.5mg的溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
取与实施例1同一批次生产的爱绿爽产品粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％的甲醇溶液50ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率60W，频率45HZ)30min，取出，放冷，再称定重量，用50％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3色谱条件
AgilentSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以乙腈-0.4％磷酸溶液(体积比13:87)；流速0.8ml·min-1；检测波长327nm；进样量：标准品5μL；供试品10μL。
2.4实验结果
绿原酸标准品的HPLC检测结果见图7，咖啡酸标准品的HPLC检测结果见图8，供试品的HPLC检测结果见图9。
结果计算：
式中，Wi：试样含量mg/g
m：试样质量g
V：提取液的总体积ml
Vst：标准品进样体积μl
Pst(平均)：对照品平均峰面积值
Pi：试样进样体积对应的峰面积
Vi：试样分取液进样体积μl
Ci：标准品浓度ug/ml
利用HPLC法测定供试品中绿原酸、咖啡酸含量的结果，与紫外分光光度法测定结果基本一致(表1)。
表1
注：表1中同一行所列数据针对同一批样品。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸与咖啡酸含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、向抗球虫饲料添加剂产品中加入甲醇或乙醇浸提，将提取液作为样品溶液；
S2、向样品溶液中加入适量甲醇或乙醇，然后加入十二烷基硫酸钠、铁氰化钾和三氯化铁，混匀，于暗处放置一段时间，向体系中加入酸性物质终止反应；
S3、用紫外分光光度计测定190～800nm处的吸光度值；
S4、分别配制不同浓度梯度的绿原酸标准品溶液和咖啡酸标准品溶液，按照步骤S2-S3进行检测，根据标准品溶液的浓度及相应的吸光度值绘制标准曲线；
S5、根据样品溶液的检测结果，对照标准曲线，获得样品溶液中绿原酸与咖啡酸的浓度，从而计算出抗球虫饲料添加剂产品中绿原酸的含量；
其中，所述抗球虫饲料添加剂产品为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：向1.0～2.0g抗球虫饲料添加剂产品中加入70％甲醇30～60ml，加热回流提取2～3次，每次提取1～2h，放冷过滤，合并滤液，用70％甲醇定容至50ml，作为样品溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：向2.0g抗球虫饲料添加剂产品中加入70％甲醇40ml，加热回流提取2次，每次提取1h，放冷过滤，合并滤液，用70％甲醇定容至50ml，作为样品溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：向1.0～2.0g抗球虫饲料添加剂产品中加入70％甲醇40ml，在超声功率60W，频率45HZ下超声2次，每次30min，超声后过滤，收集滤液，用70％甲醇定容至50ml，作为样品溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述酸性物质为盐酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2具体为：向0.5～2ml样品溶液中加入无水乙醇3～5ml，然后加入0.3％十二烷基硫酸钠0.5～2ml、0.5％铁氰化钾0.2～1ml、1％三氯化铁0.2～1ml，混匀，暗处放置3～5min，然后向体系中加入0.05～0.1mol/L盐酸溶液至总体积25～50ml，混匀，暗处放置20～40min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2具体为：向2ml样品溶液中加入无水乙醇5ml，然后加入0.3％十二烷基硫酸钠2ml、0.5％铁氰化钾1ml、1％三氯化铁1ml，混匀，暗处放置5min，然后向体系中加入0.1mol/L盐酸溶液至总体积25ml，混匀，暗处放置20min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3用紫外分光光度计测定324nm处的吸光度值。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中以甲醇或乙醇为溶剂分别配制绿原酸标准品溶液和咖啡酸标准品溶液。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，绿原酸的线性检测范围：0.32～1.92μg/ml，最低检测限：0.32μg/ml；咖啡酸的线性检测范围：0.005～0.04μg/ml，最低检测限：0.005μg/ml。
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|---|---|---|---|---|
| CN114045219A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-02-15 | 中国药科大学 | 一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法 |
| CN117347357A (zh) * | 2023-12-05 | 2024-01-05 | 江门天锦泰生物工程有限公司 | 一种含有藤茶提取物的饲料添加剂含量检测方法 |
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