CN101126752B

CN101126752B - 一种同时测定水果中多种多酚类化合物含量的方法

Info

Publication number: CN101126752B
Application number: CN2007100456387A
Authority: CN
Inventors: 张晋芬; 袁冰; 徐华龙; 沈伟
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2007-09-06
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2027-09-06
Also published as: CN101126752A

Abstract

本发明是一种同时测定水果中多种多酚类化合物含量的高效液相色谱法。采用包含有紫外检测器的液相色谱仪和反相键合硅胶色谱柱。采用了有机溶剂流动相A和一定pH值的酸性水溶液流动相B作梯度洗脱剂。本发明仅在常用的高效液相色谱仪上同时定量测定水果中多种多酚类化合物，极具应用价值。本发明建立了一种微波萃取一高效液相色谱相结合测定水果中多种多酚类化合物含量的方法，方法先进、准确，样品处理简单、快速，同时方法使用Carrez试剂作为水果样品的净化剂，这是Carrez试剂首次用于水果多酚的测定。

Description

一种同时测定水果中多种多酚类化合物含量的方法

技术领域

本发明涉及水果多酚类化合物的含量测定方法，使用通常的高效液相色谱仪，特定的色谱条件，就可以完成水果中没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿元酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸或芦丁等多酚类化合物的测定，得到准确的结果。

背景技术

水果多酚具有药用及食用价值，由于多酚独特的化学和生物学特性，从食用植物中提取多酚并将其纯化，可作为天然的食品添加剂，调节食品风味，并起到抗氧化(高效、无毒且具有保健性)和防腐作用。水果中多酚类化合物不仅具有药用及食用价值，也是水果成熟度的重要指标之一。常用的测定酚类的方法有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法及毛细管电泳法。紫外分光光度法和薄层色谱法只能测定总酚或某一种多酚含量，不能确定具体种类和含量。高效液相色谱法操作简便、准确度高、重现性好，可同时定量测定多种多酚化合物，能确定具体种类和含量。但目前研究的多酚种类相差较多，且仅局限于苹果、葡萄、柑橘等少量水果。另外制备水果样品时通常使用榨汁法，榨汁法虽然很简便，但由于样品中含水量过高，多酚含量过低，所以不易准确测量，且有些多酚的榨汁提取效率低。许多水果果汁不能直接用于测量，需除去里面所含的类脂、类胡罗卜素和叶绿素等物质，还有些果汁中多酚需经水解后方可测量，方法较复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、准确性好、效率高的水果中多种多酚类化合物同时测定的方法。

本发明同时测定水果中多种多酚类化合物含量的高效液相色谱法包括下述步骤：

1.分别用浓度为10～50％(体积百分比)的甲醇水溶液作溶剂制备各种多酚不同浓度梯度在0.02～0.2g/L的标准溶液；

2.制备待测样品：选果肉(或果皮)-切碎-烘干-捣碎，制得水果粉剂样品，将上述的甲醇水溶液按料液质量比1：6～10加入粉剂样品，用可调功率微波化学反应器以功率150W～300W进行微波萃取5～20min。将微波萃取后的萃取液过滤，用同样的甲醇水溶液把过滤后的萃取液稀释为粉剂样品质量浓度为10～100g/L的待测液，在定容时向体系中加入Carrez(卡瑞)试剂I和II各0.05～0.25ml进行净化处理。摇匀、静置；

3.使用包括四元泵(可梯度洗脱即可)、恒温箱、紫外检测器以及工作站所组成的HPLC仪。在反相键合色谱柱上，以甲醇/稀磷酸为其流动相梯度洗脱分离没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿元酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸和芦丁。

色谱条件如下：

分析柱：反相键合硅胶色谱柱；

流动相：甲醇/0.002～0.02mol/L的磷酸水溶液；

流速：0.5～1.2ml/min；

洗脱方式：梯度洗脱；

检测：UV 240～300nm；

温度：20～35℃；

进样体积：15.0～25.0μL；

分别取0.20μm或0.45μm针头过滤器过滤后的系列标准溶液进行谱图及回归曲线的测定。经处理后的待测样品用0.20μm或0.45μm针头过滤器过滤后进样，在上述色谱条件下测定多酚类化合物含量。

4.依据色谱峰面积，利用外标法由各标准溶液的回归方程计算样品中各多酚类化合物的含量。

本发明中洗脱梯度为流动相A和流动相B在0～25min内体积比在2.0：98.0～80：20梯度范围。本发明中待测样品的制备采用微波萃取处理待测组分。本发明中待测样品的制备时使用Carrez试剂即卡瑞试剂作为样品净化剂。本发明中反向键合色谱柱为C₈或C₁₈硅胶色谱柱，当反相键合色谱柱为C₈硅胶色谱柱时，本发明能在16min内完成对一个水果样品的定量检测。本发明中用外标法计算多酚类化合物的含量。本发明中测定的多酚类化合物为没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿元酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸和芦丁。本发明中水果样品是苹果皮、梨皮、香蕉皮、苹果肉或梨肉。

在样品制备时，本发明采用了微波萃取处理水果的被测组分，微波萃取是一种较新的提取水果中多酚的方法，微波具有高效性与高度选择性。

本发明采用了Carrez试剂即卡瑞试剂作为样品净化剂处理样品不仅可达到净化样品、保护色谱柱的目的，同时测量精度和回收率都不同程度得到提高。

本发明分别获得了对同时测定水果中多种多酚类化合物含量的高效液相色谱法有重要影响的几个条件：检测波长、温度、样品溶剂、流动相配比和流速及洗脱梯度以及微波萃取率影响因素(如微波功率、料液比、萃取液成分、萃取时间)等，并考察了回归方程、相关系数及线性范围，获得较好的精密度与回收率。其中，回收率是向已知浓度样品中加入一定量标准溶液，按相同色谱条件及实验方法测定，利用增量法计算回收率。同一个水果样品平行测定三次，所得结果相对标准偏差在4％以内，方法的回收率在90％～110％之间，因此本发明还具有准确度高，重现性好的优点。

本发明使用甲醇/稀磷酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，分离结果的重现性较好，通过选择稀磷酸的浓度微调pH值及洗脱梯度的改变，使分析方法适用于不同品牌反相键合色谱柱和各种水果试样类型(例如：梨、苹果、香蕉皮、葡萄、柑橘等水果)中的多酚化合物的测定，并能得到准确的结果。本发明除了增加普通可调功率微波化学反应器外不需增加设备，即可适合于一般HPLC分析室采用。

本发明能在16min内完成对一个水果样品中多酚类化合物的定量检测，各多酚分离度好，结果准确，并且具有分析范围广，分析效率高、操作方便的特点。

附图说明

图1为本发明实施例混合对照品溶液的色谱图。

图2为本发明实施例河北雪花梨供试品溶液的色谱图。

图3为本发明实施例8条标准曲线回归方程、相关系数、线性范围。

图4为本发明实施例方法精密度及回收率。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明。

1、对照品溶液的制备：

分别取纯度≥99％的没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、芦丁、绿原酸、阿魏酸标样。用10％甲醇溶液配制以上8种多酚约1g/L的标准贮备液。根据水果中多酚的实际含量及每种多酚在一定紫外检测波长下的响应值，稀释一定倍数配制成含有上述8种多酚化合物的混合标准溶液，再将上述溶液稀释成不同的浓度梯度，即上述混合标准溶液浓度的0.2，0.4，0.6，0.8，1.0倍。

2、供试品溶液的制备：

微波萃取法制样：新鲜水果样品(河北雪花梨、河北雪花梨皮、富士苹果、富士苹果皮、香蕉皮)切碎，在电热恒温鼓风干燥箱里于40℃烘4～5天，烘干后样品用组织捣碎机捣碎。取1g左右，加入8倍其重量的40％甲醇溶液(料液比1∶8)，用可调功率微波化学反应器进行微波萃取。微波功率为300W，萃取时间为10min。将微波处理后的样品过滤，用去离子水于25ml容量瓶定容。定容时向体系中加入Carrez试剂I和Carrez试剂II各0.05ml(注：Carrez试剂I和Carrez试剂II配制按《实验室溶液制备手册》李云巧编著，化学工业出版社)静置。

3、色谱条件：

色谱柱：Eclipse XDB-C8柱(4.6x150mm，5μm)；柱温：25℃；流速：0.5ml/min；进样体积：20.0μL；检测器：紫外检测器；检测波长：260nm。流动相A：甲醇，流动相B：0.005mol/L磷酸溶液；采用梯度洗脱程序：0～16min内，由4％A变化为40％A。

4、分别取对照品及供试品溶液经0.45μm针头过滤器过滤后注入液相色谱仪进行分析测定，由化学工作站得到8条标准曲线回归方程及样品的色谱图。对照品溶液的色谱图见图1；雪花梨供试品溶液的色谱图见图2；8条标准曲线回归方程见图3。进一步用外标法得到水果或水果皮中各多酚类化合物的含量：

注：(mg/g)代表每克粉剂样品中多酚的毫克数。

Claims

1.一种同时测定水果中多种多酚类化合物含量的方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行同时测定水果中多酚化合物，具体测定方法为：

(1)用体积百分比为10～50％的甲醇水溶液制备各种多酚不同浓度梯度在0.02～0.2g/L的标准溶液；

(2)待测样品的制备：用上述的甲醇水溶液以料液质量比1∶6～10微波萃取已切碎烘干的水果样品，再用同样的甲醇水溶液把萃取液稀释至水果样品浓度为10～100g/L，同时加入样品净化剂净化；静置后，取清液经0.20或0.45μm针头过滤器过滤后待分析；

(3)使用包括四元泵、恒温箱、紫外检测器以及化学工作站所组成的HPLC仪，在反相键合色谱柱上，以甲醇/稀磷酸溶液为流动相，梯度洗脱分离多酚，色谱条件如下：

分析柱：反相键合C8色谱柱；

流动相：有机相A：甲醇；

水相B：0.005mol/L的磷酸水溶液；

流速：0.5ml/min；

洗脱方式：梯度洗脱，0～16min内，由4％A变化为40％A；

检测：UV 260nm；

温度：25℃；

进样体积：20.0μL；

(4)用外标法定量分析计算水果中多酚类化合物的含量，所述多酚类化合物为没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿元酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸或芦丁。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于微波萃取时微波反应器所用的功率为150W～300W，萃取时间为5～20min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于待测样品的制备时使用Carrez试剂即卡瑞试剂作为样品净化剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于水果样品是苹果皮、梨皮、香蕉皮、苹果肉或梨肉。