CN105241965A - 一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于检测分析技术领域，涉及一种利用高效液相色谱和自由基检测系统在线快速检测样品总抗氧化性的方法。所述高效液相色谱分析仪包括依次连接的进样器、四元梯度泵、色谱分析柱及柱温箱和光电二极管阵列PAD检测器；所述自由基反应检测装置包括自由基反应模件、控温箱、高压泵和紫外可见光检测器，所述自由基反应模件与高效液相色谱仪相连接，所述控温箱控制自由基反应模件温度，高压泵与自由基反应模件连接，自由基反应模件与紫外可见光检测器相连接；所述色谱分析柱用C18反相色谱柱，型号为20×3.9mm，5um；所述的自由基为化学自由基；本发明方法测定过程中色谱图峰型完整、美观，无拖尾现象；测定结果准确、快速、选择性强而且灵敏度高。

Description

一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，涉及一种利用高效液相色谱和自由基检测系统在线快速检测样品总抗氧化性的方法。

背景技术

自20世纪80年代，出于对人工合成的抗氧化剂的安全性考虑，人们越来越倾向于开发使用天然的抗氧化剂。从草药、水果和蔬菜中分离植物成分用作食品、化妆品和药品中的防腐剂成为研究热点。例如水果、蔬菜，牛奶，脂肪、蛋黄和海鱼都是很好的抗氧化物质来源。目前已经报道，具有潜在的抗氧化性的天然抗氧化物质有：茶多酚、大豆异黄酮、枸杞多糖、天然虾青素、黄体素、硫辛酸、α-亚麻酸(ALA)、番茄红、维生素E、维生素C、β-胡萝卜素、辅酶Q10、超氧化物歧化酶(SOD)、大豆肽、肌肽和谷胱甘肽、金属硫蛋白、硒，大蒜中的硫化物，等。

目前，评价生物活性物质抗氧化能力的研究已经在全世界得到广泛关注。随着高效液相色谱，质谱技术及以核磁共振等现代科学技术的出现及发展，抗氧化活性研究也出现了在线抗氧化检测系统。大部分报道是指与HPLC联用的抗氧化在线检测技术。例如在线HPLC-RSD(HighPerformanceLiquidChromatography-RadicalScavengerDetection)或者HPLC-RSD-NMR/MS分析抗氧化活性系统。HPLC在线(On-line)抗氧化检测系统是指通过HPLC系统与柱后自由基衍生系统连接起来，实现HPLC系统对样品中目的化合物质的洗脱及分离，这些化合物洗脱出来，随流动相进入柱后自由基衍生系统，同时检测器检测化合物清除自由基的能力。通常以自由基溶液色谱倒峰图体现。倒峰图面积越大，代表自由及被清除的越多，代表样品的抗氧化性强。同时使用标准抗氧化物质浓度与负峰面积建立标准曲线和标准物质抗氧化当量换算，从而实现分析样品的抗氧化活性。相对与在线检测方法，文中提到的传统抗氧化研究方法称为非在(Off-line)法。HPLC联用的在线系统克服了传统非在线抗氧化剂筛选方法纯化步骤繁琐，化合物提取、纯化和抗氧化性测定多步操作，费时和费力的问题。HPLC联用的在线系统可以实现高效、快速对植物或食品中的天然抗氧化物质进行分离、定性、定量的研究。高效液相色谱技术可以减少样品前处理的样品纯化步骤，直接检测；生物化学检测柱后衍生系统的联用，有利于分析色谱系统分离出化合物的生物活性。王小淞等选取DPPH自由基为检测

用自由基，检测了黄芩根提取物中的抗氧化活性成分。张雷等、傅茂润等也以相似的的方法检测了茶叶、紫薯中的抗氧化物质。DPPH自由基稳定，系统组成与使用ABTS自由基类似，但灵敏度不及ABTS自由基。裴世春等、高翔等、耿雪飞等利用ABTS自由基联用HPLC检测植物材料中抗氧化物质。西北农林科技大学申请了利用ABTS自由基检测混合物中抗氧化活性物质的发明专利(申请号201110330342.6)。

物质总抗氧化能力(TotalAntioxidantCapacity)是物质清除不同的自由基或者是物质的不同活性成分、清除不同的自由基的有效和。由于样品总抗氧化活性的好坏，是筛选天然抗氧化资源的依据，也是进行抗氧化活性物质分离和鉴定的理论依据。评价物质的总抗氧化活性是很有必要的。目前国内外常用的测定总抗氧化活性的方法有DPPH法，ABTS法，ORAC法，FRAP法。但是这些方法对于大规模的分析植物样品存在着操作步骤繁琐，耗时耗力的缺点。大规模分析样品的总抗氧化性有望依赖目前已经报道HPLC在线检测系统。ORAC法(由于其实验过程中荧光物质对pH敏感)和FRAP法(由于实验操作繁琐)，都太不利于在线抗氧化检测。自由基捕获法，其自由基化学性质稳定，反应迅速适用于HPLC在线抗氧化检测。目前已经实现了HPLC-DPPH法和HPLC-ABTS法在线检测植物样品抗氧化性活性。但是目前报道的HPLC-DPPH/ABTS法的特点是在线分析单个化合物的抗氧化性，对与总混合物的抗氧化活性并不能直接且快速的测定。关于HPLC-在线快速检测样品的总抗氧化活性研究未见报道。所以，急需要建立一种快速的分析总抗氧化性的测定方法，并可以被科研或工业所利用。

发明内容

本发明的目的是针对现有的分析物质总抗氧化性的测定方法中存在的技术缺陷，提供一种能够快速，准确地测定样品的总抗氧化性的方法，本发明方法测定过程中色谱图峰型完整、美观，无拖尾现象；测定结果准确、快速、选择性强而且灵敏度高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，是利用HPLC-FRSD分析系统检测样品总抗氧化性的分析方法，所述HPLC-FRSD分析系统包括相互连接的高效液相色谱分析仪和自由基反应检测装置，所述高效液相色谱分析仪包括依次连接的进样器、四元梯度泵、色谱分析柱及柱温箱和光电二极管阵列PAD检测器；所述自由基反应检测装置包括自由基反应模件、控温箱、高压泵和紫外可见光检测器，所述自由基反应模件与高效液相色谱仪相连接，所述控温箱控制自由基反应模件温度，高压泵与自由基反应模件连接，自由基反应模件与紫外可见光检测器相连接；所述色谱分析柱用C18反相色谱柱，型号为20×3.9mm，5um；所述的自由基为化学自由基；所述的在线快速检测样品总抗氧化性的方法包括如下进行的步骤：

（1）以体积分数为80-90%的甲醇，或者是其它具有相似极性的有机溶剂或所述有机溶剂的混合物作为溶媒，于40-60℃超声波提取10-50min，再震荡提取1-15h，得提取液；

（2）将步骤（1）所得的提取液离心、分离，得上清液；

（3）配制一系列浓度梯度的维生素C水溶液作为标准物质，进行在线HPLC-FRSD分析，建立负峰面积(Y)和相对应VC浓度(X)的线性方程；

（4）将步骤（2）中所得上清液经0.22微米有机滤膜过滤后进行上样分析，将HPLC-FRSD系统测得的样品负峰面积带入步骤（3）的线性方程，换算成维生素C当量，以求得各样品甲醇提取物的抗氧化值。

进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述样品为植物固体样品时，将植物固体样品干燥粉碎过60-100目筛再进行步骤（1）的操作。

进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述化学自由基选择DPPH自由基或ABTS自由基。

进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述DPPH自由基溶液浓度为0.2mM，DPPH自由基溶液检测波长为517nm。

进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述ABTS自由基溶液的浓度为在400nm时吸光度为0.70±0.02AU吸光值的浓度。

进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述高效液相色谱分析仪使用的流动相为0.1%(V醋酸:V水=1:999)醋酸水溶液和甲醇的混合液，所述0.1%醋酸水溶液体积分数为37%，甲醇体积分数为63%。

进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述流动相的流速为0.91mLmin^-1；所述柱温箱设置的柱温为30°C，所述PAD检测器PAD检测波长：2D通道分别设置283nm和245nm。

进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述自由基的引入流速为0.80mLmin^-1，所述控温箱设置的温度为30°C。

一种在线快速检测柑橘样品总抗氧化性的方法，是利用HPLC-FRSD分析系统检测柑橘样品总抗氧化性的分析方法，所述HPLC-FRSD分析系统包括相互连接的高效液相色谱分析仪和自由基反应检测装置，所述高效液相色谱分析仪包括依次连接的进样器、四元梯度泵、色谱分析柱及柱温箱和光电二极管阵列PAD检测器；所述自由基反应检测装置包括自由基反应模件、控温箱、高压泵和紫外可见光检测器，所述自由基反应模件与高效液相色谱仪相连接，所述控温箱控制自由基反应模件温度，高压泵与自由基反应模件连接，自由基反应模件与紫外可见光检测器相连接；所述色谱分析柱用C18反相色谱柱，型号为20×3.9mm，5um；所述的自由基为DPPH自由基或ABTS自由基；所述的在线快速检测柑橘样品总抗氧化性的方法包括如下进行的步骤：

（1）以体积分数为80-90%的甲醇作为溶媒，于40-60℃超声波提取10-50min，再震荡提取1-15h，得提取液；

（2）将步骤（1）所得的提取液离心、分离，得上清液；

（3）配制一系列浓度梯度的维生素C水溶液作为标准物质，进行在线HPLC-FRSD分析，建立负峰面积(Y)和相对应VC浓度(X)的线性方程；

（4）将步骤（2）中所得上清液经0.22微米有机滤膜过滤后进行上样分析，将HPLC-FRSD系统测得的柑橘样品负峰面积带入步骤（3）的线性方程，换算成维生素C当量，以求得柑橘各样品甲醇提取物的抗氧化值。

附图说明

图1在线HPLC-FRSD系统结构示意图。

图2ABTS法和DPPH法测定维生素C，没食子酸，芦丁15分钟内吸光值变化。

图3DPPH和ABTS自由基溶液1周内吸光值变化。

图4DPPH和ABTS自由基溶液200-800nm全波段扫描。

图5HPLC-FRSD在线系统测5种酚类标准物质倒峰色谱图。

图6在线HPLC-FRSD系统5种酚类物质线性度。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

自由基溶液的配置：

DPPH自由基溶液的配置：称取DPPH粉末于500mL甲醇溶液，分别配置浓度为0.1mM，0.2mM和0.5mM的DPPH自由基甲醇溶液。

ABTS自由基反应(ABTS·⁺)溶液的配置：5mLABTS溶液+88μL过磷酸钾水溶液，放置过夜。取1mLABTS·⁺贮备液加入约100mL无水乙醇，稀释该溶液吸光值至0.7±0.02和1.00±0.02(400nm)。

本发明实施例中使用的试验材料、试剂和仪器如下：

（1）标准品和试剂

芦丁(Rutin，纯度99%)、阿魏酸(Ferulicacid，纯度99%)、没食子酸(Gallicacid，纯度99%)、绿原酸(Chlorogenicacid，纯度98%)和维生素C(L-ascorbicacid，纯度99%)均购买于百灵威公司(中国北京)；咖啡酸(Caffeicacid，纯度≥98%)、二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，)、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonicacid，ABTS)，色谱级醋酸(Aceticacid)，色谱级甲酸(Fomicacid)和色谱级甲醇均购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)；超纯水为实验室自制；过硫酸钾以及其它无特别说明的试剂，均为分析纯。其他分析试剂购自于中国天津光复精细化工研究所(中国天津)。

（2）实验主要仪器与设备

Milli-QAdvantageA10超纯水系统双蒸水制备仪(美国马萨诸塞州密理博公司)；电子天平(感量0.1mg，德国赛多利斯集团)；KQ-100B超声波清洗器(中国昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(中国上海一恒科学仪器有限公司)；小型粉碎机(中国北京兴时利和科技发展有限公司)；LDL-5A菲恰尔离心机(中国上海菲恰尔分析仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(美国康涅狄格州铂金埃尔默公司)。

Waterse2695型高效液相色谱分析系统：自动进样器，配有四元梯度泵，WatersXTerraMSC18保护柱(20×3.9mm，5μm)或者SunFire-C₁₈分析柱(4.6mm×250mm，5μm)(Milford，MA，USA)，自动进样器，柱温箱，Waters2998型光电二极管阵列PAD；Waters柱后反应系统：2个柱后衍生泵，柱后反应线圈，衍生反应温度控制器，Waters2489双通道紫外可见光检测器；WatersEmpowerTM2Chromatograph数据分析工作站(美国Waters公司，Milford，MA，USA)。高效液相色谱分析仪和自由基反应检测装置的连接如附图1所示。

实施例1自由基溶液的动力学和稳定性考察

1、标准品贮备溶液的配制

准确称取芦丁、没食子酸、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸25.00mg于25mL棕色容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容至25mL，作为标准品储备液(1.00mgmL^-1)。采用逐级稀释法配置成一系列标准品溶液。

维生素C水标准溶液用色谱级双蒸水配置，且需要现配现用。

2、自由基溶液的配置

DPPH自由基溶液的配置：称取DPPH粉末于500mL甲醇溶液，分别配置浓度为0.1mM，0.2mM和0.5mM的DPPH自由基甲醇溶液。

ABTS自由基反应(ABTS·⁺)溶液的配置：5mLABTS溶液+88μL过磷酸钾水溶液，放置过夜。取1mLABTS·⁺贮备液加入约100mL无水乙醇，稀释该溶液吸光值至0.7±0.02和1.00±0.02(400nm)。

3、自由基溶液的动力学和稳定性考察

(1)研究三种抗氧化物质与DPPH和ABTS自由基溶液在15分钟内动力学的变化。抗氧化剂清除自由基主要基于电子转移(ElectronTransfer，ET)和氢质子转移(HydrogenAtomTransfer，HAT)两种机制。ET与HAT在给定的体系中可以同时发生，但哪种是主反应机制，是由抗氧化剂的结构、性质、分配系数、溶解性、溶剂系统决定。HAT通常反应快速可以在分秒内就能完成；相比较，ET通常反应较慢，完成反应需要较长的时间。ABTS·⁺和DPPH·消除反应中，HAT和ET机制都可同时发生。其中DPPH自由基，与空间位阻较大的抗氧化剂发生反应的时候，反应达到平衡的时间较长。所以试验以前要考虑样品反应达到平衡的的时间。分别取浓度为0.08mgmL^-1维生素C，阿魏酸和芦丁，按照4.1.12DPPH自由基捕获法，4.1.13ABTS自由基捕获法测定三种标准品在15分钟的吸光值变化，分别进行三种物质抗氧化动力学考察。

(2)利用紫外可见分光光度计，研究DPPH自由基溶液和ABTS自由基溶液在一周同一时间内稳定性变化。0.1mMDPPH自由基溶液在517nm下，测定观察DPPH自由基溶液在一周之内同一时间稳定性的变化。选择400nm下吸光值为0.70±0.02的ABTS自由基溶液，在400nm下观察ABTS自由基溶液其在一周之内同一时间稳定性的变化。

利用分光光度计测定自由基溶液吸光值变化。测得自由基吸光值越大，代表清除自由基效果越差。由图2可知，维生素C，没食子酸，芦丁与ABTS自由基在2min内均反应迅速，2min之后反应速率相对缓和。其中芦丁与ABTS自由基反应测得的吸光值最大，维生素C次之，没食子酸最小。维生素C，没食子酸，芦丁与DPPH自由基溶液在2min内反应迅速，2min之后反应速率趋于缓和。测得的DPPH自由基吸光值由大到小的顺序和ABTS法测得的结果一致，结果如表1所示。实验结果表明两种自由基与没食子酸，芦丁两种酚类物质反应迅速灵敏，Waters柱后自由基衍生系统的管路长短，以本章节选定的流速分析样品也大概在2分钟左右完成检测，ABTS自由基和DPPH自由基均适合作为在线系统柱后反应试剂。

表1ABTS法和DPPH法测定维生素C，没食子酸，芦丁15分钟内吸光值变化

DPPH和ABTS自由基溶液一周内稳定性结果显示(见图3和表2所示)，随着时间的延长，DPPH自由基溶液和ABTS自由基溶液的吸光值呈现下降的趋势。两种自由基溶液均在第二天吸光值差值变化幅度最大。随后其吸光值变化幅度相对较缓和。实验结果显示自由基溶液最好现配现用，最长不可以超过24小时。

表2DPPH和ABTS自由基溶液1周内吸光值变化

实施例2高效液相色谱分析色谱条件的选择

1、样品处理

柑橘果实清洗干净后，将柑橘果实分为柑橘果皮，囊衣，种子和果汁四个部分。果汁由三层纱布包裹柑橘囊瓣，手动挤压获得。将柑橘固体部分放置于50°C鼓风干燥箱内干燥2-3天。粉碎柑橘果皮干燥样品，并过60目筛(0.280mm)，室温保存于干燥器内，分析待用。准确称取柑橘干燥粉末样品250mg，种子625mg或2mL柑橘果汁于50mL离心管中，加入80%甲醇至25mL体积，充分混匀，55°C超声提取30min，震荡提取12h。之后将样品以5000g的速度离心10min，取上清液保存于-80度。HPLC-FRSD在线分析柑橘提取液时，需要将上清液经0.22微米有机滤膜过滤到1.5mL棕色进样瓶。

2、HPLC-FRSD在线抗氧化方法条件优化

为了建立在线快速测定柑橘果品总抗氧化性的方法，分别对以下因素进行优化：(1)检测波长：PAD检测波长2D通道分别设置为283nm，245nm，330nm和290nm，并且3D通道分别设置为从200nm到800nm的全波段扫描，来检测酚类物质从HPLC系统的洗脱色谱峰效果。利用紫外分光光度计检测DPPH自由基溶液和ABTS自由基溶液的最大吸收波长。(2)色谱柱的选择：第一种WatersX-TerraMSC18保护柱(3.9mm×20mm，5μm)和SunFire-C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)(Milford，MA，USA)配合使用；第二种只使用WatersX-TerraMSC18保护柱(3.9mm×20mm，5μm)。(3)流动相种类的选择：第一种组合：水/色谱级醋酸(99.9:0.1，v/v)(A)和色谱级甲醇(B)；第二种组合：水/甲酸(99.9:0.1，v/v)(A)和色谱级甲醇(B)。(4)流动相的混合比例的选择：分别设置A相/B相体积比例分别为80/20，60/40，50/50，37/63，20/80和0/100。(5)柱后自由基浓度的选择:分别选择0.05mM，0.10mM和0.20mMDPPH自由基溶液进行实验；比较ABTS自由基反应溶液分别为400nm下0.70±0.02AU和1.00±0.02AU吸光值的ABTS自由基溶液浓度。(6)流速：柱后流速一定的前提下(0.5mLmin^-1)，HPLC系统流动相流速分别设置为0.50，0.85，0.91，1.00mLmin^-1进行实验。在柱前流速一定的前提下(0.91mLmin^-1)，柱后自由基流速分别设置为0.10，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mLmin^-1进行实验。(7)系统温度：整个在线系统分别设置为25°C，30°C和35°C进行实验。(8)柑橘样品提取液进样体积：分别注射5μL，10μL，15μL和25μL的样品甲醇提取液进行比较。

3、结果

HPLC系统检测波长：在200nm-800nm的范围内，对柑橘样品进行全波段扫描。以及283nm，245nm，330nm和290nm下2D通道扫描，发现柑橘样品普遍在283nm，或在245nm具有最大吸收正色谱峰。所以选择283nm和245nm作为检测有无酚类物质洗脱出来的检测波长，即正色谱峰检测波长。

柱后系统自由基检测波长(如图4所示)：结合传统紫外分光光度计对DPPH自由基和ABTS自由基溶液进行200-600nm全波段扫描发现：(1)DPPH自由基溶液其在517nm具有最大吸收峰，所以选择517nm作为在线HPLC-DPPH-FRSD在线系统柱后倒峰检测的检测波长；(2)ABTS自由基溶液在350nm和400-420nm都具有较大吸收峰。

4、最终HPLC-FRSD在线抗氧化检测方法学建立的分析条件

最终HPLC-FRSD方法学建立的条件如下。HPLC分析系统：配有WatersXTerraMSC18保护柱芯(3.9×20mm，5μm)；流动相：A为0.1%(V醋酸:V水=1:999醋酸水溶液，B为甲醇；等度洗脱程序条件：37%A，63%B；流速：0.91mLmin^-1；保护柱柱温：30°C；进样体积25μL；PAD检测波长：2D通道分别设置283nm和245nm。柱后分析系统：DPPH自由基溶液(0.2mM)和ABTS自由基溶液(400nm吸光度为0.70±0.02AU吸光值时的浓度)引入流速均为0.80mLmin^-1。DPPH自由基溶液检测波长517nm；ABTS自由基溶液检测波长为400nm；柱后自由基衍生反应系统温度为30°C。每个样品抗氧化活性分析时间为5min。在线HPLC-FRSD在线抗氧化检测系统结构示意图见图1。

在本发明中：为了缩短酚类物质出峰时间，实现在线快速检测酚类物质的总抗氧化性。本实验移去了C18色谱分析分离柱(SunFire-C18，4.6mm×250mm，5μm)，只使用该系统原来的保护柱(WatersX-TerraMSC18，3.9mm×20mm，5μm)进行分析。结果表明，只使用保护柱大大缩短了酚类物质出峰时间，整个分析可以在5min内完成，且色谱倒峰峰型尖锐对称。

分别配置不同的DPPH自由基浓度(0.05mM，0.10mM和0.20mM)进行在线HPLC-FRSD系统试验，结果显示自由基浓度越大，DPPH自由基溶液倒峰检测效果越佳。本试验选用0.20mMDPPH自由基浓度。比较不同ABTS自由基溶液浓度(0.70±0.02和1.00±0.02吸光值下的浓度，400nm)作为柱后反应自由基浓度，进行HPLC-FRSD系统分析，两者出现倒峰效果均很灵敏。本试验选用400nm下吸光度为0.7±0.02的ABTS自由基溶液作为HPLC-ABTS-FRSD系统的柱后衍生浓度。

实施例3在线HPLC-FRSD方法学考察

1、线性关系考察以及检出限、定量限测定

分别精密吸取芦丁、没食子酸、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸贮备液至5个25mL棕色容量瓶。采用逐渐稀释法，配置一系列不同浓度标准品溶液，按照“HPLC-FRSD在线抗氧化方法条件优化”，最后优化建立的分析条件在线分析，分别进样各标准品溶液25μL。以酚类标准品溶液浓度为横坐标(X)，以负峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并计算回归方程和相关系数。

采用逐渐稀释法将标准品液进行稀释，并设定信噪比(RSN)为3时，测定各标准品的最低检出限(LOD)；设定信噪比(RSN)为10时，测定各酚类物质标准品的最小定量限(LOQ)。

2、线性度、检出限和定量限

本实验利用5种酚类标准物质考察HPLC-FRSD方法的线性关系。由图5可知，芦丁，绿原酸，阿魏酸，没食子酸，咖啡酸五种酚类物质单体所测得的倒峰峰型对称尖锐。由表3和图6可见，芦丁，绿原酸，阿魏酸，没食子酸，5种酚类标准品的质量浓度和相应的倒峰面积呈现很好的线性关系(r≥0.999)。

方法学考察实验结果显示在线HPLC-FRSD在线系统的检出限和定量限的分别在0.001mg﹒mL^-1-0.005mg﹒mL^-1和0.002mg﹒mL^-1-0.010mg﹒mL^-1范围。其中HPLC-ABTS-FRSD方法的检出限和定量限分别为0.001mg﹒mL^-1-0.005mg﹒mL^-1和0.005mg﹒mL^-1-0.010mg﹒mL^-1。在线HPLC-DPPH-FRSD方法的检出限和定量限分别为0.002mg﹒mL^-1-0.010mg﹒mL^-1和0.005mg﹒mL^-1-0.020mg﹒mL^-1(见表3)。

表3HPLC-ABTS/DPPH-FRSD方法学验证参数

注：LOD：最低检出限(n=5)；LOQ：最低定量限(n=5)；RSD：相对标准偏差；回收率(%)=(检测出总量–原始总量)/理论添加量(n=7)

实施例4在线HPLC-FRSD法与非在线自由基法测定柑橘抗氧化值相关性分析

为了分析柑橘样品在线和非在自由基清除法的相关性，同时对35种不同柑橘基因型四个部位的甲醇提取物(不同基质)进行抗氧化性测定(见表3)。然后对在线HPLC-FRSD和非在线DPPH和ABTS法测定柑橘样品抗氧化值进行了皮尔森相关性分析(见表4)。

表4在线和非在线法的皮尔森相关性(r)

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，是利用HPLC-FRSD分析系统检测样品总抗氧化性的分析方法，其特征在于，所述HPLC-FRSD分析系统包括相互连接的高效液相色谱分析仪和自由基反应检测装置，所述高效液相色谱分析仪包括依次连接的进样器、四元梯度泵、色谱分析柱及柱温箱和光电二极管阵列PAD检测器；所述自由基反应检测装置包括自由基反应模件、控温箱、高压泵和紫外可见光检测器，所述自由基反应模件与高效液相色谱仪相连接，所述控温箱控制自由基反应模件温度，高压泵与自由基反应模件连接，自由基反应模件与紫外可见光检测器相连接；所述色谱分析柱用C18反相色谱柱，型号为20×3.9mm，5um；所述的自由基为化学自由基；所述的在线快速检测样品总抗氧化性的方法包括如下进行的步骤：

（1）样品以体积分数为80-90%的甲醇，或者是其它具有相似极性的有机溶剂或所述有机溶剂的混合物作为溶媒，于40-60℃超声波提取10-50min，再震荡提取1-15h，得提取液；

（2）将步骤（1）所得的提取液离心、分离，得上清液；

（3）配制一系列浓度梯度的维生素C水溶液作为标准物质，进行在线HPLC-FRSD分析，建立负峰面积Y和相对应VC浓度X的线性方程；

（4）将步骤（2）中所得上清液经0.22微米有机滤膜过滤后进行上样分析，将HPLC-FRSD系统测得的样品负峰面积带入步骤（3）的线性方程，换算成维生素C当量，以求得各样品甲醇提取物的抗氧化值。

2.根据权利要求1所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，其特征在于，所述样品为植物固体样品时，将植物固体样品干燥粉碎过60-100目筛再进行步骤（1）的操作。

3.根据权利要求1或2所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，其特征在于，所述化学自由基选择DPPH自由基或ABTS自由基。

4.根据权利要求3所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，其特征在于，所述DPPH自由基溶液浓度为0.2mM，DPPH自由基溶液检测波长为517nm。

5.根据权利要求3所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，其特征在于，所述ABTS自由基溶液的浓度为在400nm时吸光度为0.70±0.02AU吸光值的浓度。

6.根据权利要求1或2所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，其特征在于，所述高效液相色谱分析仪使用的流动相为0.1%醋酸水溶液和甲醇的混合液，所述0.1%醋酸水溶液与甲醇的体积比为37：63。

7.根据权利要求1或2所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.91mL﹒min^-1；所述柱温箱设置的柱温为30°C，所述PAD检测器PAD检测波长：2D通道分别设置283nm和245nm。

8.根据权利要求1或2所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，其特征在于，所述自由基的引入流速为0.80mL﹒min^-1，所述控温箱设置的温度为30°C。

9.一种在线快速检测柑橘样品总抗氧化性的方法，是利用HPLC-FRSD分析系统检测柑橘样品总抗氧化性的分析方法，其特征在于，所述HPLC-FRSD分析系统包括相互连接的高效液相色谱分析仪和自由基反应检测装置，所述高效液相色谱分析仪包括依次连接的进样器、四元梯度泵、色谱分析柱及柱温箱和光电二极管阵列PAD检测器；所述自由基反应检测装置包括自由基反应模件、控温箱、高压泵和紫外可见光检测器，所述自由基反应模件与高效液相色谱仪相连接，所述控温箱控制自由基反应模件温度，高压泵与自由基反应模件连接，自由基反应模件与紫外可见光检测器相连接；所述色谱分析柱用C18反相色谱柱，型号为20×3.9mm，5um；所述的自由基为DPPH自由基或ABTS自由基；所述的在线快速检测柑橘样品总抗氧化性的方法包括如下进行的步骤：

（1）样品以体积分数为80-90%的甲醇作为溶媒，于40-60℃超声波提取10-50min，再震荡提取1-15h，得提取液；

（2）将步骤（1）所得的提取液离心、分离，得上清液；

（3）配制一系列浓度梯度的维生素C水溶液作为标准物质，进行在线HPLC-FRSD分析，建立负峰面积Y和相对应VC浓度X的线性方程；

（4）将步骤（2）中所得上清液经0.22微米有机滤膜过滤后进行上样分析，将HPLC-FRSD系统测得的柑橘样品负峰面积带入步骤（3）的线性方程，换算成维生素C当量，以求得柑橘各样品甲醇提取物的抗氧化值。