CN102706980B - 利用hplc测定葡萄和柑橘果实中17种酚类物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用HPLC测定葡萄和柑橘果实中17种酚类物质的方法，首先将柑橘或葡萄的果皮和果肉分开，干燥粉碎后加入DMSO：甲醇（1:1）或甲醇溶液提取，收集上清液后重复提取合并上清液，进行HPLC检测。根据不同品种，不同产地所测的多种酚类物质含量分析，依据不同化合物含量对品种进行识别。本发明采用HPLC同时分离测定17种酚类物质，并达到对不同水果品种如柑橘、葡萄及其酒中17种化合物的组成和含量的测定，此方法样品前处理简单，成本低，可同时测定果实、果汁和果酒中酚类物质组成和含量进行测定。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种利用HPLC测定葡萄和柑橘果实中17种酚类物质的方法。
背景技术
多酚类包括简单酚和生物类黄酮类。简单酚类包括简单酚及其衍生物和简单酚酸类及其衍生物如咖啡酸、绿原酸、没食子酸等。生物类黄酮又可分为两大类化合物，一类是多酚的单体，即非聚合物，包括各种黄酮类化合物及其苷类如芦丁、槲皮素、橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、桔皮素等；另一类则是由单体聚合而成的低聚体或多聚体。水果中的酚类物质对果品的色泽和风味都有很大的影响。动物不能合成类黄酮。黄酮类化合物广泛存在于水果中，并多分布于植物中接受阳光的部分。人体所摄入的类黄酮物质约有10％来自水果，水果是多酚类物质的良好来源。葡萄和红葡萄酒等富含白藜芦醇，且葡萄浆果中的白藜芦醇主要分布在果皮上。草莓、樱桃、葡萄和柑橘等富含水杨酸。葡萄、柿蒂、石榴等含有没食子酸。多酚类物质都有一定量的R·OH基，能形成有抗氧化作用的氢自由基（H·)，以消除O- 2和OH·等自由基的活性，从而保护机体组织免受氧化作用的损害。多酚类物质具有抗氧化、增强免疫功能、抗癌、抗衰老、调节毛细血管、抗菌、消炎、抗病毒、降血压、降血脂、抗血栓等生物学作用。
高效液相色谱法(HPLC)因其检测的有效性和准确性而被广泛应用于农药残留、激素、多酚类物质及有机酸等多个实际测量领域中。通常情况下，利用高效液相色谱法进行样品的侧定时需要经过一系列复杂的提取和纯化程序，且大都是在恒定波长下进行检测。对单组分体系而言，在恒定波长下进行测定是行之有效的。但对多组分体系进行测定时，由于各组分的最大吸收波长不尽相同，加之繁琐的前处理过程会使待测物质有一定的损失，因此利用恒定波长法很难全面检测出多组分体系中各组分的真实含量。为了提高多组分体系检测的灵敏度并客观地反映多组分中被测组分的真实含量，应该尽可能地简化样品的前处理步骤并在各物质的最大吸收波长下进行检测，尤其是对微量、痕量物质。高效液相色谱法测定方法专利：张晋芬的专利（CN200710045638.7）“一种同时测定水果中多种多酚类化合物含量的方法” 中主要对没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸或芦丁等8种酚类物质含量的测定，而且特征在于水果样品是苹果皮、梨皮、香蕉皮、苹果肉或梨肉。房玉林等的专利（CN200710018742.7）“一种用高效液相色谱法测定葡萄组织中单体酚含量的方法”的方法主要对没食子酸，原儿茶酸，3-儿茶素，4-表儿茶素，5-表儿茶素没食子酸醋，6-白藜芦醇等6个酚类物质含量进行测定。前2个专利主要是集中于少数几个酚类物质进行测定，而且主要针对的是葡萄、苹果和利。本发明的主要是旨在对柑橘和葡萄果实中的没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、芥子酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、川陈皮素，桔皮素等17种酚类物质（主要是酚酸和黄酮）进行含量测定，测定范围更广。
多酚物质的化学定性、定量检测及分离技术涉及到色谱分析、光谱分析、电泳分析、化学分析、仪器分析等数种分析方法联合应用，有时也用到沉降反应。现在多采用HPLC方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用HPLC测定葡萄和柑橘果实中17种酚类物质的方法，根据不同品种，不同产地所测的多种酚类物质含量分析，依据不同化合物含量对品种进行识别。本发明采用HPLC同时分离测定17种酚类物质，并达到对不同品种柑橘识别的目的，此方法样品前处理简单，成本低，可同时测定，实现对不同品种柑橘和葡萄的识别，混合果汁中原料的识别。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用HPLC测定葡萄中17种酚类物质的方法包括以下步骤：
（1）标准品：没食子酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、苯甲酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、白藜芦醇、川陈皮素、桔皮素购自sigma公司；
（2）样品前处理
称取2-3g冻干果实样品，加入质量分数为50%的乙醇研磨，用乙酸乙酯萃取2次，收集萃取液，减压浓缩至干，加入2ml甲醇与DMSO的体积比为1:1的混合溶液溶解；
（3）色谱条件
色谱柱Merck LiChrospher_100RP18e，250mm×4.0mm；检测波长：0-60min:230nm； 60-100min：280nm；柱温：30℃；梯度洗脱：流动相A为水﹕乙酸=98﹕2；流动相B为乙腈；洗脱程序：0min→100min，乙腈：16%→70%，2%醋酸水混合液：84%→30%；流速：0.8ml/min。
一种利用HPLC测定柑橘果实中17种酚类物质的方法包括以下步骤：
（1）标准品：没食子酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、苯甲酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、白藜芦醇、川陈皮素、桔皮素购自sigma公司；
（2）样品前处理
先将样品果肉与果皮分离冷冻干燥过60目备用；称取0.1g样品用1mL甲醇与DMSO的体积比为1:1的混合溶液于室温浸泡10min；9000rpm，4℃离心15min，重复3次，合并上清液于容量瓶中，用甲醇定容；用0.45μm微孔滤膜过滤备用；
（3）色谱条件
色谱柱Merck LiChrospher_100RP18e，250mm×4.0mm；检测波长：0-60min:230nm； 60-100min：280nm；柱温：30℃；梯度洗脱：流动相A为水﹕乙酸=98﹕2；流动相B为乙腈。洗脱程序：0min→100min，乙腈：16%→70%，2%醋酸水混合液：84%→30%；流速：0.8ml/min。
本发明的显著优点在于：根据不同品种，不同产地所测的多种酚类物质含量分析，依据不同化合物含量对品种进行识别。本发明利用HPLC测定葡萄和柑橘果实中17种酚类物质，并达到对不同品种柑橘识别的目的，此方法样品前处理简单，成本低，可同时测定，实现对不同品种柑橘和葡萄的识别，混合果汁中原料的识别。
附图说明
图1是标准品HPLC图谱；其中1-没食子酸，2-儿茶素，3-绿原酸，4-咖啡酸，5-丁香酸，6-表儿茶素，7-香豆酸，8-阿魏酸，9-苯甲酸，10-水杨酸，11-芦丁，12-柚皮苷，13-橙皮苷，14白藜芦醇，15-槲皮素，16-川陈皮素，17-桔皮素。
图2是标准品等高线图。
具体实施方式
实施例1 葡萄酚类物质测定
1标样：没食子酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、苯甲酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、白藜芦醇、川陈皮素、桔皮素购自sigma公司。
2样品前处理
2～3g冻干果实样品（酒）→50%乙醇研磨→乙酸乙酯萃取2次→收集萃取液→减压浓缩至干→2ml溶剂溶解（甲醇﹕DMSO=1﹕1）。
3色谱条件
色谱柱Merck LiChrospher_100RP18e (250mm×4.0mm)；检测波长：0-20min:230nm；20-35min:280nm；35-42min:309nm；42-60min：320nm；柱温：30℃；梯度洗脱：流动相A为水﹕乙酸=98﹕2；流动相B为乙腈。洗脱程序：0min→100min，乙腈：16%→70%，2%醋酸水混合液：84%→30%；流速：0.8ml/min。
表1 葡萄果实中酚类物质的含量（μg/g）
实施例2 柑橘果皮果肉
1标样：没食子酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、苯甲酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、白藜芦醇、川陈皮素、桔皮素购自sigma公司。
2 样品前处理
先将样品果肉与果皮分离冷冻干燥过60目备用；0.1g样品用1mL甲醇-DMSO(V/V.50:50)混合10min室温，9000rpm，15min 4℃离心，重复3次，合并上清液于容量瓶中，用甲醇定容；用0.45μm微孔滤膜过滤备用。
3色谱条件
色谱柱Merck LiChrospher_100RP18e (250mm×4.0mm)；检测波长：0-20min:230nm；20-35min:280nm；35-42min:309nm；42-60min：280nm；柱温：30℃；梯度洗脱：流动相A为水﹕乙酸=98﹕2；流动相B为乙腈。洗脱程序：0min→100min，乙腈：16%→70%，2%醋酸水混合液：84%→30%；流速：0.8ml/min。
表2 芦柑果实中酚类物质的含量（μg/g）
实施例3葡萄酒样中酚类物质的提取
1标样：没食子酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、苯甲酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、白藜芦醇、川陈皮素、桔皮素购自sigma公司。
2样品前处理
取样测定葡萄酒中的单体酚，提取方法与葡萄果实相似，其工艺路线：葡萄酒（10 ml）→50%乙醇提取2次（5 倍料液比、70℃提取 60 min）→减压浓缩→三氯甲烷萃取2次→
乙酸乙酯萃取 2 次→减压浓缩→提取物→甲醇溶解，定容至 10 ml→4℃保存，备用，3 次重复。
3色谱条件
色谱柱Merck LiChrospher_100RP18e (250mm×4.0mm)；检测波长：0-20min:230nm；20-35min:280nm；35-42min:309nm；42-60min：320nm；柱温：30℃；梯度洗脱：流动相A为水﹕乙酸=98﹕2；流动相B为乙腈。洗脱程序：0min→100min，乙腈：16%→70%，2%醋酸水混合液：84%→30%；流速：0.8ml/min。
表3葡萄酒中17种酚类物质的含量
表4 17种多酚化合物的回归方程、相关系数 、线性范围、方法的检出限和回收率
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种利用HPLC测定葡萄果实中17种酚类物质的方法，其特征在于：葡萄酚类的测定方法包括以下步骤：
（1）标准品：没食子酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、苯甲酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、白藜芦醇、川陈皮素、桔皮素购自sigma公司；
（2）样品前处理
称取2-3g冻干果实样品，加入质量分数为50%的乙醇研磨，用乙酸乙酯萃取2次，收集萃取液，减压浓缩至干，加入2ml甲醇与DMSO的体积比为1:1的混合溶液溶解；
（3）色谱条件
色谱柱Merck LiChrospher_100RP18e，250mm×4.0mm；检测波长：0-20min:230nm；20-35min:280nm；35-42min:309nm；42-60min：320nm；柱温：30℃；梯度洗脱：流动相A为水﹕乙酸=98﹕2；流动相B为乙腈；洗脱程序：0min→100min，乙腈：16%→70%，2%醋酸水混合液：84%→30%；流速：0.8ml/min。
2.一种利用HPLC测定柑橘果实中17种酚类物质的方法，其特征在于：柑橘果皮果肉的测定方法包括以下步骤：
（1）标准品：没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、川陈皮素，桔皮素，儿茶素，表儿茶素、苯甲酸、白藜芦醇购自sigma公司；
（2）样品前处理
先将样品果肉与果皮分离冷冻干燥过60目备用；称取0.1g样品用1mL甲醇与DMSO的体积比为1:1的混合溶液于室温浸泡10min；9000rpm，4℃离心15min，重复3次，合并上清液于容量瓶中，用甲醇定容；用0.45μm微孔滤膜过滤备用；
（3）色谱条件
色谱柱Merck LiChrospher_100RP18e，250mm×4.0mm；检测波长：0-20min:230nm；20-35min:280nm；35-42min:309nm；42-60min：280nm；柱温：30℃；梯度洗脱：流动相A为水﹕乙酸=98﹕2；流动相B为乙腈；洗脱程序：0min→100min，乙腈：16%→70%，2%醋酸水混合液：84%→30%；流速：0.8ml/min。
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