CN109991328B - 一种鼠曲草一测多评的质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一测多评法评价鼠曲草质量控制方法，首先建立鼠曲草中4种主要药效成分的HPLC含量测定方法，以绿原酸作为内参物，计算其他3种活性成分的相对校正因子，并考察相对校正因子的系统适用性和方法重现性，根据相对保留时间进行色请峰定位，再结合相对校正因子算各待测成分的含量，通过一测多评法与外标法的相互验证，证明含量测定结果无显著差异。本发明方法克服了对照品成本高、不易得等难题，通过相对校正因子及色谱峰定位计算指标成分含量，实现鼠曲草中多种药效物质的同步测定，可节省成本、简化操作，提高效率，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，对鼠曲草质量控制和临床疗效的保证具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于中药成分检测技术领域，涉及一种鼠曲草一测多评的质量评价方法。
背景技术
鼠曲草(Gnaphlium affine D.Don)又名：鼠耳草、佛耳草、追风骨、清明菜、秋菊草等，属菊科植物鼠曲草全草，药食两用，全草可入药，性味甘平、无毒，具有祛痰、止咳、平喘、祛风湿之功效；尤其润肺化痰效果，可替代川贝母入药，其药材标准收载于《中国药典》(1977)版，《江苏省中药材标准》(1989)版。研究表明，鼠曲草含有多种生物活性成分，具有丰富的营养价值，鼠曲草中含大量类黄酮、二萜类、矿物质和氨基酸，此外，还含少量的植物甾醇、鞣酸、多糖等，故其药理作用广泛、营养价值极高。鼠曲草的主要生物活性是黄酮类，而黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保护心脑血管系统和抗病毒等广泛的生理活性。中药的多成分、多功效的作用特点，决定着单一成分难以表达中药的内在质量，因此，应选择多成分、多指标的测定，对与功效相关的化学成分进行全面综合的评价。但多指标质量控制面临着对照品短缺及相应的检测成本费用高等问题，为解决这一问题，王智民提出了一种新的评价中药内在质量模式，即一测多评法(quantitative analysisof multi-components bysingle marker，QAMS)。QAMS以样品中某一成分为内参物，建立该成分与其他成分间的相对校正因子，通过相对校正因子计算其他成分量。该方法具有快速、简便并能同时实现多成分同步测定等优点，已被《中国药典》2010年版收录。因此本实验采用QAMS技术，以绿原酸为内参物，计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素的相对校正因子，建立鼠曲草药材的QAMS方法，为鼠曲草质量控制提供新的评价模式。同时验证了一测多评法的计算值和外标法测定值间无显著差异，实验所得的校正因子可信。
一测多评法(quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS)指利用中药有效成分内在的函数关系和比例关系，只测定其中的一个成分(对照品易于得到)，来实现多个成分(对照品难以得到或供应)的同步测定，是适合中药特点的多指标质量评价模式。在对照品不足的情况下，利用相对校正因子(relative correctionfactor，RCF)对药材进行质量控制是方便、快速、廉价的，其方法将会是中药多组分同步定量的发展方向。目前，用一测多评法评价中药材质量的相关文献较少，而用一测多评法同时测定鼠曲草中多种不同类型成分的含量的未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠曲草一测多评的质量评价方法，解决了鼠曲草在含量测定时标准品品种多，含量测定方法复杂的问题。
本发明所采用的技术方案是，一种鼠曲草一测多评的质量评价方法，具体步骤如下：
步骤1，标准溶液的制备：制备绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷为和异泽兰黄素四种标准溶液；
步骤2，供试溶液的制备：取鼠曲草药材粉碎过筛，置于容量瓶中，加入溶剂定容，定容后冷浸、超声或者回流提取，取上清液用微孔滤膜滤过，得到供试溶液；
步骤3，取经步骤1中制备的四种标准溶液分别稀释后与步骤2中制备的供试品溶液一起注入高效液相色谱仪，进行色谱条件检测分析，得到高效液相色谱图；
步骤4，目标化合物的含量以及校正因子的计算：将经步骤3得到的高效液相色谱图进行测定，得出目标化合物的含量，然后利用绿原酸为内参物分别计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素的相对校正因子；
步骤5，分析经步骤4计算得到的目标化合物的含量和相对校正因子。
本发明的特点还在于：
其中步骤1具体为：按质量浓度配置绿原酸为0.052mg/ml～0.053mg/ml、咖啡酸0.106mg/ml～0.107mg/ml、异毛蕊花糖苷为0.053mg/ml～0.054mg/ml、异泽兰黄素为0.050mg/ml～0.051mg/ml；
其中步骤2中过筛为40～50目筛；
其中步骤2中溶剂与鼠曲草过筛粉末的质量比为10～5:1；
其中溶剂为甲醇溶液或乙醇溶液；
其中步骤2中冷浸、回流或超声时间为1h～10h，微孔滤膜为0.22μm～0.45μm；
其中步骤3中色谱条件为，Agilent HC-C18：4.6×250nm，5μm；检测波长：290nm～360nm；柱温：25℃～35℃；流动相：乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱过程如下：0～8min，6％～15％A；8～30min，15％～20％A；30～33min，20％～30％A；33～60min，30％～40％A；
其中步骤4具体包括：
利用步骤3中得到高效液相色谱图，根据高效液相色谱图中的峰值测定目标化合物的含量，并以绿原酸为内参物，根据式(1)计算相对校正因子：
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子，取平均值作为定量用fs/k；
其中步骤5具体包括：结合鼠曲草供试溶液液相色谱图和咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的相对校正因子，通过相关系数法和t检验法分别比较一测多评法的计算值和外标法的实测值。
本发明的有益效果是：
本发明一种鼠曲草一测多评的质量评价方法以绿原酸作为内参物，计算鼠曲草中咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的相对校正因子，并用校正因子计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的含量(计算法)，不仅大幅度降低检测成本和检测时间，并且简化了鼠曲草的定量检测方法，简化方法，提高效率，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，对鼠曲草的质量控制和临床疗效的保证具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的一测多评法评价鼠曲草质量的方法测试过程中混合对照品高效液相色谱图；
图2是本发明的一测多评法评价鼠曲草质量的方法测试过程中鼠曲草样品高效液相色谱图。
图中，1.绿原酸，2.咖啡酸，3.异毛蕊花糖苷，4.异泽兰黄素。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
步骤1，对照品标准溶液制备：
分别取绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素，用甲醇溶解后置于容量瓶、定容，即得绿原酸浓度为0.052mg/ml、咖啡酸浓度为0.106mg/ml、异毛蕊花糖苷浓度为0.053mg/ml、异泽兰黄素浓度为0.050mg/ml的标准品溶液；
步骤2，供试品溶液制备
将鼠曲草粉碎，过筛40目筛，精密称取鼠曲草过筛粉末，加入乙醇溶液或甲醇溶液定容后，冷浸、回流或超声时间为1h-10h，抽滤后过0.22-0.45μm的微孔滤膜，备用；
其中，供试品为鼠曲草药材、炮制品、提取物或相关制剂；
步骤3，高效液相色谱测定
取步骤1中制备的对照品标准溶液分别稀释后与步骤2中制备的供试品溶液一起注入高效液相色谱仪，得到高效液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent HC-C18(4.6×250nm,5μm)；检测波长：290-360nm；柱温：25℃～35℃；流动相：乙腈为流动相A，0.01-0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱过程如下：0～8min，6％～15％A；8～30min，15％～20％A；30～33min，20％～30％A；33～60min，30％～40％A；
步骤4，目标化合物的含量计算
利用步骤3中得到高效液相色谱图，并以绿原酸为内参物，根据相对校正因子计算公式
分别计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的相对校正因子；结合鼠曲草供试品溶液液相色谱图和咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的相对校正因子，计算各目标化合物的含量；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子，取平均值作为定量用。
供试品溶液的制备：将鼠曲草粉碎，过筛40目筛，精密称取鼠曲草过筛粉末，加入甲醇溶液定容后，冷浸为1h-10h，抽滤后过0.22-0.45μm的微孔滤膜，备用；
取步骤2制备的样品溶液，精密吸取各供试品溶液10uL，按步骤3的HPLC色谱条件检测分析，获得液相色谱图，根据相对保留时间进行峰定位，并结合相对校正因子计算各目标化合物的含量。与外标法计算结果进行比较分析，并计算各目标化合物的含量。本发明以绿原酸作为内参物，计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素相对校正因子，并在两台不同的色谱仪和三根不同型号的色谱柱上考察相对校正因子的重现性。
步骤5，通过相关系数法和t检验法分别比较一测多评法的计算值和外标法的实测值，评价本发明的方法所测结果的是否可靠。
本发明的分析方法扩展为鼠曲草药材、饮片、提取物及相关制剂。
实施例1
步骤1，标准品溶液的制备：分别取绿原酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素对照品5mg，咖啡酸对照品10mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成质量浓度为绿原酸0.52㎎/ml、咖啡酸1.06mg/ml、异毛蕊花糖苷0.53mg/ml和异泽兰黄素0.50mg/ml。分别精密量取1ml上述对照品溶液置于10ml容量瓶，加甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为绿原酸0.052mg/ml、咖啡酸0.106mg/ml、异毛蕊花糖苷0.053mg/ml和异泽兰黄素0.050mg/ml的混合对照品溶液；
步骤2，供试品溶液的制备：精密称定鼠曲草药材粉末0.1g，置25mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，冷浸10h后过滤，取上清液过0.45μm滤膜，即得。
步骤3，HPLC色谱条件Shimadzu LC-2010AHT-C18，检测波长360nm，柱温25℃，体积流量1mL/min，进样量10μL。流动相为乙腈(A)-0.2％磷酸水(B)，梯度洗脱顺序：0～8min，6％～15％A；8～30min，15％～20％A；30～33min，20％～30％A；33～60min，30％～40％A。
步骤4，相对校正因子的计算：在步骤三HPLC色谱分析条件下，精密吸取对照品溶液10μL，测定各成分的峰面积。以绿原酸为内参物，根据相对校正因子计算公式
(Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积)分别计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的相对校正因子，结果见表1：
表1绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素的相对校正因子
步骤5，含量测定方法学考察：取混合对照品溶液，精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl分别进样，以进样量对峰面积积分值进行线性回归处理，得到绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的标准曲线，结果见表2。
表2绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素的标准曲线
精密吸取同一供鼠曲草试品溶液10μL分别于配制后的0、2、8、12、24、36h进行测定，记录峰面积，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的RSD分别为1.56％、0.76％、1.48％和0.79％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。取同一批鼠曲草药材粉末6份，进行测定，结果绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的RSD分别为2.49％、2.94％、3.77％、4.01％，表明该方法的重复性良好。取上述步骤一中的对照品溶液，重复进样6次，记录各成分的峰面积，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的峰面积的RSD分别为0.25％、0.24％、0.22％、0.45％，均小于1.0％，表明该仪器的精密度良好。取同一批已测定含量的鼠曲草药材粉末6份，精密称定，分别精密加入一定量的绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素对照品溶液，测定其含量，分别计算其回收率，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的平均加样回收率分别为100.85％、102.44％、95.93％、101.21％，RSD分别为1.94％、2.54％、2.84％、1.98％，均小于3％，表明该方法的准确度良好。
校正因子重现性考察
色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取对照品溶液10μL，分别考察ShimadzuLC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同的不同品牌的额高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好(结果见表3和表4)。
表3不同色谱柱对相对校正因子的影响
表4不同高效液相色谱的相对校正因子
色谱峰专属性考察：精密吸取混合对照品溶液10μL，测定的内参物绿原酸的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220 LC两台两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的准确峰位置，相对保留时间测定结果见表5：
表5不同仪器和色谱柱测得的相对保留时间
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为鼠曲草目标色谱峰定位的方法是可行的。因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
一测多评法与外标法测定结果比较：分别取不同产地鼠曲草及浸膏制备供试品溶液，分别采用一测多评法和外标法计算不同产地鼠曲草中绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的含量，结果见表6。
表6鼠曲草药材中绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素的测定
实施例2
步骤1，标准品溶液的制备：分别取绿原酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素对照品5mg，咖啡酸对照品10mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成质量浓度为绿原酸0.52㎎/ml、咖啡酸1.06mg/ml、异毛蕊花糖苷0.53mg/ml和异泽兰黄素0.50mg/ml。分别精密量取1ml上述对照品溶液置于10ml容量瓶，加甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为绿原酸0.052mg/ml、咖啡酸0.106mg/ml、异毛蕊花糖苷0.053mg/ml和异泽兰黄素0.050mg/ml的混合对照品溶液。
步骤2，供试品溶液的制备：精密称定鼠曲草药材粉末0.1g，加50mL甲醇，回流提取1h，趁热过滤后蒸干，残渣加入甲醇溶解并定容到25ml，取上清液过0.22μm滤膜，即得。
步骤3，HPLC色谱条件Shimadzu LC-2010AHT-C18，检测波长290nm，柱温35℃，体积流量1mL/min，进样量10μL。流动相为乙腈(A)-0.01％磷酸水(B)，梯度洗脱顺序：0～8min，6％～15％A；8～30min，15％～20％A；30～33min，20％～30％A；33～60min，30％～40％A。
步骤4，相对校正因子的计算：在步骤三HPLC色谱分析条件下，精密吸取对照品溶液10μL，测定各成分的峰面积。以绿原酸为内参物，根据相对校正因子计算公式
(Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积)分别计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的相对校正因子，结果见表1。
步骤5，含量测定方法学考察：取混合对照品溶液，精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl分别进样，以进样量对峰面积积分值进行线性回归处理，得到绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的标准曲线，结果见表2。
精密吸取同一供鼠曲草试品溶液10μL分别于配制后的0、2、8、12、24、36h进行测定，记录峰面积，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的RSD分别为1.56％、0.76％、1.48％和0.79％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。取同一批鼠曲草药材粉末6份，进行测定，结果绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的RSD分别为2.49％、2.94％、3.77％、4.01％，表明该方法的重复性良好。取上述步骤一中的对照品溶液，重复进样6次，记录各成分的峰面积，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的峰面积的RSD分别为0.25％、0.24％、0.22％、0.45％，均小于1.0％，表明该仪器的精密度良好。取同一批已测定含量的鼠曲草药材粉末6份，精密称定，分别精密加入一定量的绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素对照品溶液，测定其含量，分别计算其回收率，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的平均加样回收率分别为100.85％、102.44％、95.93％、101.21％，RSD分别为1.94％、2.54％、2.84％、1.98％，均小于3％，表明该方法的准确度良好。
校正因子重现性考察
色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取对照品溶液20μL，分别考察ShimadzuLC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同的不同品牌的额高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好(结果见表3和表4)。
色谱峰专属性考察：精密吸取混合对照品溶液10μL，测定的内参物绿原酸的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220LC两台两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的准确峰位置，相对保留时间测定结果见表5。
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为鼠曲草目标色谱峰定位的方法是可行的。因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
一测多评法与外标法测定结果比较：分别取不同产地鼠曲草及浸膏制备供试品溶液，分别采用一测多评法和外标法计算不同产地鼠曲草中绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的含量，结果见表6。
实施例3
步骤1，标准品溶液的制备：分别取绿原酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素对照品5mg，咖啡酸对照品10mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成质量浓度为绿原酸0.53mg/ml、咖啡酸1.07mg/ml、异毛蕊花糖苷0.54mg/ml和异泽兰黄素0.51mg/ml。分别精密量取1ml上述对照品溶液置于10ml容量瓶，加甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为绿原酸0.053mg/ml、咖啡酸0.107mg/ml、异毛蕊花糖苷0.054mg/ml和异泽兰黄素0.051mg/ml的混合对照品溶液。
步骤2，供试品溶液的制备：精密称定鼠曲草药材粉末0.1g，置25mL容量瓶中，加入20ml甲醇，超声30min后，加甲醇定容至刻度，取上清液过0.45μm滤膜，即得。
步骤3，HPLC色谱条件Shimadzu LC-2010AHT-C18，检测波长320nm，柱温30℃，体积流量1mL/min，进样量20μL。流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)，梯度洗脱顺序：0～8min，6％～15％A；8～30min，15％～20％A；30～33min，20％～30％A；33～60min，30％～40％A。
步骤4，相对校正因子的计算：在步骤三HPLC色谱分析条件下，精密吸取对照品溶液10μL，测定各成分的峰面积。以绿原酸为内参物，根据相对校正因子计算公式
(Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积)分别计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的相对校正因子，结果见表1。
步骤5，含量测定方法学考察：取混合对照品溶液，精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl分别进样，以进样量对峰面积积分值进行线性回归处理，得到绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的标准曲线，结果见表2。
精密吸取同一供鼠曲草试品溶液10μL分别于配制后的0、2、8、12、24、36h进行测定，记录峰面积，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的RSD分别为1.56％、0.76％、1.48％和0.79％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。取同一批鼠曲草药材粉末6份，进行测定，结果绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的RSD分别为2.49％、2.94％、3.77％、4.01％，表明该方法的重复性良好。取上述步骤一中的对照品溶液，重复进样6次，记录各成分的峰面积，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的峰面积的RSD分别为0.25％、0.24％、0.22％、0.45％，均小于1.0％，表明该仪器的精密度良好。取同一批已测定含量的鼠曲草药材粉末6份，精密称定，分别精密加入一定量的绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素对照品溶液，测定其含量，分别计算其回收率，绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的平均加样回收率分别为100.85％、102.44％、95.93％、101.21％，RSD分别为1.94％、2.54％、2.84％、1.98％，均小于3％，表明该方法的准确度良好。
校正因子重现性考察
色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取对照品溶液20μL，分别考察ShimadzuLC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同的不同品牌的额高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好(结果见表3和表4)。
色谱峰专属性考察：精密吸取混合对照品溶液10μL，测定的内参物绿原酸的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220 LC两台两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的准确峰位置，相对保留时间测定结果见表5。
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为鼠曲草目标色谱峰定位的方法是可行的。因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
一测多评法与外标法测定结果比较：分别取不同产地鼠曲草及浸膏制备供试品溶液，分别采用一测多评法和外标法计算不同产地鼠曲草中绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的含量，结果见表6。
本发明基于HPLC技术，结合一测多评法，同时测定了鼠曲草中的绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素这三种成分的含量，并比较了外标法和一测多评法所得含量测定结果相互验证，发现两种方法得出结果并无显著性差异。表明该方法准确、可靠，适用于鼠曲草药材中多成分的含量测定本发明有利于鼠曲草药材及相关制剂的全面质量控制，且本方法检测灵敏度高，稳定性好，操作简便，易于掌握，便于进一步推广。
还应当说明的是，上述实施例中仅代表本发明的较优方案，说明较为详细具体，但并非对本发明保护范围的限制。还应指出，在本发明的内容及思路基础上，对本发明技术方案做出的修改、同等替换和改进的，均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种鼠曲草一测多评的质量评价方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，标准溶液的制备：制备绿原酸、咖啡酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素四种标准溶液；按质量浓度配制绿原酸为0.052mg/ml～0.053mg/ml、咖啡酸0.106mg/ml～0.107mg/ml、异毛蕊花糖苷为0.053mg/ml～0.054mg/ml、异泽兰黄素为0.050mg/ml～0.051mg/ml；
步骤2，供试溶液的制备：取鼠曲草药材粉碎过筛，置于容量瓶中，加入溶剂定容，定容后冷浸、超声或者回流提取，取上清液用微孔滤膜滤过，得到供试溶液；
步骤3，取经步骤1中制备的四种标准溶液分别稀释后与步骤2中制备的供试品溶液一起注入高效液相色谱仪，进行色谱条件检测分析，得到高效液相色谱图；色谱条件为，Agilent HC-C18：4.6×250nm，5μm；检测波长：290nm～360nm；柱温：25℃～35℃；流动相：乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱过程如下：0～8min，6％～15％A；8～30min，15％～20％A；30～33min，20％～30％A；33～60min，30％～40％A；
步骤4，目标化合物的含量以及校正因子的计算：将经步骤3得到的高效液相色谱图进行测定，得出目标化合物的含量，然后利用绿原酸为内参物分别计算咖啡酸、异毛蕊花糖苷和异泽兰黄素的相对校正因子；
步骤5，分析经步骤4计算得到的目标化合物的含量和相对校正因子。
2.根据权利要求1所述的一种鼠曲草一测多评的质量评价方法，其特征在于，所述步骤2中鼠曲草过筛粉末为40-50目，溶剂与鼠曲草过筛粉末的质量比为10～5:1。
3.根据权利要求1所述的一种鼠曲草一测多评的质量评价方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇溶液或乙醇溶液；冷浸、回流或超声时间为1h～10h，微孔滤膜0.22-0.45μm过滤。
4.根据权利要求1所述的一种鼠曲草一测多评的质量评价方法，其特征在于，所述步骤4具体包括：
利用步骤3中得到高效液相色谱图，根据高效液相色谱图中的峰值测定目标化合物的含量，并以绿原酸为内参物，根据式(1)计算相对校正因子：
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子，取平均值作为定量用fs/k。
5.根据权利要求1所述的一种鼠曲草一测多评的质量评价方法，其特征在于，所述步骤5具体包括：结合鼠曲草供试溶液液相色谱图和咖啡酸、异毛蕊花糖苷、异泽兰黄素的相对校正因子，通过相关系数法和t检验法分别比较一测多评法的计算值和外标法的实测值。
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