CN112578066B - 一种紫菀样品的质量评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫菀样品的质量评价方法，所述方法包括供试品制备、参照物或对照品的制备、采用超高效液相色谱仪进行检测和分析步骤，本发明采用一测多评分析和特征图谱结合分析，兼顾定量和整体定性分析，具有准确、快速、高效、普适性好、成本低等优点，尤其适用于紫菀配方颗粒及其上游原料的质量控制。

Description

一种紫菀样品的质量评价方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及紫菀样品的质量评价方法。

背景技术

紫菀为菊科植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根和根茎，为常用中药，始载于《神农本草经》，列为中品，具有润肺下气、止咳祛痰之功效，主治支气管、咳嗽、肺结核和咯血等症，民间一般用作治疗毒蛇咬伤和呼吸系统感染等。紫菀属所含化学成分较丰富，如萜类及其苷、黄酮、酚酸类、苔类以及多糖类成分。紫菀中具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗组胺活性物质主要为酚酸类成分，祛痰的活性成分包括紫菀酮和酚酸类成分。

据公开的专利可知，目前对于紫菀的研究包括紫菀及其相关成分、产品制备工艺，如CN108338248A；紫菀中紫菀酮、紫菀素、紫菀总黄酮、紫菀苷C的提取和制备方法，如CN102219823A、CN102702328A、CN103340915A、CN103073602A等；还包括关于具有治疗便秘或止痛或高血压或糖尿病的紫菀或其提取物、组合物和相关产品发明，如 CN101146458A、CN101678061A。

由于受地理因素和生长环境的影响，不同产区紫菀的化学成分不尽相同。对于紫菀质量标准研究，主要集中于黄酮类成分、三萜皂苷类成分及少量酚酸类测定，测定多以槲皮素、紫菀酮、阿魏酸为主要指标性成分，单一定量指标研究较多，四成分以上指标同时测定的文献较少。比如：曲艳丽等建立山紫菀药材的质量标准，采用薄层色谱法(TLC) 对药材样品进行定性鉴别，测定药材样品水分、灰分、浸出物的含量，采用高效液相色谱法测定药材样品中阿魏酸的含量作为评价体系(曲艳丽等.山紫菀药材的质量标准研究 [J].中国药房,2018(8):1057-1060)。李兰茹等以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法，以亚硝酸钠-硝酸铝显色，在510nm处测定藏紫菀提取物中总黄酮的含量，采用高效液相色谱法同时测定藏紫菀提取物中槲皮素、木犀草素的含量(李兰茹,马慧萍.藏紫菀总黄酮及其两种黄酮成分的含量测定[J].中医药导报,2016(23):64-67)。分析亳州道地药材紫菀花中槲皮素含量，任莉测定了亳州道地药材紫菀花中槲皮素含量(任莉.HPLC法测定亳州道地药材紫菀花中槲皮素含量研究[J].四川中医,2016(5):124-126)。黄珊珊等以紫菀酮为对照品,以5％香草醛-冰乙酸溶液、高氯酸为显色系统,采用紫外分光光度法在550nm波长处测定紫菀药材中有效成分总三萜的含量(黄珊珊等.分光光度法测定紫菀中总三萜类成分的含量[J].时珍国医国药,2008,19(6):1406-1407)。由此可见，目前的紫菀质量评价体系研究中，定量指标成分选择单一、专属性较差，而紫菀化学成分复杂，采用单一含量指标控制药材质量，整体质量控制比较薄弱，难以全面反映中药的内在质量。

另外，中药配方颗粒近几年来对传统中药饮片应用形式的突破，由于传统饮片品种繁多、产地不一，较难统一规范，紫菀配方颗粒是以紫菀饮片为原料，经过规范提取(一般以水提为主)、浓缩、干燥和制粒而成，其性味、归经、功效与原饮片保持基本一致，又具有无需煎煮，易于调剂、贮存和服用方便等优点，逐步得到广泛的应用。配方颗粒主要采用水为溶媒，对水溶性不好的紫菀酮或者槲皮素、木犀草素等黄酮类溶出较少，以上指标不适合作为紫菀配方颗粒及其上游原料的定量指标。现阶段由于缺少有效的质量标准和质量控制体系，导致市场上同一配方颗粒的质量不一，监管难度加大。万昶宸等用HPLC-MS/MS法同时测定紫菀中山柰酚、槲皮素、木犀草素、异鼠李素、东莨菪内酯、伞形花内酯、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸9种化学成分的方法(万昶宸等.HPLC-MS/MS 法同时测定紫菀中9种化学成分[J].中草药，2016(14):2534-2539)。该方法兼顾了多种水溶性成分的定性和定量，但作为质量评价体系，HPLC-MS/MS价格昂贵，对操作人员素质要求更高，目前国内药厂和饮片厂无法广泛适用，因此作为研究尚可，作为标准的评价方法适用性欠佳。夏成凯等以槲皮素为内参物，建立槲皮素与橙皮苷、山柰酚、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，计算其他4种成分的含量，实现紫菀中5种黄酮类成分的含量一测多评(夏成凯等.一测多评法测定紫菀中5种黄酮类成分含量[J].中药材,2015, 38(1))，该方法节省了对照品的使用，降低了成本，但对紫菀的整体定性没有体现，指标选择水溶性欠佳，不适合紫菀配方颗粒及其上游原料的质量评价。张开雪等采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行指纹图谱分析，相似度均大于0.899，确定12个共有峰，指认其中3个并对其进行简易定量分析，探讨适合标准汤剂定量的指标成分，选择槲皮素等作为其定量指标成分(张开雪等.蜜紫菀饮片标准汤剂制备及质量评价方法研究[J].中药材,2018(4))。该研究确认了12个共有峰，整体定性具有参考意义，但定量指标最终只选择了槲皮素，指标选择欠佳，方法不够全面。另外，以上多采用HPLC，特征指纹图谱分析周期整体较长。

因此，有必要找到一种科学合理的评价紫菀配方颗粒及其上游原料的质量的方法，其兼顾多种水溶性有效成分的定量和特征图谱整体定性，同时还能满足快速、简便、成本低且具有普适性的要求。

发明内容

发明要解决的问题

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种紫菀样品的质量评价方法，该方法兼顾定量和定性分析，具有准确、快速、高效、普适性好、成本低等优点，尤其适用于紫菀配方颗粒及其上游原料的质量控制。

用于解决问题的方案

在一个技术方案中，本发明提供了一种紫菀样品的质量评价方法，该方法包括供试品制备、参照物或对照品的制备、采用超高效液相色谱仪进行检测和分析步骤，

其中，所述分析步骤包括：

1)一测多评分析：以绿原酸为内参物，同时测定紫菀样品中五种酚酸类成分；

2)特征图谱分析：判断供试品色谱中是否存在9个共有峰并进行峰定位。

在一个实施方式中，所述紫菀样品选自紫菀配方颗粒及其上游原料，优选紫菀样品选自紫菀药材、饮片、标准汤剂、提取物或配方颗粒。

在另一个实施方式中，所述紫菀样品中五种酚酸类成分分别为新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸。

在另一个实施方式中，所述供试品制备包括取紫菀样品研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80％的甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声或加热或震荡后，放冷，再称定重量，用所述甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

在另一个实施方式中，所述紫菀样品与所述甲醇水溶液的质量体积比为：1g：40-80ml，优选地为1g：50ml。

在另一个实施方式中，所述参照物或对照品的制备包括：

取紫菀对照药材加水，两者的配比为1g:15-30ml，加热回流，放冷，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取绿原酸对照品加甲醇水溶液制成10～100μg/ml浓度的溶液，作为对照品参照物溶液。

在另一个实施方式中，所述检测步骤采用超高效液相色谱仪和二极管阵列检测器，优选色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq；以四氢呋喃-甲醇溶液为流动相A，以0.02～0.5％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速每分钟0.25～0.45ml。

在另一个实施方式中，所述梯度洗脱采用下表所示程序：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	9→11	91→89
10～11	11→21	89→79
			11～17	21→26	79→74
17～25	26	74
			25～36	26→38	74→62

在另一个实施方式中，所述一测多评分析包括以绿原酸对照品为参照，计算紫菀样品中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的相对保留时间并与规定值进行比较；以绿原酸的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算所述紫菀样品中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、 1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的含量。

在另一个实施方式中，所述新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的校正因子分别为0.98，1.09，1.00，0.55，0.87，0.81。

在另一个实施方式中，步骤2)所述的9个共有峰，以绿原酸参照物相对应的峰为S1峰，以1-5-O-二咖啡酰奎宁酸参照物相对应的峰为S2峰，对1、2、3、 5、6、7、9号峰进行定位，各峰规定值分别为：峰1：0.42、峰2：0.81、峰3： 0.92、峰5：1.13、峰6：1.41、峰7：1.58、峰9:1.05，各峰的相对保留时间在规定值的±10％之内。

在另一个实施方式中，所述9个共有峰中，其中峰1为新绿原酸；峰3为隐绿原酸；峰4为绿原酸；峰5为咖啡酸；峰7为1-3-O-二咖啡酰奎宁酸；峰8为1,5-O-二咖啡酰奎宁酸。

发明的效果

本发明提供的紫菀样品的质量评价方法，其法以新绿原酸，隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸6个成分的含量或者其中3个成分总量，以及9个共有峰的有无作为紫菀配方颗粒及其上游原料如紫菀药材、饮片、标准汤剂、水提取物的质量控制体系。该方法指标选择合理，酚酸类水溶性相对较高且具有抗氧化、抗炎抑菌等作用，且本发明所选的指标之间存在互相转化的可能性且具有一定代表性。

另一方面，本发明的方法可以实现整体定性与多指标定量同步测定，更能全面反映产品质量。对紫菀原料及相关产品的质量评价更有积极的意义，为推动中药实现现代化、国际化，产品均一、稳定提供助力。

此外，本发明的方法方便快捷，节约成本，实用性良好。本发明的方法采用超高液相色谱法进行一测多评，分析成分多，定性定量同时进行，分析周期较短，使用1～2个对照品即可实现对质量的控制，大大降低了成本，提高了普适性。

附图说明

图1紫菀颗粒专属性试验；图2紫菀对照药材图谱；图3紫菀多批次药材特征图谱叠加图；图4紫菀多批次标准汤剂图谱叠加图；图5紫菀多批次配方颗粒特征图谱叠加图；图6紫菀药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征共有峰图谱(A：紫菀药材，B：紫菀饮片，C：紫菀标准汤剂，D：紫菀配方颗粒)；图7紫菀配方颗粒特征对照图谱(峰1：新绿原酸峰3：隐绿原酸峰4(S1)：绿原酸峰5：咖啡酸峰7：1-3-O-二咖啡酰奎宁酸峰8：1-5-O-二咖啡酰奎宁酸(S2))；图8紫菀标准汤剂特征对照图谱；图9紫菀药材特征对照图谱。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方式”、“另一些具体/优选的实施式”、“实施方式”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。

本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本发明提供了一种紫菀样品的质量评价或者质量控制方法，该方法采用超高效液相色谱仪将多指标含量测定和多成分定性相结合，比较全面的体现了产品的质量，对紫菀原料及相关产品的质量评价更有积极的意义。具体而言，本发明的方法包括供试品制备、参照物或对照品的制备、采用超高效液相色谱仪进行检测和分析步骤。

其中，所述分析步骤包括：

1)一测多评分析：以绿原酸为内参物，同时测定紫菀样品中五种酚酸类成分；

2)特征图谱分析：判断供试品色谱中是否存在9个共有峰并进行峰定位。

在一个实施方式中，所述紫菀样品选自紫菀配方颗粒及其上游原料如紫菀药材、饮片、标准汤剂、水提取物。在另一个实施方式中，所述紫菀样品中五种酚酸类成分分别为新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸(即1-3-二咖啡酰奎宁酸)、1-5-O- 二咖啡酰奎宁酸(即1-5-二咖啡酰奎宁酸)。

配方颗粒作为饮片剂型的发展和补充，大多以水作为提取溶剂，通过将紫菀制成配方颗粒既保证了传统中药的特点，又提高了质量保证，值得推广和应用。紫菀中的具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗组胺活性物质主要为酚酸类成分，祛痰的活性成分包括紫菀酮和酚酸类成分。配方颗粒主要采用水为溶媒，对水溶性不好的紫菀酮、黄酮类等溶出较少，标准汤剂中难以测定，不适宜标准的制定。而水溶性较好的酚酸类成分具有很好的抗氧化，抗炎抑菌等作用，在紫菀发挥治疗中起着重要作用。另外根据文献研究发现绿原酸，新绿原酸和隐绿原酸存在互相转化和降解的可能性，可能降解为咖啡酸，而1-3-O- 二咖啡酰奎宁酸和1-5-O-二咖啡酰奎宁酸在二咖啡酰奎宁酸类物质中含量较高，具有一定代表性，其中1-5-O-二咖啡酰奎宁酸是一种新结构类型的抗乙型肝炎病毒和艾滋病病毒的化合物，在经过严格的动物药效学试验和安全性试验后，日前正式被中国国家食品药品监督管理局批准进入人体临床试验阶段。基于以上考虑本发明选择绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸和1-5-O-二咖啡酰奎宁酸这六个成分作为紫菀配方颗粒、紫菀药材或者紫菀饮片的指标成分。

紫菀标准汤剂是指经过标准化工艺(根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》)制备而成的单味紫菀水煎剂。而本发明中的“水提取物”或“提取物”均是指紫菀配方颗粒制备中的中间产物，是指紫菀饮片经过水提后的产物。因此上述六个水溶性较好的指标成分也适用于紫菀标准汤剂、紫菀水提取物的质量控制。

在另一个实施方式中，所述供试品制备包括取紫菀样品研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80％的甲醇水溶液，优选加入70％的甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声或加热或震荡后，放冷，再称定重量，用所述甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。在另一个实施方式中，所述紫菀样品与所述甲醇水溶液的质量体积比为：1g：40-80ml，优选地为1g:40-65ml，进一步优选为1g：50ml以实现提取充分且满足检测的浓度要求。在本发明中对超声或加热或震荡方式没有特别限制，各提前方式提取所得含量接近，但从测试实际考虑，优选超声处理。超声的时间为10～70min，优选10～40min，更优选为15～35min，本发明研究表明超声15min后，6个指标成分的总含量基本不再增加，说明提取充分，综合考虑检验周期和提取充分等因素，更优选超声时间为30min。超声功率为100～400W，优选为200～250W，超声频率为10～100KHz，优选为30～50 KHz，更优选为40KHz。在供试品制备过程中，所述的过滤没有特定的限定，可以是本领域任何常规的过滤手段，优选为膜过滤，更有采用孔径为0.1～0.5μm的微孔滤膜，进一步优选为2.2μm的微孔滤膜。采用该方法制备的供试品溶液在48小时稳定性良好。

在另一个实施方式中，本发明参照物或对照品的制备包括：

取紫菀对照药材加水，两者的配比为1g:15-30ml，加热回流，放冷，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取绿原酸对照品加甲醇水溶液制成10～100μg/ml浓度的溶液，作为对照品参照物溶液。

进一步地，本发明取紫菀对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。优选地，本步骤的过滤方式同供试品制备。

本发明采用了对照品、对照药材双重对照，可以有效克服液相条件指纹图谱固有存在的耐用性偏差问题，使得评价更加全面。

在另一个实施方式中，本发明的检测步骤采用超高效液相色谱仪和二极管阵列检测器(DAD检测器)。本发明优选色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm。本发明人发现该分离效果较好，保留时间适中，不同批次色谱柱对样品的测定结果影响较小，且具有良好的耐用性。本发明采用了UPLC法，与常规 HPLC法相比，分析周期短，分离度更高，更加环保，使用UPLC检测周期是HPLC的三分之一左右，大大提高了研究检测的精度和效率，另外UPLC还可分离出HPLC包峰的某些成分。在一个具体实施方式中，本发明可采用Waters-ACQUIYT-UPLC-H-Class的超高效液相色谱系统。通过全波扫描可知，6个指标成分在327nm附近均有最大吸收波长，综合考虑选择波长为327nm。

本发明以四氢呋喃-甲醇溶液为流动相A，以0.02～0.5％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱。本发明的梯度洗脱采用表1所示程序(其中流动相的百分所表示体积百分数)：

表1梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	9→11	91→89
10～11	11→21	89→79
			11～17	21→26	79→74
17～25	26	74
			25～36	26→38	74→62

从色谱峰分离效果考虑，本发明优选的流速为0.25～0.45ml/min，优选流速为0.25～0.35mll/min，柱温为25～45℃，更进一步地，考虑到色谱柱的耐用性和分析所需时间，流速优选为0.35ml/min，柱温优选为35℃。

在本发明中采用一测多评的分析方法。一测多评法是基于在一定线性范围内某物质的量(质量/浓度)和仪器响应值成正比，即在一定线性范围内，相同进样量和色谱条件下，某物质的校正因子(峰面积/浓度)为确定值，而不同的物质其校正因子可能不一样，所以可以通过内参物对待测物的校正因子(Fsi相对校正因子)这种确定的函数(比例) 关系实现一测多评，以达到对多成分含量快速检验，同时简化操作，节省成本的目的。

本发明的一个实施方式中，本发明所述的一测多评分析包括以绿原酸对照品为参照，计算紫菀样品中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的相对保留时间并与规定值进行比较；以绿原酸的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算所述紫菀样品中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的含量。

在实际情况中，由于系统，操作等误差使得测定值与真实值有一定偏差。为了消除系统误差，减少偶然误差，使得Fsi更加准确，验证Fsi的适应性，保证实验准确性，科学性和严谨性，有必要测定在一定波动条件下(柱温、流速、进样量、色谱柱)的Fsi值以校正系统偏差；测定不同称样量浓度、内参物与待测物不同浓度比例下的Fsi值以校正偶然误差(如称量误差)。在此基础上，最后确定新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1-3-0二咖啡酰奎宁酸和1-5-0二咖啡酰奎宁酸5种成分(以绿原酸为内参物)的最终Fsi值。

本发明通过分别精密吸取一定浓度的绿原酸对照品溶液、新绿原酸对照品溶液、隐绿原酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，以本发明的色谱条件在不同色谱柱(Waters HSST3(2.1×100mm，1.8μm)、Agilent Ecipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)、Agilent Zorbax SB-Aq(100×2.1mm， 1.8μm)；不同流速(每分钟0.3ml、0.35ml、0.4ml)；不同柱温(25℃、30℃、35℃)；不同进样体积下进行测定峰面积。计算相对校正因子和计算相对保留时间(以绿原酸计)，计算公式如下

Fsi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)

式中Fsi为相对校正因子，As为内参物对照品s峰面积，Cs为内参物对照品s浓度，Ai为某待测成分对照品i峰面积，Ci为某待测成分对照品i浓度。

基于以上测定对应绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸和 1-5-O-二咖啡酰奎宁酸保留时间。计算其相对保留时间公式如下：

R＝ti/ts

式中R为相对保留时间，ts为内参物对照品s峰保留时间，ti为内参物对照品峰保留时间。

本发明计算不同柱温、不同流速、不同色谱柱、不同进样量相对校正因子和相对保留时间，由结果可以看出上述不同条件下各待测成分Fsi的RSD均较小(≤2％)，说明不同柱温、不同流速、不同色谱柱、不同进样量对Fsi值影响较小，表明各成分Fsi具有很好的适用性。综合以上，通过计算不同条件下的各成分平均Fsi值作为最终相对校正因子，本发明中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的校正因子分别为0.98，1.09，1.00，0.55，0.87，0.81。

色谱峰的准确定位是一测多评法的关键之一，一般可以采用保留时间差或相对保留值等参数结合色谱图整体特征，以及每个峰的紫外吸收特征来定位其余待测成分色谱。在本发明中以绿原酸对照品为参照，以其相应的峰为s峰，计算新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的相对保留时间，从而确定规定值和波动范围。本发明发现±5％时，峰5和峰6超过了波动范围，而±10％时各峰则符合要求，因此，规定值为：0.42(峰1)、0.92(峰2)、1.13(峰4)、1.58(峰5)、 3.17(峰6)，确定其相对保留时间应在规定值的±10％之内。

在本发明中，由于药材饮片、标准汤剂、中间体(如水提取物)以及颗粒含量测定方法均是在同一色谱条件下进行，而相对校正因子的确定是通过该色谱条件下利用标准品进行确定，因此紫菀药材饮片、标准汤剂、中间体以及颗粒一测多评中的相对校正因子和相对保留时间相同。

为了全面整体反应紫菀的质量信息，本发明还结合特征图谱的分析方法。通过测试不同批次的紫菀药材、紫菀饮片、紫菀标准汤剂、紫菀配方颗粒，获得其特征图谱并进行叠加，标定共有峰，结合实际可实施性以及对照品指认的情况，本发明确定其中的9个共有峰作为紫菀特征峰，用以评价其质量，具体参见图1-4。其中峰1：新绿原酸；峰3：隐绿原酸；峰4(S)：绿原酸；峰5：咖啡酸；峰7：1-3-O-二咖啡酰奎宁酸；峰8：1,5-O- 二咖啡酰奎宁酸。

在本发明的一个具体实施方式中，为了更加客观的确定待测峰相对保留时间，更加准确的进行峰定位，考虑以绿原酸参照物相对应的峰为S1峰，以1-5-O-二咖啡酰奎宁酸参照物相对应的峰为S2峰，对1、2、3、5、6、7、9号峰进行定位，在本发明中规定值为： 0.42(峰1)、0.81(峰2)、0.92(峰3)、1.13(峰5)、1.41(峰6)、1.58(峰7)、1.05 (峰9)，考虑±8％时峰6压波动值上限，因此考虑规定其相对保留时间应在规定值的±10％之内。

采用本发明的质量评价方法，线性结果好，精密度高，回收率在95％-105％之间，准确度高，重复性好。

实施例

以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。应当理解的是，下列实施例仅用于解释和说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。

一、仪器与试剂

Waters-ACQUIYT-UPLC-H-Class，超高效液相色谱系统； waters-Quaternary-Solvent-Manager-四元泵；Sample-manager-FTN自动进样器； Waters-UPLC-PDA检测器；Empower-3色谱工作站；KQ-250E超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；HY-4振荡器(金坛市科兴仪器厂)；蒸发光检测器(奥泰6000)；纯水系统(Sartorius公司)；TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)；甲醇(色谱纯， Thermo Fisher公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。四氢呋喃(国药集团化学试剂有限公司，40058185CN31042，UN 2056，色谱级)。

紫菀配方颗粒由江阴天江药业有限公司提供(批号：18050019，18050029，18050039)。

二、对照品来源

新绿原酸(编号：lot4974，ST06230120MG)购于上海诗丹德生物技术有限公司，供含量测定用，含量以98.0％计；隐绿原酸(编号：lot3208，ST07850120MG)购于上海诗丹德生物技术有限公司，供含量测定用，含量以98.0％计；绿原酸(编号：110753-201716) 购于中国食品药品检定研究研究院，供含量测定用，含量以99.3％计；咖啡酸(编号： 110885-200102)购于中国食品药品检定研究研究院，供含量测定用，含量以100％计； 1-3-O-二咖啡酰奎宁酸(编号：111717-201402)购于中国食品药品检定研究研究院，供含量测定用，含量以94.5％计；1-5-O-二咖啡酰奎宁酸(编号：lot3932，ST00910120MG) 购于上海诗丹德生物技术有限公司，供含量测定用，含量以98.0％计。

三、色谱条件

以Angilent ZORBAX SB-Aq(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)为色谱柱；以四氢呋喃-甲醇(20：80)溶液为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B。梯度洗脱程序如前表1所示。柱温35℃，流速每分钟0.35ml。理论板数按绿原酸计算应不低于 3000。

波长的选择

通过全波扫描可知，各指标成分在327附近均有最大吸收波长，综合考虑选择波长为327nm。

四、参照物或对照品溶液的制备

取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸和1-5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml分别为5μg、5μg、15μg、8μg、 10μg、25μg的混合对照品溶液，摇匀，即得。

取紫菀对照药材(购自中检院，货号120956-201807，鉴别用)1.0g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

五、供试品溶液的制备

1)不同提取溶剂的考察

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)约0.5g，平行3组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇、70％甲醇、甲醇各25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用对应的溶剂补足减失的重量，摇匀，过2.2μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算总量，结果参见表2。

表2不同提取溶剂的比较

由上表可以看出：70％甲醇提取总含量最高。因此确定提取溶剂为70％甲醇溶液。

2)不同提取方法的考察

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)约0.5g，平行3组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声(功率250W，频率40kHz)处理、加热回流、振摇提取30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过2.2μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算总含量。

表3不同提取方法的比较

由上表可以看出：各个处理方式含量相近，综合考虑确定提取方式为超声处理。

3)不同提取时间的考察

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)约0.5g，平行4组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声(功率250W，频率40kHz)处理15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过2.2μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算总含量。

表4不同提取时间的比较

由上表可以看出：超声15min后，总量基本上不再增加，说明已经提取充分，综合考虑，确认提取时间为30min。

4)不同提取体积的考察

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)约0.5g，平行三组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml、25ml、50ml，密塞，称定重量，分别超声(功率250W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过2.2μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算得总含量。

表5不同提取体积的比较

由上表看出：提取溶剂为25ml时，含量较高，说明已经提取充分，综合实际情况，确定溶剂量为25ml。

5)供试品溶液制备方法的确定

根据上述研究结果，确定紫菀配方颗粒含量测定的供试品溶液制备方法为：

取紫菀样品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。

六、方法学验证

1)线性

分别精密吸取混合对照品溶液(新绿原酸浓度为5.11μg/ml，隐绿原酸浓度为5.10μg/ml，绿原酸浓度为12.22μg/ml，咖啡酸浓度为8.13μg/ml，1-3-O-二咖啡酰奎宁酸浓度为10.23μg/ml，1-5-O-二咖啡酰奎宁酸浓度为25.53μg/ml)0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，各成分进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，结果见表6-11。

表6新绿原酸对照品峰面积积分值与进样量关系

表7隐绿原酸对照品峰面积积分值与进样量关系

表8绿原酸对照品峰面积积分值与进样量关系

表9咖啡酸对照品峰面积积分值与进样量关系

表10 1-3-O-二咖啡酰奎宁酸对照品峰面积积分值与进样量关系

表11 1-5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品峰面积积分值与进样量关系

2)精密度试验

2.1仪器精密度试验

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)按前述5)供试品溶液制备方法制成样品供试液，精密吸取2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，连续进样6次，记录其峰面积测量值，计算相对标准偏差，结果参见表12。结果表明：仪器的精密度试验良好。

表12仪器精密度试验

2.2中间精密度试验

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)，由两个实验员分别按照表13的要求处理3份，进样2μl，测定各成分面积值；计算含量，计算其RSD，结果见表13。

表13中间精密度试验

结果表明：样品的中间精密度试验良好。

2.3重复性试验

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)，平行6组，每组2份，分别按正文供试品溶液制备方法制成样品供试液，分别进样2μl，测定各成分峰面积值，计算其含量及RSD，结果见表14。

结果表明：样品的重复性试验良好。

表14样品的重复性试验结果表

2.4准确度试验

取已知含量的紫菀颗粒样品(批号：18050019含量：3.191mg/g)0.25g，精密称定，分别加入适量对应的对照品，按前述5)供试品溶液制备方法制成加样回收供试品溶液，按本发明前述色谱条件，分别进样2μl，以下列公式计算回收率，RSD，结果见下表。

回收率(％)＝(测得量(mg)-样品中含量(mg)×100％)/加入对照品量(mg)

表15准确度试验

试验结果表明：回收率在95％～105％之间，准确度试验良好。

2.5专属性试验

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)供试品溶液、阴性溶液与混合对照品溶液注入液相色谱仪。

实验结果见图1，由图1可知：阴性色谱图中在与对照品相应的保留时间没有色谱峰，说明溶剂对各待测成分的测定无干扰，以本法测定新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的含量具有专属性。

2.6延迟性试验

在确定的色谱条件上，保持最高流动相比例，延长洗脱时间，考察在既定的色谱条件系统下，是否会残留杂质峰对后续样品造成影响。

由实验结果可知，延长进样时间至80min，无杂质峰，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，对后续样品的分析亦无影响。

2.7耐用性试验

2.7.1稳定性试验

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)，按前述5)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、24h进样2μl，测定峰面积值，计算其RSD，结果见下表。

表16稳定性试验测定结果

结果表明：样品供试液在48小时内稳定性良好。

2.7.2不同流速考察

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)，按前述5)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液供试液，考察每分钟0.25ml、0.30ml、0.35ml三个流速下色谱峰分离效果。

表17不同流速考察

结果表明，三种流速下，色谱峰的分离度均较好。考虑到色谱柱的耐用性，且流速为0.35ml/min时分析所需时间适中，因此选择流速为0.35ml/min。

2.7.3柱温考察

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)，按前述5)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液供试液，考察30℃、35℃、40℃三个温度下色谱峰分离效果，结果参见表18。结果表明，三种柱温下色谱峰分离效果均较好。考虑到色谱柱的耐用性，且柱温为35℃时分析所需时间适中，因此选择柱温为35℃。

表18不同柱温的考察

2.7.4色谱柱考察

取紫菀配方颗粒(批号：18050019)，按前述5)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液供试液，分别采用Agilent Zorbax SB-Aq(100×2.1mm，1.8μm)、三个批次色谱柱对紫菀配方颗粒的分离效果。

表19不同色谱柱的比较

分析结果显示，三个批号色谱柱的分离均较好，保留时间适中，说明不同批次色谱柱对样品的测定结果影响较小，此方法具有普遍适应性。经综合考量，本发明确定采用Agilent Zorbax SB-Aq C18(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱进行总含量测定。

七、相对校正因子的确定

试验方法

分别精密吸取绿原酸对照品溶液(12.22μg/ml)，新绿原酸对照品溶液(5.11μg/ml)，隐绿原酸对照品溶液(5.10μg/ml)，咖啡酸对照品溶液(8.13μg/ml)，1-3-O-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液(10.236μg/ml)，1-5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液(25.53μg/ml)以上述色谱条件在不同色谱柱(Waters HSST3(2.1×100mm，1.8μm)、Agilent Ecipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)、Agilent Zorbax SB-Aq(100×2.1mm，1.8μm)；不同流速(每分钟0.3ml、0.35ml、0.4ml)；不同柱温(25℃、30℃、35℃)；不同进样体积下进行测定峰面积。计算相对校正因子和计算相对保留时间(以绿原酸计)，计算公式如下：

Fsi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)

式中Fsi为相对校正因子，As为内参物对照品s峰面积，Cs为内参物对照品s浓度，Ai为某待测成分对照品i峰面积，Ci为某待测成分对照品i浓度。

基于以上测定对应绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸和 1-5O-二咖啡酰奎宁酸保留时间。计算其相对保留时间公式为：R＝ti/ts

式中R为相对保留时间，ts为内参物对照品s峰保留时间，ti为内参物对照品峰保留时间。结果如下：

表20不同柱温相对校正因子和相对保留时间

表21不同流速相对校正因子和相对保留时间

表22不同色谱柱相对校正因子和相对保留时间

表23不同进样量相对校正因子和相对保留时间

1)确定相对校正因子：

由结果可以看出不同柱温、不同流速、不同色谱柱、不同进样量下各待测成分Fsi的 RSD均较小(≤2％)，说明不同流速、不同柱温、不同色谱柱、不同进样量对Fsi值影响较小，表明各成分Fsi具有很好的适用性。综合以上，通过计算不同条件下的各成分平均Fsi值作为最终相对校正因子，结果如下表：

表24待测成分相对校正因子的确定

2)确定保留时间的确定：

表25特征峰相对保留时间的确定

根据上表，计算新绿原酸，隐绿原酸，咖啡酸，1-3-O-二咖啡酰奎宁酸和1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的相对保留时间，发现±5％时，峰5和峰6超过了波动范围，而±10％时各峰则符合要求，因此，规定值为：0.42(峰1)、0.92(峰2)、1.13(峰4)、1.58(峰5)、 3.17(峰6)，确定其相对保留时间应在规定值的±10％之内。

八、不同批次紫菀配方颗粒含量测定

取三批紫菀配方颗粒样品适量，研细，取约0.5g，精密称定，按前述5)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液供试液，测定6个成分的总量，具体实验参数如下：色谱条件与同前“三、色谱条件”。对照品参照物溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含绿原酸15μg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的紫菀配方颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。

然后按照上述色谱条件测定，获得相应的图谱，结合一批多测方法计算不同批次紫菀配方颗粒6个指标成分的含量。

表26不同批次紫菀配方颗粒含量测定

由此可证明本发明的方法可以实际应用于紫菀配方颗粒的质量控制，可测得不同批次的配方颗粒中6个指标成分含量和总量，该方法具有可操作性。

九、特征图谱确定

1)共有峰的选择

按照本发明前述5)供试品溶液的制备方法分别制备紫菀三批次配方颗粒(批号：18050019，18050029，18050039)的供试品溶液，按照本发明前述方法分别制备对照品参照物溶液、紫菀对照药材参照物溶液。

分别精密吸取对照品参照物溶液、紫菀对照药材参照物溶液和供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，按本发明前述“三、色谱条件”进行测定获得相应的图谱，计算相对保留时间等参数。结果显示，供试品特征图谱呈现特征峰与紫菀对照药材图谱(参见图2) 中的特征峰保留时间相对应，其中6个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同。

类似的，对紫菀多批次药材(16批次)、多批次标准汤剂(16批次，实验室自制) 进行检测，分别获得特征图谱。图3-5显示了紫菀多批次药材、多批次标准汤剂、多批次配方颗粒的特征图谱叠加图。图6显示了紫菀药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征共有峰图谱(A：紫菀药材，B：紫菀饮片，C：紫菀标准汤剂，D：紫菀配方颗粒)。根据药材、饮片、标准汤剂和颗粒多批次共有峰，结合实际可实施性，以及对照品指认的情况，最终特征图谱规定9个共有峰作为紫菀特征峰，用以评价其质量，参见图6所示。

2)峰定位——相对保留时间的确定

为了更加客观的确定待测峰相对保留时间，更加准确的进行峰定位，考虑以绿原酸参照物相对应的峰为S1峰，以1-5-O-二咖啡酰奎宁酸参照物相对应的峰为S2峰，参见图7，对1，2，3，5，6，7，9号峰进行定位，结合验证数据确定其相对保留时间，结果参见表27。

结合上述数据，计算(Xmax+Xmin)/2，以绿原酸和1-5-O-二咖啡酰奎宁酸为S1和S2，计算1，2，3，5，6号峰与S1峰的相对保留时间，计算9号峰与S2峰的相对保留时间，规定值为：0.42(峰1)、0.81(峰2)、0.92(峰3)、1.13(峰5)、1.41(峰6)、 1.58(峰7)、1.05(峰9)，考虑±8％时峰6压波动值上限，因此考虑规定其相对保留时间应在规定值的±10％之内。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)对三批次紫菀配方颗粒色谱图谱进行数据分析，以中位数生成紫菀配方颗粒对照特征图谱(见图7)。类似地，对16 批次标准汤剂进行检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)对16批次紫菀标准汤剂色谱图谱进行数据分析，以中位数生成紫菀标准汤剂对照特征图谱(见图8)。对16批次紫菀药材进行检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0 版本)对16批次紫菀药材色谱图谱进行数据分析，以中位数生成紫菀药材对照特征图谱 (见图9)。建立的特征图谱检测方法可以较为准确地整体控制紫菀配方颗粒、紫菀标准汤剂、紫菀药材的质量。

表27特征峰相对保留时间的确定

Claims (8)

1.一种紫菀样品的质量评价方法，其特征在于，所述方法包括供试品制备、参照物或对照品的制备、采用超高效液相色谱仪进行检测和分析步骤，

其中，所述分析步骤包括：

1)一测多评分析：以绿原酸为内参物，同时测定紫菀样品中五种酚酸类成分；

2)特征图谱分析：判断供试品色谱中是否存在9个共有峰并进行峰定位；

其中，所述紫菀样品选自紫菀药材、饮片、标准汤剂、提取物或配方颗粒；

所述紫菀样品中五种酚酸类成分分别为新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸；

所述检测步骤采用超高效液相色谱仪和二极管阵列检测器，以四氢呋喃-甲醇溶液为流动相A，以0.02～0.5％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速每分钟0.25～0.45ml；其中，所述梯度洗脱采用下表所示程序：

时间min 流动相A％ 流动相B％ 0～10 9→11 91→89 10～11 11→21 89→79 11～17 21→26 79→74 17～25 26 74 25～36 26→38 74→62

；

所述供试品制备包括取紫菀样品研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80％的甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声或加热或震荡后，放冷，再称定重量，用所述甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

所述采用超高效液相色谱仪进行检测时使用的色谱柱型号为Waters HSST3、AgilentEcipse Plus C18、Agilent Zorbax SB-Aq中的任意一种，所述色谱柱的柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm。

2.根据权利要求1所述的质量评价方法，其特征在于，所述紫菀样品与所述甲醇水溶液的质量体积比为：1g：40～80ml。

3.根据权利要求1或2所述的质量评价方法，其特征在于，所述参照物或对照品的制备包括：

取紫菀对照药材加水，两者的配比为1g:15～30ml，加热回流，放冷，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取绿原酸对照品加甲醇水溶液制成10～100μg/ml浓度的溶液，作为对照品参照物溶液。

4.根据权利要求1或2所述的质量评价方法，其特征在于，所述色谱柱为AgilentZORBAX SB-Aq。

5.根据权利要求1或2所述的质量评价方法，其特征在于，所述一测多评分析包括以绿原酸对照品为参照，计算紫菀样品中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的相对保留时间并与规定值进行比较；以绿原酸的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算所述紫菀样品中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的含量。

6.根据权利要求5所述的质量评价方法，其特征在于，所述新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1-3-O-二咖啡酰奎宁酸、1-5-O-二咖啡酰奎宁酸的校正因子分别为0.98，1.09，1.00，0.55，0.87，0.81。

7.根据权利要求1或2所述的质量评价方法，其特征在于：

步骤2)所述的9个共有峰，以绿原酸参照物相对应的峰为S1峰，以1-5-O-二咖啡酰奎宁酸参照物相对应的峰为S2峰，对1、2、3、5、6、7、9号峰进行定位，各峰规定值分别为：峰1：0.42、峰2：0.81、峰3：0.92、峰5：1.13、峰6：1.41、峰7：1.58、峰9:1.05，各峰的相对保留时间在规定值的±10％之内。

8.根据权利要求7所述的质量评价方法，其特征在于：所述9个共有峰中，其中峰1为新绿原酸；峰3为隐绿原酸；峰4为绿原酸；峰5为咖啡酸；峰7为1-3-O-二咖啡酰奎宁酸；峰8为1,5-O-二咖啡酰奎宁酸。

Images