CN111650297A - 一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法 - Google Patents

一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法，属于化学分析技术领域。一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法，包括下述工艺步骤：配制浆果中常见的有机酸标准溶液，利用超高效液相色谱质谱联用仪建立测定有机酸标准品的方法条件；根据有机酸标准溶液的浓度和峰面积建立相应有机酸浓度‑峰面积标准曲线；利用上述测定有机酸标准品的方法条件获得待测浆果果汁中各个有机酸的峰面积，通过有机酸浓度‑峰面积标准曲线计算待测浆果果汁中各种有机酸的浓度。本发明建立的UPLC‑MS/MS检测方法，采用保留时间与特征离子对对已知的目标物进行定性定量分析，准确性好，灵敏度高。

Description

一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法
技术领域
本发明涉及一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法，属于化学分析技术领域。
背景技术
有机酸类(Organic acids)物质是分子结构中含有羧基(-COOH)的化合物。它们普遍存在于植物的根、叶、果实等组织中，在叶中主要以有机酸盐的形式存在。在果实中，尤其是在浆果中，有机酸存在最多。常见的植物中的有机酸主要有脂肪族的一元、二元、多元羧酸如酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸等。有机酸在植物生理代谢中发挥着重要作用，尤其是在呼吸作用中，它们是碳水化合物、脂肪、蛋白质代谢的中间产物，也是这三大类营养物质代谢的重要联结者。有机酸在植物组织中的含量因植物品种和成熟度不同而不同。研究表明，有机酸具有协同抗氧化、抗菌、促进消化、调节肠道微生物等生物活性。
浆果(Berry)是一类柔嫩多汁单果的统称，常见的浆果主要有蓝莓、树莓、不老莓等。浆果中含有丰富的花色苷、黄酮、多酚等植物活性成分，具有抗炎、抗癌、保护视力、抗衰老、降血糖等诸多辅助功效。除丰富的营养价值外，浆果酸甜适口的滋味与其中含有的多种有机酸密不可分，有机酸能够直接影响浆果或其果汁制品的品质与口感。目前在浆果及其深加工产品的生产中，如何更大程度地保留花色苷等重要营养物质是选择加工方式的首要前提。相比之下，对有机酸的变化情况则较少考察。近年来，有相关研究表明，有机酸不仅影响浆果或其果汁制品的口感，还能够对花色苷起到保护作用，减少花色苷的损失，因此在浆果及其加工制品中，增加对有机酸这一指标的考察十分必要。
基于当前的研究现状，有机酸的测定方法主要有固相微萃取、毛细管电泳、离子色谱、液相色谱等方法，但关于浆果及其制品中主要有机酸的超高效液相色谱质谱联用技术(UPLC-MS/MS)同时检测尚未见文献报道，并且以往的方法通常操作繁琐，耗时较长。因此，有必要研究并建立一种高效、稳定的蓝莓有机酸的测定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有有机酸测定繁琐耗时以及浆果果汁有机酸检测方法缺乏的现状，提供一种样品处理简单，快捷的浆果果汁中有机酸检测的方法，其利用UPLC-MS/MS技术，对浆果果汁中有机酸进行便捷、高效且灵敏度高的定量检测。
一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法，包括下述工艺步骤：
配制浆果中常见的有机酸标准溶液，利用UPLC-MS/MS技术建立测定有机酸标准品的方法条件；根据有机酸标准溶液的浓度和峰面积建立相应有机酸浓度-峰面积标准曲线；利用上述确定的测定有机酸标准品的方法条件获得待测浆果果汁中各个有机酸的峰面积数值，通过有机酸浓度-峰面积标准曲线计算待测浆果果汁中各种有机酸的浓度，
其中，所述有机酸标准品为绿原酸、表儿茶素、丁香酸、奎宁酸、柠檬酸、莽草酸、没食子酸、2,4,6-三羟基苯甲醛、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸；
利用超高效液相色谱质谱联用仪建立测定有机酸标准品的方法条件如下：
液相条件：色谱柱：Thermo AQUASIL C18 250mm×4.6μm；进样量：2μL；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件：0-5min：甲醇10％；5-16min：甲醇10％-100％；后运行2min；
质谱条件：采用多反应监测(MRM)，负离子扫描模式，干燥气温度325℃；干燥气流速7L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速11L/min。
上述技术方案中，所述浆果中常见的有机酸包括绿原酸、表儿茶素、丁香酸、奎宁酸、柠檬酸、莽草酸、没食子酸、2,4,6-三羟基苯甲醛、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸。
优选地，所述有机酸标准溶液和待测浆果果汁过0.22μm水系滤膜。
优选地，所述有机酸标准溶液按下述方法配置：用超纯水定容成为浓度5.0mg/mL的混合标准溶液，再分别稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的混合标准溶液。
优选地，所述方法还包括验证建立的检测方法的重复性、回收率、精密度、定量限(LOQ)、检出限(LOD)和校准曲线。
进一步地，所述定量限(LOQ)、检出限(LOD)及校正曲线按下述方法验证：
将有机酸标准溶液分别用超纯水稀释到相应的浓度范围，其中，绿原酸10-6000ng/mL，表儿茶素5-200ng/mL，丁香酸20-6000ng/mL，奎宁酸5-80000ng/mL，柠檬酸10-80000ng/mL，莽草酸10-4000ng/mL，没食子酸5-2000ng/mL，2,4,6-三羟基苯甲醛10-200ng/mL，酒石酸5-4000ng/mL，苹果酸10-20000ng/mL，琥珀酸5-5000ng/mL，乳酸5-10000ng/mL，进行UPLC-MS/MS分析，将浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标绘制校正曲线，得到相关系数r，从而判断线性关系；在信噪比为3和10时，对不同浓度的有机酸进行分析，并计算得到LOQ和LOD。
进一步地，所述精密度按下述方法验证：
通过测定日内和日间的变化情况，评价所建立方法的精密度；相对标准差(RSD)为变异值，具体操作为：将混合标准溶液，在同一天内连续5次测定浓度为0.5mg/mL的12种有机酸混合标准溶液的浓度，根据测定的含量差异来评价日内精密度，连续5天之间的含量差异用来评价日间精密度。
进一步地，所述精确度按下述方法验证：
通过回收实验计算回收率，对方法的准确性进行评价，体操作为：分别将不同浓度的12种有机酸标准溶液，分别是混合标准溶液相应浓度的0.5，1.0和2.0倍加入混混合标准溶液中，测定每种有机酸标准品的回收率，并进行三次重复实验。
进一步地，所述重现性和稳定性按下述方法验证：
测定混合标准溶液在4℃下2、4、8、24和48h的稳定性，将不同时间下的测定结果与初始结果进行比较；并对12种有机酸的重现性和稳定性进行RSD分析。
本发明在建立方法时使用的有机酸标准品和所有化学试剂均为商业可购得的化学试剂，其中优选Sigma-Aldrich试剂公司的有机酸标准品，纯度均≥98％，以及FisherScientific试剂公司的色谱级甲醇和甲酸。
本发明在有机酸测定过程中使用的色谱柱为有机酸专用柱，优选为ThermoAQUASIL C18 250mm×4.6μm色谱柱。
相对于现有技术，本发明获得的有益效果：
建立UPLC-MS/MS检测方法，采用保留时间与特征离子对对已知的目标物进行定性定量分析，准确性好，灵敏度高。
本发明建立的检测方法，12种有机酸在一定质量浓度范围内具有较好的线性关系，其相关系数均≥0.9995，方法的检出限范围为2-15ng/mL，定量限范围为5.7-45.5ng/mL，回收率在80.1-92.3％范围内，能够达到准确定量检测要求。
本发明建立的有机酸检测方法，能够在17min内同时检测12种有机酸，是目前有机酸的有效检测方法中耗时较短的方法，做到了对有机酸的快速、高效、稳定、准确的检测。
本发明所建立的方法，对待测样品的处理方式要求简单，不涉及复杂的溶剂及仪器处理，操作简单，耗时短。
本发明所建立的方法，具有灵敏、便捷、高效、准确以及实用性强的特点，可以应用于蓝莓以及其他浆果果品中有机酸的检测，为国内建立相应的有机酸检测方法提供重要的参考。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
图1(A)～(L)分别为奎宁酸、酒石酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、没食子酸、绿原酸、表儿茶素、丁香酸、2,4,6-三羟基苯甲醛的质谱图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
具体实施方法之一：一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法，包括下述工艺步骤：
(1)配制果品中有机酸标准品的混合标准溶液，用超纯水定容成为浓度5.0mg/mL的混合标准溶液，再分别稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的混合标准溶液，并过0.22μm水系滤膜待测，其中，所述有机酸标准品为绿原酸、表儿茶素、丁香酸、奎宁酸、柠檬酸、莽草酸、没食子酸、2,4,6-三羟基苯甲醛、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸；
(2)利用UPLC-MS/MS建立测定有机酸标准品的方法条件，建立的UPLC-MS/MS的方法条件如下：
仪器条件：Agilent 1290UPLC液相色谱仪串联Agilent 6469QQQ质谱仪；
采集软件：Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition(versionsB.06.00)；
处理软件：Agilent MassHunter Qualitative Analysis(versions B.06.00)。
液相条件：色谱柱：Thermo AQUASIL C18 250mm×4.6μm；进样量：2μL；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇。梯度洗脱条件：0-5min：甲醇10％；5-16min：甲醇10％-100％；后运行2分钟。
质谱条件：采用多反应监测(MRM)，负离子扫描模式。干燥气温度325℃；干燥气流速7L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速11L/min。
12种有机酸的保留时间、分子量、MRM、碎裂电压及碰撞能量(Collision energy,CE)电压见表1，12种有机酸的质谱图见图1(A)～(L)。
表1 12种有机酸的保留时间、分子量、MRM、碎裂电压及CE电压。
Figure BDA0002521257310000051
(3)根据上述(2)中的方法条件，根据有机酸标准溶液的浓度和峰面积建立相应有机酸的标准曲线，具体如下表：
表2有机酸测定方法建立的标准曲线结果
Figure BDA0002521257310000052
Figure BDA0002521257310000061
(4)验证建立的UPLC-MS/MS方法的重复性、回收率、精密度、定量限(LOQ)、检出限(LOD)和校准曲线
定量限(LOQ)和检出限(LOD)及校正曲线：将有机酸标准溶液分别用超纯水稀释到相应的浓度范围，(绿原酸10-6000ng/mL，表儿茶素5-200ng/mL，丁香酸20-6000ng/mL，奎宁酸5-80000ng/mL，柠檬酸10-80000ng/mL，莽草酸10-4000ng/mL，没食子酸5-2000ng/mL，2,4,6-三羟基苯甲醛10-200ng/mL，酒石酸5-4000ng/mL，苹果酸10-20000ng/mL，琥珀酸5-5000ng/mL，乳酸5-10000ng/mL)进行UPLC-MS/MS分析，将浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标绘制校正曲线，得到相关系数r，从而判断线性关系。在信噪比为3和10时，对不同浓度的有机酸进行分析，并计算得到LOQ和LOD。上述溶液按照配置好的标准品进行浓度的梯度稀释，在浓度范围内需选取至少5个浓度值，且需包括两端值。
精密度：通过测定日内和日间的变化情况，相对标准差(RSD)为变异值，从而评价所建立方法的精密度。具体操作为：将混合标准溶液，在同一天内连续5次测定浓度为0.5mg/mL的12种有机酸混合标准溶液的浓度，根据测定的含量差异来评价日内精密度，连续5天之间的含量差异用来评价日间精密度。
精确度：通过回收实验计算回收率，对方法的准确性进行评价。具体操作为：分别将不同浓度的12种有机酸标准溶液(分别是混合标准溶液中相应浓度的0.5，1.0和2.0倍)加入混合标准溶液中，测定每种有机酸标准品的回收率，并进行三次重复实验。
重现性和稳定性：测定了混合标准溶液在4℃下2、4、8、24和48h的稳定性，将不同时间下的测定结果与初始结果进行比较，结果表明，该定量方法具有重现性。并对12种有机酸的重现性和稳定性进行了RSD分析，结果具体见下表，
Figure BDA0002521257310000062
Figure BDA0002521257310000071
(5)选取成熟度均一、颗粒饱满、无病虫害的浆果，利用榨汁机进行破碎匀浆处理，离心除去皮渣；
(6)离心后的浆果果汁过0.22μm水系滤膜，作为UPLC-MS/MS有机酸检测的待测样品；
(7)利用上述(4)中确立的方法，对浆果果汁样品中有机酸含量进行测定，根据各有机酸的峰面积和相应的标准曲线，计算有机酸含量。
本发明在建立方法时使用的有机酸标准品和所有化学试剂均为商业可购得的化学试剂，其中优选Sigma-Aldrich试剂公司的有机酸标准品，纯度均≥98％，以及FisherScientific试剂公司的色谱级甲醇和甲酸。
本发明在有机酸测定过程中使用的色谱柱为有机酸专用柱，优选为ThermoAQUASIL C18 250mm×4.6μm色谱柱。
实施例1
一种快速高效的浆果果汁中有机酸测定方法，包括下述工艺步骤：
1)用超纯水定容、配制浓度为5.0mg/mL的混合标准溶液，再分别稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的混合标准溶液，过0.22μm水系滤膜；
2)将蓝莓室温下解冻2h，除去其中的树叶、木棍等杂质；
3)将步骤2)所得的蓝莓使用匀浆机进行榨汁处理，并过100目纱布除去大颗粒皮渣；
4)将步骤3)所得的蓝莓果汁在15000g条件下进行离心处理，取上层清液，过0.22μm水系滤膜，作为有机酸测定的待测样品；
5)利用本发明方法分别测定步骤1)和步骤4)的混合标准溶液和待测样品，绘制各有机酸标准曲线，并记录样品的峰面积；
6)根据标准曲线和样品的峰面积，计算得到样品中各有机酸含量。
进一步地，步骤5)的测定进行3次重复测定，且所述的测定仪器条件和方法如下：
仪器条件：Agilent 1290UPLC液相色谱仪串联Agilent 6469QQQ质谱仪；
采集软件：Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition(versionsB.06.00)；
处理软件：Agilent MassHunter Qualitative Analysis(versions B.06.00)。
液相条件：色谱柱：Thermo AQUASIL C18 250mm×4.6μm；进样量：2μL；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇。梯度洗脱条件：0-5min：甲醇10％；5-16min：甲醇10％-100％；后运行2分钟。
质谱条件：采用多反应监测(MRM)，负离子扫描模式。干燥气温度325℃；干燥气流速7L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速11L/min。
蓝莓中有机酸测定结果如下：
Figure BDA0002521257310000081
实施例2
1)用超纯水定容、配制浓度为5.0mg/mL的混合标准溶液，再分别稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的混合标准溶液，过0.22μm水系滤膜；
2)将红树莓室温下解冻1.5h，除去其中的枝叶等杂质；
3)将步骤2)所得的红树莓使用匀浆机先进行低功率榨汁处理，用粗砂布过滤除去树莓籽，接着使用匀浆机继续进行榨汁处理，并过100目纱布除去皮渣颗粒；
4)将步骤3)所得的果汁在15000g条件下进行离心处理，取上层清液过0.22μm水系滤膜，作为有机酸测定的待测样品；
5)利用本发明方法分别测定步骤1)和步骤4)的混合标准溶液和待测样品，绘制各有机酸标准曲线，并记录样品的峰面积；
6)根据标准曲线和样品的峰面积，计算得到样品中各有机酸含量。
进一步地，步骤5)的测定进行3次重复测定，且所述的测定仪器条件和方法如下：
仪器条件：Agilent 1290UPLC液相色谱仪串联Agilent 6469QQQ质谱仪；
采集软件：Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition(versionsB.06.00)；
处理软件：Agilent MassHunter Qualitative Analysis(versions B.06.00)。
液相条件：色谱柱：Thermo AQUASIL C18 250mm×4.6μm；进样量：2μL；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇。梯度洗脱条件：0-5min：甲醇10％；5-16min：甲醇10％-100％；后运行2分钟。
质谱条件：采用多反应监测(MRM)，负离子扫描模式。干燥气温度325℃；干燥气流速7L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速11L/min。
红树莓中有机酸测定结果如下：
Figure BDA0002521257310000091
实施例3
1)用超纯水定容、配制浓度为5.0mg/mL的混合标准溶液，再分别稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的混合标准溶液，过0.22μm水系滤膜；
2)将不老莓室温下解冻2h，除去其中的树叶、木棍等杂质；
3)将步骤2)所得的不老莓使用匀浆机进行榨汁处理，并过100目纱布除去大颗粒皮渣；
4)将步骤3)所得的不老莓果汁在15000g条件下进行离心处理，取上层清液过0.22μm水系滤膜，作为有机酸测定的待测样品；
5)利用本发明方法分别测定步骤1)和步骤4)的混合标准溶液和待测样品，绘制各有机酸标准曲线，并记录样品的峰面积；
6)根据标准曲线和样品的峰面积，计算得到样品中各有机酸含量。
进一步地，步骤5)的测定进行3次重复测定，且所述的测定仪器条件和方法如下：
仪器条件：Agilent 1290UPLC液相色谱仪串联Agilent 6469QQQ质谱仪；
采集软件：Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition(versionsB.06.00)；
处理软件：Agilent MassHunter Qualitative Analysis(versions B.06.00)。
液相条件：色谱柱：Thermo AQUASIL C18 250mm×4.6μm；进样量：2μL；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇。梯度洗脱条件：0-5min：甲醇10％；5-16min：甲醇10％-100％；后运行2分钟。
质谱条件：采用多反应监测(MRM)，负离子扫描模式。干燥气温度325℃；干燥气流速7L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速11L/min。
不老莓中有机酸测定结果如下：
Figure BDA0002521257310000101
Figure BDA0002521257310000111
方法验证：
国标GB5009.157-2016《食品安全国家标准-食品中有机酸的测定》方法，规定了液体样品、半固体样品、固体样品以及特殊样品中有机酸含量的测定，其中有机酸包括酒石酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸和己二酸。因此，根据蓝莓果汁样品中包含的酒石酸、乳酸、苹果酸和柠檬酸，根据国标方法对本发明建立的有机酸含量测定的准确性进行了验证。实验采取的具体测定过程如下：
1.试剂条件：超纯水，甲醇和磷酸(Fisher Scientific试剂公司，色谱级)，酒石酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸标准品(Sigma-Aldrich试剂公司，纯度均≥98％)
2.溶液配制：(1)磷酸溶液(0.1％)：量取磷酸0.1mL，加水至100mL，混匀。(2)磷酸-甲醇溶液(2％)：量取磷酸2mL，加甲醇至100mL，混匀。(3)混合标准溶液配制：分别称取酒石酸1.25g、苹果酸2.5g、乳酸2.5g、柠檬酸2.5g(精确至0.01g)于50mL小烧杯中，加水溶解，用水转移到50mL容量瓶中，定容，混匀，于4℃保存，其中酒石酸质量浓度为25000μg/mL、苹果酸50000μg/mL、乳酸50000μg/mL、柠檬酸50000μg/mL。(4)混合标准曲线工作液的配制：:分别吸取(3)中配制的混合标准储备溶液0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL于25mL容量瓶中，用(1)的磷酸溶液定容至刻度，充分混匀，于4℃保存。
3.测定条件：CAPECELLPAK MGS5C18柱，4.6mm×250mm，5μm；Agilent 1290UPLC液相色谱仪(配备紫外检测器)；流动相用0.1％磷酸溶液-甲醇＝97.5+2.5(体积比)比例的流动相等度洗脱10min，然后用较短的时间梯度让甲醇相达到100％并平衡5min，再将流动相调整为0.1％磷酸溶液-甲醇＝97.5+2.5(体积比)的比例，平衡5min；柱温：40℃，进样量20μL，检测波长210nm。
4.样品处理：分别将蓝莓、红树莓和不老莓果汁在15000g条件下进行离心处理，取上层清液过0.22μm水系滤膜，作为有机酸测定的待测样品。
5.标准曲线的制作：将混合标准曲线工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰高或峰面积。以标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
6.样品测定：将处理好的待测果汁样品注入高效液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中有机酸的浓度，结果按μg/mL计。
7.测定结果
(1)标准曲线测定结果
Figure BDA0002521257310000121
根据国标方法，我们选取了与本发明相同的四种有机酸，分别是柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乳酸。通过比较两种方法的测定结果，我们发面，二者含量结果上下浮动均小于0.27％，因此，说明本发明所建立的有机酸测定方法，不仅能够实现浆果果汁中有机酸的快速检测，同时在含量测定结果上较为准确可靠。

Claims (7)

1.一种高效快速测定浆果果汁中有机酸含量的方法，其特征在于：包括下述工艺步骤：
配制浆果中常见的有机酸标准溶液，利用超高效液相色谱质谱联用仪建立测定有机酸标准品的方法条件；根据有机酸标准溶液的浓度和峰面积建立相应有机酸浓度-峰面积标准曲线；利用上述测定有机酸标准品的方法条件获得待测浆果果汁中各个有机酸的峰面积，通过有机酸浓度-峰面积标准曲线计算待测浆果果汁中各种有机酸的浓度，
其中，所述有机酸标准品为绿原酸、表儿茶素、丁香酸、奎宁酸、柠檬酸、莽草酸、没食子酸、2,4,6-三羟基苯甲醛、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸；
利用超高效液相色谱质谱联用仪建立测定有机酸标准品的方法条件如下：
液相条件：色谱柱：Thermo AQUASIL C18 250mm×4.6μm；进样量：2μL；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件：0-5min：甲醇10％；5-16min：甲醇10％-100％；后运行2min；
质谱条件：采用多反应监测，负离子扫描模式，干燥气温度325℃；干燥气流速7L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速11L/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机酸标准溶液按下述方法配置：用超纯水定容成为浓度5.0mg/mL的混合标准溶液，再分别稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的混合标准溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括验证建立的检测方法的重复性、回收率、精密度、定量限、检出限和校准曲线。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述定量限、检出限及校正曲线按下述方法验证：
将有机酸标准溶液分别用超纯水稀释到相应的浓度范围，其中，绿原酸10-6000ng/mL，表儿茶素5-200ng/mL，丁香酸20-6000ng/mL，奎宁酸5-80000ng/mL，柠檬酸10-80000ng/mL，莽草酸10-4000ng/mL，没食子酸5-2000ng/mL，2,4,6-三羟基苯甲醛10-200ng/mL，酒石酸5-4000ng/mL，苹果酸10-20000ng/mL，琥珀酸5-5000ng/mL，乳酸5-10000ng/mL，进行超高效液相色谱质谱联用分析，将浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标绘制校正曲线，得到相关系数r，从而判断线性关系；在信噪比为3和10时，对不同浓度的有机酸进行分析，并计算得到定量限和检测线。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述精密度按下述方法验证：
通过测定日内和日间的变化情况，评价所建立方法的精密度；相对标准差为变异值，具体操作为：将混合标准溶液，在同一天内连续5次测定浓度为0.5mg/mL的12种有机酸混合标准溶液的浓度，根据测定的含量差异来评价日内精密度，连续5天之间的含量差异用来评价日间精密度。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述精确度按下述方法验证：
通过回收实验计算回收率，对方法的准确性进行评价，体操作为：分别将不同浓度的12种有机酸标准溶液，分别是混合标准溶液相应浓度的0.5，1.0和2.0倍加入混合标准溶液中，测定每种有机酸标准品的回收率，并进行三次重复实验。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重现性和稳定性按下述方法验证：
测定混合标准溶液在4℃下2、4、8、24和48h的稳定性，将不同时间下的测定结果与初始结果进行比较；并对12种有机酸的重现性和稳定性进行相对标准差分析。
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